Profilage du pH luminal dans des organoïdes gastro-intestinaux tridimensionnels à l’aide de microélectrodes

Les organoïdes, c’est-à-dire des structures multicellulaires miniatures dérivées de cellules souches, ont révolutionné notre capacité à étudier la physiologie humaine et commencent à remplacer les modèles animaux, même dans les contextes réglementaires¹. Depuis la description initiale des organoïdes intestinaux par Sato et al. en 2009, la technologie des organoïdes est devenue immensément populaire². Un grand nombre d’études ont caractérisé en détail la composition cellulaire et la fonction de modèles d’organoïdes 3,4,5,6. Cependant, l’espace luminal de ces structures multicellulaires 3D reste largement indéfini ^7,8. La lumière est la cavité centrale des organoïdes dérivés des tissus muqueux qui est entourée par les parties apicales des cellules épithéliales polarisées. Étant donné que la sécrétion et l’absorption cellulaires se produisent principalement à la surface de l’épithélium apical, le microenvironnement luminal des organoïdes est contrôlé par ces processus physiologiques importants. Les modèles organoïdes actuellement utilisés montrent des variations dans les modèles de signalisation cellulaire, la souche globale, les gradients de concentration de métabolites et les conditions environnementales⁹. La compréhension de la physiologie luminale des organoïdes est donc nécessaire pour la modélisation précise de la fonction et de la pathologie des organes. Malheureusement, la relative inaccessibilité de la lumière entrave considérablement les analyses fonctionnelles de la physiologie luminale dans les organoïdes 3D¹⁰.

La capacité d’examiner les profils de pH est particulièrement importante dans l’estomac, qui est connu pour avoir le gradient de protons le plus raide dans le corps, allant d’environ 1-3 dans la lumière, à presque neutre à l’épithélium 11,12,13. Il reste une lacune importante dans notre compréhension du maintien à l’échelle microscopique du gradient de pH gastrique et de la pertinence des modèles organoïdes pour récapituler ce milieu dynamique à travers la couche de mucus gastrique. Les approches traditionnelles pour l’analyse du pH des organoïdes impliquent l’utilisation de colorants sensibles au pH, qui peuvent être des indicateurs fluorescents ou colorimétriques. McCracken et al. ont utilisé une injection luminale de SNARF-5F-un indicateur de pH ratiométrique dans des organoïdes pour analyser une baisse du pH luminal en réponse à un traitement à l’histamine. De tels colorants peuvent être incorporés dans le milieu de culture, ce qui permet une surveillance non invasive du pH en temps réel. Non seulement les colorants sensibles au pH nécessitent des étapes d’étalonnage complexes qui contribuent à une fiabilité et une précision médiocres des mesures, mais ces colorants ont également tendance à fonctionner dans des plages de détection spécifiques qui peuvent ne pas être représentatives de l’ensemble de la gamme de pH dans le microenvironnement d’intérêt^14,15. Il pourrait toutefois être considéré comme raisonnable d’utiliser des colorants indicateurs pour des expériences de confirmation. Des nanocapteurs optiques utilisant des approches de détection du pH basées sur l’optode fluorescent ont également été développés ; Cependant, ces techniques de détection nécessitent une imagerie microscopique et sont également sensibles au photoblanchiment, à la phototoxicité, ainsi qu’au biais d’imagerie^16,17. De plus, Brooks et al. ont des plaques multipuits imprimées en 3D contenant des microélectrodes sur lesquelles les organoïdes peuvent être plaqués¹⁸. Cependant, cette approche ne permet pas d’effectuer des mesures directement à l’intérieur de la lumière organoïde.

Les mesures du pH à l’aide d’électrodes peuvent atteindre une meilleure précision par rapport à d’autres méthodes, ainsi que fournir une surveillance du pH en temps réel. De plus, les électrodes de pH montées sur des micromanipulateurs permettent une résolution spatiale supérieure des mesures de pH, car l’emplacement précis de la pointe de l’électrode peut être contrôlé avec précision. Cela permet une flexibilité et une reproductibilité maximales dans les analyses de modèles d’organoïdes. Les électrodes utilisées ici sont des microélectrodes de pH miniaturisées qui fonctionnent sur la base de la diffusion de protons à travers du verre de pH sélectif qui entoure un mince fil de platine. La microélectrode est connectée à une électrode de référence Ag-AgCl externe, puis connectée à un millivoltmètre à haute impédance. Le potentiel électrique entre les deux pointes d’électrode lorsqu’elles sont immergées dans la même solution reflétera le pH de la solution¹⁹. De tels systèmes de microprofilage ont été utilisés dans l’analyse métabolique de biofilms^20,21, d’algues planctoniques²², d’échantillons d’expectorations humaines²³ et même de sphéroïdes de cellules souches mésenchymateuses²⁴. Notre laboratoire et Murphy et al. ont déjà utilisé des microélectrodes O₂ contrôlées par des micromanipulateurs pour évaluer les concentrations d’oxygène dans les espaces luminaux des organoïdes. Murphy et al. ont associé cette méthode à une modélisation mathématique pour révéler un gradient d’oxygène dans leurs sphéroïdes. Notre groupe a pu trouver des niveaux d’oxygène luminal réduits dans les organoïdes gastriques dérivés des tissus par rapport à la matrice extracellulaire^{environnante 25}.

Ici, nous fournissons une méthode détaillée pour le profilage manuel des microélectrodes du pH luminal dans les organoïdes sphériques du tractus gastro-intestinal qui permettra une meilleure compréhension physiologique de leur microenvironnement luminal complexe. Nous prévoyons que cette technique ajoutera une nouvelle dimension à l’exploration de la physiologie des organoïdes grâce à des mesures en temps réel et à haute résolution des niveaux de pH à l’échelle microscopique. De plus, le protocole suivant pourrait être facilement adapté pour l’analyse de O₂, N₂O, H₂, NO, H₂S, redox et de la température dans divers types de modèles d’organoïdes. Le profilage physiologique est un outil précieux pour optimiser les conditions de culture d’organoïdes afin de mieux imiter les environnements in vivo , renforçant ainsi la pertinence et l’utilité des modèles d’organoïdes dans la recherche biomédicale.