Ici, nous présentons une technique simple pour évaluer la résistance aux antimicrobiens environnementaux (RAM) en augmentant la proportion d’ADN extracellulaire de faible poids moléculaire. Un traitement antérieur avec 20 à 30 % de PEG et 1,2 M de NaCl permet de détecter à la fois les gènes génomiques et les gènes AMR transférés horizontalement. Le protocole se prête à un processus sans kit avec une optimisation supplémentaire.
La surveillance environnementale est reconnue comme un outil important pour évaluer la santé publique dans l’ère post-pandémique. L’eau, en particulier les eaux usées, est devenue la source de choix pour échantillonner les charges d’agents pathogènes dans l’environnement. Les eaux usées provenant des drains à ciel ouvert et des usines de traitement de l’eau des collectivités sont un réservoir d’agents pathogènes et de gènes de résistance aux antimicrobiens (RAM), et entrent fréquemment en contact avec les humains. Bien qu’il existe de nombreuses méthodes pour suivre la résistance aux antimicrobiens dans l’eau, l’isolement d’ADN de bonne qualité à haut rendement à partir d’échantillons hétérogènes reste un défi. Pour compenser, les volumes d’échantillons doivent souvent être élevés, ce qui crée des contraintes pratiques. De plus, l’ADN environnemental est fréquemment fragmenté et les sources de RAM (plasmides, phages, ADN linéaire) sont constituées d’ADN de faible poids moléculaire. Pourtant, peu de procédés d’extraction se sont concentrés sur des méthodes d’extraction à haut rendement d’ADN linéaire et de faible poids moléculaire. Ici, une méthode simple d’extraction linéaire d’ADN à haut rendement à partir de petits volumes d’eaux usées en utilisant les propriétés de précipitation du polyéthylène glycol (PEG) est présentée. Cette étude plaide en faveur de l’augmentation des rendements globaux en ADN à partir d’échantillons d’eau collectés pour des analyses métagénomiques en enrichissant la proportion d’ADN linéaire. De plus, l’amélioration de l’ADN de faible poids moléculaire permet de surmonter le problème actuel du sous-échantillonnage de la résistance aux antimicrobiens dans l’environnement en raison de l’accent mis sur l’ADN de haut poids moléculaire et intracellulaire. Cette méthode devrait être particulièrement utile lorsque l’ADN extracellulaire existe, mais à de faibles concentrations, comme dans le cas des effluents des usines de traitement. Il devrait également améliorer l’échantillonnage environnemental des fragments de gènes de la résistance aux antimicrobiens qui se propagent par transfert horizontal de gènes.
Le SRAS-CoV-2 et ses conséquences ont souligné l’importance de la surveillance environnementale dans le suivi et la prévision des épidémies de maladies infectieuses 1,2. Bien que les pandémies virales soient apparentes, l’augmentation de la résistance aux antimicrobiens (RAM) est souvent décrite comme une pandémie insidieuse qui constitue un problème de santé publique majeur dans le monde 3,4. Par conséquent, il est urgent d’élaborer des stratégies coordonnées pour comprendre l’évolution et la propagation de la RAM. Les plans d’eau, ainsi que les eaux usées, peuvent servir de réservoirs pour les agents pathogènes et les RAM5, 6, 7 et 8. Les sources d’eau partagées sont donc une source puissante de transmission de maladies parmi les humains, en particulier dans les pays à revenu faible et intermédiaire (PRFI) où le manque d’hygiène et la surpopulation vont de pair 9,10,11. L’analyse des sources d’eau est utilisée depuis longtemps pour évaluer la santé communautaire 12,13,14. Récemment, les eaux usées des stations d’épuration urbaines se sont avérées être un bon indicateur précoce des cas de COVID dans les cliniques 1,2,15,16,17,18.
Par rapport à la surveillance de maladies spécifiques, la détection et le suivi de la résistance aux antimicrobiens dans l’environnement posent un problème plus complexe. Le grand nombre d’antibiotiques utilisés, la diversité des gènes de résistance, les différentes pressions de sélection locale et le transfert horizontal de gènes entre les bactéries rendent difficile l’évaluation de la charge réelle de la résistance aux antimicrobiens et, une fois évaluée, sa corrélation avec les observations cliniques 19,20,21,22. Par conséquent, alors que la surveillance concertée de la résistance aux antimicrobiens clinique est menée par plusieurs organisations à travers le monde 3,23,24, la surveillance environnementale de la résistance aux antimicrobiens n’en est qu’à ses balbutiements, comme en témoigne 19,25,26.
Au cours des dernières années, différentes méthodes de suivi de la résistance aux antimicrobiens dans l’environnement ont été signalées 5,27, examinées dans28,29. Le point de départ de la plupart d’entre eux est l’extraction d’ADN de bonne qualité à partir d’échantillons environnementaux hétérogènes, ce qui constitue en soi un défi. De plus, l’ADN environnemental est généralement fragmenté en raison de l’exposition à un environnement hostile. L’ADN extracellulaire fragmenté est depuis longtemps reconnu comme un réservoir important de gènes AMR (examiné dans30, 31 et 32), avec le potentiel supplémentaire d’entrer et de sortir des bactéries par transfert horizontal de gènes. Par conséquent, il est important que tout protocole visant à mesurer la charge de résistance aux antimicrobiens dans l’environnement échantillonne le mieux possible l’ADN linéaire et de faible poids moléculaire. Étonnamment, peu d’attention a été accordée au développement de méthodes spécifiques à l’extraction à haut rendement d’ADN linéaire et de faible poids moléculaire : ce travail se concentre sur la résolution de cette lacune.
Une méthode simple et courante pour précipiter l’ADN consiste à combiner du polyéthylène glycol (PEG) et des sels tels que le chlorure de sodium (NaCl)33. Le PEG est un agent d’encombrement macromoléculaire utilisé pour obtenir une précipitation spécifique à la taille des fragments d’ADN34,35. Plus la concentration de PEG est faible, plus le poids moléculaire de l’ADN qui peut être précipité efficacement est élevé. De nombreuses études ont utilisé le PEG lors de l’extraction environnementale de l’ADN et de l’ARN 1,2 (résumés dans le tableau 1 17,33,36,37,38,39) soit à l’étape finale 33,36,37, soit pour concentrer de grands échantillons d’eau pour l’extraction de particules virales comme avec le SARS-CoV-2 15,40. Dans les travaux actuels, on constate que les concentrations de PEG utilisées précédemment pour les extractions d’ADN environnemental (largement déterminées par les protocoles de surveillance virale) ne capturent pas l’ADN linéaire de faible poids moléculaire. Par conséquent, ils ne permettent pas d’échantillonner de courts fragments d’ADN et ne conviennent pas à l’évaluation précise du contenu en RAM. Cette étude a exploité les propriétés du polyéthylène glycol et du chlorure de sodium pour précipiter efficacement des fragments d’ADN linéaires de faible poids moléculaire à un rendement élevé qui peut, à l’avenir, conduire à une méthode d’extraction d’ADN rentable. Cette méthode peut être utilisée pour enrichir la proportion d’ADN fragmenté et de faible poids moléculaire à partir d’échantillons naturels complexes, capturant ainsi une image plus précise de la RAM environnementale. Avec un peu plus de raffinement, la technique se prête à une application facile et peu coûteuse par les sociétés municipales locales et d’autres organismes gouvernementaux pour être utilisée comme outil de surveillance avec une formation technique minimale.
La résistance aux antimicrobiens est l’une des 10 principales menaces pour la santé aujourd’hui, selon l’OMS, et la surveillance environnementale de la résistance aux antimicrobiens est reconnue comme un outil important dans le monde entier. Comme nous l’avons mentionné dans l’introduction, un registre complet de la résistance aux antimicrobiens dans l’environnement comprend de l’ADN de faible poids moléculaire, fragmenté et extracellulaire. Le protocole de prétraitement rapporté ici, utilisant une…
The authors have nothing to disclose.
Nous reconnaissons le soutien financier de la Fondation Rockefeller (numéro de subvention de la Fondation Rockefeller 2021 HTH 018) dans le cadre de l’équipe APSI India (Alliance for Pathogen Surveillance Innovations https://data.ccmb.res.in/apsi/team/). Nous reconnaissons également l’aide financière fournie par Axis Bank pour soutenir cette recherche et par la Trivedi School of Biosciences de l’Université Ashoka pour l’équipement et d’autres soutiens.
24-seat microcentrifuge | Eppendorf Centrifuge 5425 R | EP5406000046 | |
Absolute Ethanol (Emsure ACS, ISO, Reag. Ph Eur Ethanol absolute for analysis) | Supelco | 100983-0511 | |
Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
Bench top refrigerated centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5920 R | EP5948000131 | |
ChemiDoc Imaging System | BioRad | 12003153 | |
DNeasy PowerSoil Pro Kit | Qiagen | 47014 | |
DNeasy PowerWater Pro Kit | Qiagen | 14900-100-NF | |
dNTPs (dNTP Mix 10mM Each,0.2 mL, R0191) | Thermo Fisher | R0191 | |
DreamTaq DNA Polymerase, 5 U/µL + 10x DreamTaq Buffer* | Thermofscientific | EP0702 | |
E-Gel 1 Kb Plus Express DNA Ladder | Invitrogen | 10488091 | |
Maxiamp PCR tubes 0.2 mL | Tarsons | 510051 | |
Molecular Biology Grade Water for PCR | HiMedia | ML065-1.5ML | |
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | 13400519 | |
Parafilm | Bemis | S37440 | |
PEG-8000 | SRL | 54866 | |
QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit | Qiagen | 28506 | |
Qubit 4 Fluorometer (with WiFi) | Thermofisher | Q33238 | |
Qubit Assay Tubes | Thermofisher | Q32856 | |
Qubitt reagent kit for ds DNA, broad range | Thermo Scientific | Q32853 (500 assays) | |
Sodium Chloride | HiMedia | TC046M-500G | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
Thermo Cycler (ProFlex 3 x 32-well PCR System) | Applied Biosystems | 4484073 | |
Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 |