JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin Buffy Coats'tan Yüksek Verimli İmmünomanyetik Boncuk Ayırma ile İzole Edilmesi

Published: July 19, 2024
doi:
10.3791/66887
, , ,
1New South Wales Health Statewide Biobank,New South Wales Health Pathology

Summary

Bu protokol, biyobankacılık ve diğer amaçlar için insan periferik kan mononükleer hücrelerini izole etmek için yüksek verimli otomasyonla uyumlu bir yöntemi detaylandırır.

Abstract

Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC’ler), monosit ve lenfositlerin heterojen bir popülasyonudur. Dondurularak saklanmış PBMC’ler, uzun süreli depolamada stabil canlılığa sahiptir, bu da onları akış sitometrisi, immünolojik testler ve genom dizilimi dahil olmak üzere birçok aşağı akış araştırma amacı için ideal bir hücre tipi haline getirir. Tipik olarak, PBMC’ler yoğunluk gradyan santrifüjleme yoluyla izole edilir, ancak bu, ölçeklendirilmesi zor ve maliyetli olan düşük verimli bir iş akışıdır. Bu makalede, uygulanması hızlı olan manyetik boncuk tabanlı bir PBMC izolasyon yöntemi kullanan yüksek aktarım hızına sahip bir iş akışı sunulmaktadır. Yoğunluk gradyan izolasyonu kullanılarak elde edilen PBMC’lerle toplam hücre konsantrasyonu, canlılığı ve popülasyon dağılımı karşılaştırıldı ve hücre canlılığı ve hücre tiplerinin oranı her iki teknik için karşılaştırılabilirdi. İzole PBMC’ler, kan alımından 9 gün sonrasına kadar %70’in üzerinde canlılık gösterdi, ancak verim, alımdan sonraki 24 saat içinde işlenen PBMC’lere kıyasla 5 gün sonra yarı yarıya azaldı. Özetle, bu makalede, yüksek aktarım hızına uyum sağlamak için boncuk tabanlı bir yaklaşım kullanan bir PBMC protokolü açıklanmakta ve hem manuel hem de otomatik boncuk tabanlı yöntemlerin işleme kapasitesini artırabileceği ve çeşitli bütçeler için esneklik sağlayabileceği gösterilmektedir.

Introduction

Periferik kan mononükleer hücre (PBMC) izolasyonu, lenfositleri ve monositleri diğer tam kan bileşenlerinden ayıran ve izole eden bir tekniktir. PBMC’ler, immünoterapi, aşı geliştirme, hedef veya biyobelirteç tanımlama ve antikor/küçük moleküllü ilaç geliştirmedahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çok sayıda uygulama için kullanılan çok yönlü bir hücre tipidir 1,2. Bu hücreler sağlıklı veya hastalıklı bireylerden izole edilebilir ve sonraki süreçlerde hemen kullanılabilir veya gelecekteki araştırmalar için dondurularak saklanabilir3. Bazı durumlarda, aşağı akış amacı bilinirken, diğerlerinde, biyobankacılıkta yaygın olduğu gibi, PBMC’ler izole edilir ve gelecekteki belirtilmemiş uygulamalar için saklanır4.

Yoğunluk gradyanlı santrifüjleme, santrifüjleme sırasında hücre yoğunluğuna bağlı olarak kurucu hücre tiplerinin diferansiyel ayrımını kullanarak, PBMC’leri 5,6,7’yi tam kandan izole etmek için geleneksel tekniktir. Bu yöntemde bazı farklılıklar olsa da, tam kan genellikle fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltilir, özel veya standart bir santrifüj tüpünde bir yoğunluk gradyan ortamı üzerine katmanlanır ve daha sonra döndürülür. Dört farklı katman ortaya çıkar: üst plazma tabakası trombositlerle zenginleştirilir, ince bir PBMC tabakası yoğunluk gradyan ortamının üzerindedir ve son olarak alt tabaka kırmızı kan hücreleri (RBC’ler) ve granülositlerden oluşur. Bu yöntem daha önce ‘altın standart’8 olarak adlandırılmış olsa da, ölçek büyütme için uzun işlem süresi, santrifüj kapasitesi, diğer kan ürünlerinin (yani plazma ve eritrositler) ayrıştırılmasında zorluk ve otomatikleştirilmesinin zahmetli olması gibi sınırlamalar vardır. Bu yöntem9 için otomasyon mümkün olsa da, bir sıvı işleyicinin kapsamlı bir şekilde programlanmasını gerektirir (tam otomatik olacak bir santrifüj modülü ile) ve uzun bir süreç olarak kalacaktır.

Bundan böyle, manuel işleme için sekiz tutuculu bir mıknatıs veya tam otomatik işleme için bir cihaz ile immünomanyetik boncuk ayırma kullanan alternatif bir iş akışı sunulmaktadır. Bu yöntem, hücrelere eklenen ve istenmeyen hücre popülasyonlarını, bu durumda trombositleri, granülositleri ve RBC’leri bağlayan bir antikor kokteyli kullanır. Bu istenmeyen popülasyonlar daha sonra manyetik ayırma ile uzaklaştırılır ve monosit ve lenfosit popülasyonları, aşağı akış işlemine hazır olan negatif fraksiyonda bırakılır10. Bu negatif seçim yöntemi, antikor ve manyetik boncuk kompleksini PBMC’lerden çıkarmak için ek adımlar gerektiren pozitif seçim yöntemlerinden daha hızlıdır. Negatif seçim, hücre işlevselliğini korumanın bir yolu olarak tanımlandığı için ayrıca avantajlıdır11,12.

Protocol

Kalite kontrol kan örnekleri ve kurum içi oluşturulan veriler (hücre sayısı, canlılık ve numunenin işleme sırasındaki yaşı gibi) NSW Health Statewide Biobank, Royal Prince Alfred Hastanesi’ndeki rıza gösterilmiş araştırma çalışmalarından elde edildi (HREC onayı: 2019/ETH06776). İşlenmiş (yani plazma tükenmiş), taranmamış ve tanımlanmamış yetişkin insan kan örnekleri EDTA tüplerinde toplandı. Bu kalite kontrol kan örnekleri, toplandıktan sonra 72 saatten daha kısa bir süre içinde işlendi ve yoğunluk gradyanı ile boncuk bazlı yöntemleri karşılaştıran PBMC izolasyon deneyleri için kullanıldı. Temsili sonuçlarda kullanılan yoğunluk gradyanı ayırma yöntemi için Ek Dosya 1’deki prosedüre bakın. Bu çalışma için kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir. 1. Tam kan hazırlama 10 mL tam kan tüplerini (etilendiamintetraasetik asit [EDTA], asit-sitrat-dekstroz [ACD] veya lityum heparin ile kaplanmış) oda sıcaklığında 10 kez nazikçe ters çevirin. İsteğe bağlı: Tam kan saklanacaksa, -80 ° C’de saklama için kriyotüplere alın. Tüpleri, fren AÇIK durumdayken (800 hızlanma / 22 yavaşlama) 22 °C’de 10 dakika boyunca sallanan bir kova rotoru kullanarak santrifüjleyin. 2. Buffy ceket koleksiyonu Santrifüjlemeden sonra, numuneleri bir biyolojik güvenlik kabinine yerleştirin ve üç farklı katmanı kontrol edin ( Şekil 1’de gösterildiği gibi).NOT: RBC’ler, santrifüj tüpünün alt koyu kırmızı tabakasında bulunur. Beyaz kan hücreleri ve trombositler içeren beyaz opak bir tabaka, buffy coat olarak bilinen RBC tabakasının üzerinde bulunur. Üstteki sarı tabaka plazma içerir. İsteğe bağlı: Plazma saklanacaksa, -80 °C depolama için plazmayı kriyotüplere alın. 10 mL’lik bir kan tüpünden 1 mL buffy coat (başlangıç materyali) pipetleyin ve manuel ve otomatik yöntemler için sırasıyla adım 3.1 ve adım 4.1’de belirtilen ve etiketlenen tüpe aktarın. Pipet ucunu kullanarak buffy ceketi (beyaz opak tabaka) döndürün ve aspire ederek buffy ceketi toplayın.NOT: Aspirasyon sırasında 100 μL’den az plazma ve RBC kabul edilebilir. Bir katılımcı için birden fazla kan tüpü toplanırsa, buffy paltolar bir araya getirilebilir; Bununla birlikte, bu trombosit konsantrasyonunuetkileyebilir 13. Manuel işleme için bölüm 3’e geçin. Otomatik işleme için bölüm 4’e geçin. İsteğe bağlı: RBC’ler depolanacaksa, RBC’leri -80 °C depolama için kriyotüplere ayırın. 3. PBMC arıtma – Manuel yöntem NOT: Mıknatıs tutucu başına en fazla 8 numune tek bir operatör tarafından işlenebilir. 3 x 5 mL polistiren tüpleri AC harfleriyle etiketleyin.NOT: Birden fazla örnek gerçekleştiriyorsanız sıralı numaralandırma kullanın, yani 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C. 60 μL 0.1 M EDTA (6 mM’lik nihai EDTA konsantrasyonu için, pH 8.0, tarif için Ek Dosya 2’ye bakınız) adım 2.3’te aktarılan buffy kaplamayı içeren tüp A’ya ekleyin. Tüp A’ya 50 μL kokteyl karışım tüpü ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin, en az 3 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Tüp A’ya 890 μL PBS ekleyin ve en az 3 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Manyetik boncuk tüpünü 30 saniye boyunca vorteksleyin (Malzeme Tablosuna bakın). Tüp A’ya 50 μL manyetik boncuk ekleyin ve en az 3 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Tüp A’yı hemen mıknatıs standına yerleştirin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Zenginleştirilmiş hücre süspansiyonunu dikkatlice tüp B’ye pipetleyin ve optimum PBMC geri kazanımı için berrak fraksiyonu hiç veya minimum (<100 μL) RBC ile toplayın.NOT: Mıknatısa bağlı boncukları rahatsız etmeyin. Bir transfer pipeti önerilir. Tüp A’yı mıknatıs standından çıkarın ve atın. B tüpündeki hücre süspansiyonuna 50 μL manyetik boncuk ekleyin ve en az 3 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. B tüpünü hemen mıknatıs standına yerleştirin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Zenginleştirilmiş hücre süspansiyonunu dikkatlice tüp C’ye pipetleyin ve sadece berrak kısmı toplayın.NOT: Mıknatısa bağlı boncukları rahatsız etmeyin. Bir transfer pipeti önerilir. B tüpünü mıknatıs standından çıkarın ve atın. C tüpünü hemen mıknatıs standına yerleştirin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Zenginleştirilmiş hücre süspansiyonunu etiketli bir santrifüj tüpüne dikkatlice pipetleyin ve PBS ile 2 mL’ye kadar doldurun. 50 μL hücre süspansiyonunu otomatik hücre sayacının bir numune kabına aktarın. 1:10 seyreltme hücresi sayımı için 450 μL PBS ekleyin. Hücre sayma adımları için 5. bölüme geçin. 4. PBMC arıtma – Otomatik yöntem NOT: Tek bir otomatik PBMC cihazı tarafından en fazla 4 numune işlenebilir. Birden fazla cihaz tek bir operatör tarafından paralel olarak çalıştırılabilir. 2 x 14 mL tüpü A ve B harfleriyle, 1 x 50 mL santrifüj tüpünü C harfiyle ve 1 x 50 mL santrifüj tüpünü “atık” ile etiketleyin.NOT: Otomatik PBMC cihazında yapılan her çalıştırma için yalnızca bir atık kabı gereklidir. Birden fazla örnek gerçekleştiriyorsanız sıralı numaralandırma kullanın, yani 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C. Adım 2.3’te aktarılan buffy kaplamayı içeren tüp A’ya 60 μL 0.1 M EDTA (6 mM’lik son EDTA konsantrasyonu için) ekleyin. Manyetik boncuk tüpünü 30 saniye boyunca vorteksleyin (Malzeme Tablosuna  bakın). Cihazın ön tarafındaki gücü açarak otomatik PBMC cihazını açın. Otomatik PBMC cihazı ana ekranında’yı seçinfile’yi seçin ve istediğiniz protokolü seçin.NOT: EasySep Doğrudan İnsan PBMC izolasyonu 19654 – buffy coat bu PBMC izolasyonu için seçilen protokol profiliydi. Protokol raporu14’teki bu profil için üreticinin standart prosedürüne bakın. Başlangıç hacmini (tüp A’ya aspire edilen buffy coat miktarı) girin ve her numune için tekrarlayın. Aynı reaktif kitini kullanacak tüm kadranları seçin.NOT: Aynı protokol birden fazla kadran için kullanılıyorsa, otomatik PBMC cihazı tüm kadranlar14 için aynı reaktif kitinin kullanılmasını önerecektir. Cihazın karuseline etiketli sarf malzemeleri, filtre uçları ve tampon kabı yükleyin. Manyetik boncuk tüpü ve kokteyl karışım tüpünü içeren reaktif kiti kadran 1’e yüklenecektir.NOT: Cihaz, kullanıcının tüm kadranlar için 1 reaktif kiti kullanmak isteyip istemediğini soracaktır. ‘Evet’i seçin ve reaktif kitini kullanarak tüm kadranları vurgulayın. Yükleme tamamlandıktan sonra, sarf malzemelerinden ve reaktiflerden kapakları çıkarın ve cihaz ekranında çalıştır öğesini seçin. Çalışma tamamlandığında, boşaltın’ı seçin ve çıkarınamples (C tüpünde etiketlenmiş PBMC süspansiyonu içeren) cihazın karuselinden. Manyetik boncuk tüpünü, kokteyl karışım tüpünü ve tampon kabını 4 °C’de saklayın. A, B olarak etiketlenmiş tüpleri ve atıkları (bkz. adım 4.1) ve filtre uçlarını atın.NOT: PBMC süspansiyonu 7 mL’lik bir nihai hacim ürettiğinden, otomatik yöntem için PBS ile doldurma gerekli değildir. Seyreltilmeyen hücre sayımı için 500 μL hücreyi bir numune kabına aktarın. Hücre sayımı için 5. bölüme geçin. 5. Hücre sayımı Üreticinin talimatlarını15 izleyerek tripan mavisi boya dışlama yöntemini kullanarak hücre sayımı ve canlılığı gerçekleştirin.NOT: Yazarın dahili süreçleri için, PBMC’leri almak için aşağıdaki ayarlara sahip otomatik bir hücre sayacı kullanılarak hücre analizi gerçekleştirilir.Seyreltme faktörü = 10 (manuel protokol için, hücre süspansiyonu düşük hacimdeyse) veya 1 (otomatik protokol için)Hücre tipi: PBMCKonsantrasyon aralığı = 5 x 104 ila 1 x 107 hücre / mLBoyut aralığı (çap) = 8 μm ila 50 μmGörüntü Sayısı = 50 6. Kriyoprezervasyon hazırlığı Numune tüplerini 300 x g’da 22 ° C’de 8 dakika boyunca fren AÇIK (9 hızlanma / 9 yavaşlama) santrifüjleyin (sallanan bir kova rotoru kullanarak). Santrifüjlemeden sonra numuneleri biyolojik güvenlik kabinine geri koyun. Bir pipet kullanarak, süpernatanı dikkatlice çıkarın. Rahatsız edilmemesini sağlamak için PBMC peletiyle birlikte az miktarda süpernatan bırakılabilir. Peleti 3 mL soğuk kriyoprezervasyon ortamında yeniden süspanse edin. Süspansiyonu homojen olana kadar yavaş ve nazikçe yukarı ve aşağı karıştırın.NOT: Kristal oprezervasyon ortamının hacmi, istenen nihai PBMC konsantrasyonuna göre ayarlanabilir. Yeniden süspanse edilmiş PBMC’nin 1 mL’sini önceden atanmış bir kriyotüpe dağıtın ve -80 ° C’de en az 4 saat boyunca bir kontrol hızı dondurma kabına yerleştirin.NOT: Her bir kriyotüpe aktarılan PBMC’lerin hacmi, araştırmacının tercihine göre ayarlanabilir. Kriyotüpleri -80 °C’de en az 4 saat sakladıktan sonra, kriyotüpleri uzun süreli depolama için sıvı nitrojen buharı faz tankına aktarın. 7. İstatistiksel veri analizi Temsili sonuç verileri, Ek Dosya 3’te belirtildiği gibi istatistiksel ve grafik yazılımları kullanılarak analiz edildi.

Representative Results

Lenfositlerin, monositlerin, nötrofillerin, eozinofillerin ve bazofillerin oranları, PBMC’ler boncuk bazlı veya yoğunluk gradyan ayırma yöntemi kullanılarak izole edildiğinde PBMC izolasyonu öncesi (yani tam kanda) ve sonrası ölçüldü. Lenfosit ve monosit oranları her iki yöntemle de anlamlı olarak zenginleştirildi (Şekil 2A,B). Ek olarak, nötrofillerin, eozinofillerin ve bazofillerin (yani granülositler) oranları, boncuk bazlı yöntemle izole edilen PBMC’lerde önemli ölçüde azalmıştır (Şekil 2C-F). Lenfosit, monosit, nötrofil, eozinofil, bazofil ve granülosit oranlarında yoğunluk gradyanı ve boncuk bazlı yöntemler arasında anlamlı bir fark yoktu (Şekil 2). Yukarıda listelenen hücre tipleri için geri kazanım yüzdesi ek olarak hesaplanmıştır (bkz. Ek Şekil 1). Her iki yöntem için de ortalama hücre canlılıkları ‘in üzerindeydi ve önemli ölçüde farklı değildi (Şekil 3A). PBMC’ler ayrıca 8 μm ila 50 μm arasında bir boyut aralığı (çap) kullanılarak sayıldı, burada yoğunluk gradyan ayırma yöntemi yaklaşık iki kat daha yüksek toplam hücre sayısı üretti (Şekil 3B). Daha sonra, otomatik boncuk tabanlı yöntem, manuel yöntemle karşılaştırıldı. Manuel veya otomatik yöntem kullanılarak hücre canlılığı (Şekil 4A) veya toplam hücre sayısı (Şekil 4B) için önemli bir fark tespit edilmedi. Bu 8 numuneyi işleme süresi, insan müdahalesi gerektirmeyen eller serbest kalma süresi de dahil olmak üzere karşılaştırıldı. 8 numunenin toplam işlem süresi 43 dakika idi. Kılavuz için 57 dk vs. otomatik yöntem. Otomatik yöntem, 35 dakikalık eller serbest işlemeyi içeriyordu (Şekil 4C). PBMC izolasyonunun boncuk tabanlı iş akışı (tam kan ve plazma alikotasyonu ile) 9 ay boyunca pilot olarak uygulandı, bu sayede 1410 PBMC numunesi, ilk 820 katılımcı için manuel platform kullanılarak taranmamış insan kanından izole edildi ve ardından sonraki 590 katılımcı için otomatik yöntem kullanıldı. İşleme, çalışma kabul kriterlerine göre aynı gün veya toplandıktan sonra 10 güne kadar gerçekleştirildi ve işlemedeki gecikmeler büyük ölçüde numune geçiş süreleri nedeniyle gerçekleşti. Manuel veya otomatik yöntemle, toplamadan sonraki 24 saat içinde işlenen PBMC’ler en yüksek canlılığa ve geri kazanıma sahipti (Şekil 5). Ortalama hücre canlılığı, 5 gün içinde işlenen PBMC’ler için %>90 ve 10 gün içinde işlenen PBMC’ler için %>70 idi (Şekil 5A). Ortalama PBMC verimleri, 24 saat içinde işlenen numunelere kıyasla 5 gün sonra azalmıştır (Şekil 5B). Şekil 1: Buffy coat’tan boncuk tabanlı PBMC izolasyon protokolünün şematik iş akışı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Yoğunluk gradyanı ve boncuk bazlı yöntemlerle tam kan PBMC öncesi ve sonrası izolasyonda lenfositlerin, monositlerin, nötrofillerin, eozinofillerin, bazofillerin ve granülositlerin oranları. Lenfositlerin yüzdesi (A), monositler (B), nötrofiller (C), eozinofiller (D), bazofiller (E) ve granülositler (F) eşleşen tam kan PBMC öncesi izolasyonda (kareler) ve PBMC’lerde yoğunluk gradyanı (açık daireler) veya boncuk bazlı (kapalı daireler) yöntemi (n = 8) ile izolasyon sonrası. ns = anlamlı değil ve *p Tek Yönlü ANOVA (A ve B) veya Friedman testi (C- ile belirlendiği gibi 0.05 <. F). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Yoğunluk gradyanı ve boncuk tabanlı yöntemlerle izole edilen PBMC’nin canlılığı ve toplam hücre sayısı. (A) Yoğunluk gradyanı (kareler, koyu çubuk) kullanılarak işlenen numuneler için ortalama (± SD) hücre canlılığı vs. 8 eşleştirilmiş numune için boncuk tabanlı (daireler, açık çubuk) yöntemler. ns = eşleştirilmiş t-testi ile anlamlı değil. (B) Yoğunluk gradyanı (kareler, koyu çubuk) kullanılarak işlenen numuneler için toplam hücre sayısı vs. 8 eşleştirilmiş numune için boncuk tabanlı (daireler, açık çubuk) yöntemler. *P < 0.05, eşleştirilmiş bir t-testi kullanılarak belirlenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Manuel ve otomatik boncuk tabanlı yöntemlerin karşılaştırılması. (A) Manuel (kareler, koyu çubuk) kullanılarak işlenen numuneler için ortalama (± SD) hücre canlılığı vs. 8 eşleştirilmiş numune için otomatik (daireler, açık çubuk) boncuk tabanlı yöntemler. ns = Mann-Whitney testi ile anlamlı değil. (B) Manuel (kareler) kullanılarak işlenen numuneler için toplam hücre sayısı vs. 8 eşleştirilmiş numune için otomatik (daireler) boncuk tabanlı yöntemler. ns = eşleştirilmiş t-testi ile anlamlı değil. (C) Manuel kullanılarak işlenen 8 numune için işlem süresi vs. Uygulamalı (açık çubuk) ve uygulamalı serbest zaman dilimleri (koyu çubuk) dahil olmak üzere otomatik yöntemler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: Numune toplama ile PBMC depolama arasındaki süreye göre manuel olarak veya otomasyon kullanılarak boncuk bazlı yöntemden izole edilen PBMC’nin canlılığı ve verimi. (A) Manuel (koyu çubuk) kullanılarak işlenen katılımcı numuneler için ortalama (± CI) hücre canlılığı vs. Otomatik (açık çubuk) boncuk tabanlı yöntemler. Katılımcı numaralarını detaylandıran tablo. ns = önemli değil. NA = Uygulanamaz. *p < Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile 0.05'tir. (B) Manuel (koyu çubuk) kullanılarak işlenen katılımcı numuneler için toplam hücre sayısı vs. Otomatik (açık çubuk) boncuk tabanlı yöntemler. Katılımcı numaralarını detaylandıran tablo. ns = önemli değil. NA = Uygulanamaz. *p < Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile 0.05. Çoğaltma numarasının 3'ten küçük olması nedeniyle Otomatik Gün 10 için değer yok. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Ek Şekil 1: Yoğunluk gradyanı ve boncuk tabanlı yöntemlerle diferansiyel hücre yüzdesi geri kazanımı rakamı. Yüzde, tam kanda mutlak hücre sayımı öncesi izolasyon ve yoğunluk gradyan yöntemi (kareler, koyu çubuk) ve boncuk bazlı yöntem (daireler, açık çubuk) kullanılarak izolasyon sonrası hücre süspansiyonu kullanılarak hesaplandı (n = 8). ns = anlamlı değil ve *p < eşleşmemiş t-testi ile belirlendiği gibi 0.05. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 1: Yoğunluk gradyan protokolü. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek dosya 2: PBS’de 0.1 m EDTA, pH 8.0 hazırlanması. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 3: Temsili verileri oluşturmak için gerçekleştirilen ayrıntılı prosedürler. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

İnsan PBMC’leri, çok sayıda tahlil için kullanılan çok yönlü hücre tipleridir; Bununla birlikte, biyobankalar da dahil olmak üzere birçok laboratuvarda izolasyon verimi genellikle bir sınırlamadır16. Daha önce, NSW Sağlık Eyalet Çapında Biyobanka, yoğunluk gradyanı yöntemini kullanarak PBMC’leri izole etti. İşleme kapasitesini artırmak için yoğunluk gradyan ayırma yöntemi için otomasyon araştırıldı, ancak (i) steril bir ürün üretmek için bir HEPA ünitesinin ek gerekliliği ile tam otomatik olacak bir santrifüj ünitesine sahip bir sıvı işleyicinin maliyeti, (ii) programlama için eğitimli personel ve (iii) protokol testi için gereken süre dahil olmak üzere uygulamanın önündeki engeller belirlendi. Bu nedenle, bu çalışma alternatif yöntemleri araştırdı ve manuel ve otomatik işleme için kullanılabilecek ticari olarak elde edilen İnsan PBMC kitini belirledi. İşleme için gerekli ekipman standart (1,2 m uzunluğunda) bir biyolojik güvenlik kabinine sığdığı için sterilite sağlanır. Bu belge, kaliteden ödün vermeden verimliliği artırmak ve reaktif maliyetlerini düşürmek için üreticinin önerdiği protokol14’te yapılan değişiklikleri detaylandırmaktadır. Ek olarak, üreticinin protokolü, tam kan (adım 1.2), plazma (adım 2.2) ve orijinal kan tüpünden alıntı yapan RBC (adım 2.5) dahil olmak üzere gelecekteki araştırmalar için biyobanka örneklerine yönelik adımları detaylandırmak için genişletildi.

Bu çalışmada, üç PBMC izolasyon protokolü karşılaştırıldı: yoğunluk gradyan ayrımı, manuel ve otomatik boncuk tabanlı izolasyon. PBMC izolasyonundan önce buffy coat seyreltmesinin çıkarılması ve santrifüjler için kopma OFF gereksiniminin ortadan kaldırılması da dahil olmak üzere üreticinin manuel boncuk tabanlı protokolünde değişiklikler yapıldı, bu da araştırmacıların uyarlanabilir, uygun maliyetli ve yüksek verimli bir PBMC izolasyon protokolünü izlemesine olanak tanıdı. İlk olarak, yoğunluk gradyan ayrımını ve manuel boncuk bazlı tekniği karşılaştırmak için PBMC’leri izole etmek için sekiz eşleşen tam kan örneği kullanıldı. Daha da önemlisi, hücre popülasyonu dağılımları, hücre canlılığı ve PBMC’lerin geri kazanımı, sırasıyla Şekil 2A-F, Şekil 3A ve Ek Şekil 1’de gösterildiği gibi, karşılaştırılan iki yöntem arasında önemli ölçüde farklı değildi. Temsili verilerde, tripan mavisi dışlama yöntemi kullanılarak yoğunluk gradyan ayırma yöntemi için hücre sayıları daha yüksekti, ancak bir hematoloji hücre analizörü kullanıldığında değildi. Hücre sayacındaki PBMC hücre tipi ayarları, 8-50 μm’lik bir hücre çapı aralığı kullandı ve bu nedenle, sayımlar, tripan mavisi dışlama yöntemi17 kullanıldığında PBMC’lerin yanı sıra granülositleri (yaklaşık 12-15 μm çapında) içerecektir. Hematolojik hücre sayacı, tripan mavisi dışlama yönteminden daha yüksek özgüllük sunarken, bazı geri kazanım hesaplamaları, cihazın hata payını yansıtan %100’den yüksekti (bkz. Ek Şekil 1). Bu nedenle, çoğu teknik hem spesifik hem de oldukça hassas diferansiyel hücre sayımları sunmadığından, araştırmacıların PBMC izolasyon protokollerinden elde edilen verimleri karşılaştırırken hücre sayma tekniklerinin bir kombinasyonunu uygulamaları önerilir. Ayrıca, her iki teknikten elde edilen PBMC’lerin fonksiyonel aktivitesini karşılaştırmak için testler yapılmamıştır, bu da analizimizin bir sınırlamasıdır.

Daha sonra, manuel ve otomatik boncuk bazlı yöntemler karşılaştırıldı ve eşleşen 8 numuneden PBMC verimi veya canlılığı arasında önemli bir fark tespit edilmedi (Şekil 4A,B). Her iki yöntem için de aynı antikor izolasyon kokteyli kullanıldığından, hücre popülasyonları ayrı ayrı karşılaştırılmadı. Daha da önemlisi, 8 numuneyi işlemek için uygulamalı süre, otomatik protokol kullanılarak 43 dakikadan 22 dakikaya düşürüldü (Şekil 4C). Otomasyon kullanılarak verim, teknisyen tükenmişliğinin önlenmesi ve numune işlemenin tutarlılığı sağlanırken, reaktiflerin ve sarf malzemelerinin maliyeti, manuel boncuk bazlı yönteme göre 3-4 kat daha fazla önemli ölçüde daha yüksektir. Bu, üreticinin protokolünde önerilen 2-5 mL aralığı (10 mL ve/veya daha yüksek bir tam kan hacminden) yerine 1 mL buffy coat (10 mL’lik bir tam kan hacminden) kullanacak şekilde değişiklikler yaptıktan sonradır. Bütçe bir sınırlama ise, manuel yöntemin seçilmesi, yoğunluk ayırma yöntemiyle karşılaştırılabilir reaktif ve sarf malzemesi maliyetlerini korurken işlem süresini ~%25 oranında azaltabilir. 5 dakikalık inkübasyon süreleri içinde numunelerin yeterli şekilde kademelendirilmesini (~ 30 s/numune) sağlamak için teknisyen başına bir seferde en fazla 8 numunenin işlenmesi önerilir (aşama 3.7, 3.11 ve 3.14).

Hem manuel hem de otomatik boncuk bazlı yöntemlerde, buffy kaplamanın çıkarılması, optimum PBMC izolasyonunu sağlamak için kritik bir adımdır. Bu protokolde tam kan yerine buffy bir ceket kullanıldığına dikkat etmek önemlidir, çünkü reaktiflerin hacmi başlangıç materyalihacimleri 10’a dayanmaktadır. Tüm buffy coat hacmini etkili bir şekilde çıkarmak teknik olarak zor olabilir. Başlangıçta, bu yöntem 0.5 mL buffy coat çıkarılmasını detaylandırdı, ancak iyileşmeyi iyileştirmek için 1 mL’ye çıkarıldı. Buffy kaplamanın yeterli ve tutarlı bir şekilde geri kazanılmasını sağlamak için, bu sürecin detaylandırılması protokol dokümantasyonu ve eğitiminde önemlidir. Buffy kaplamayı aspire ederken bir pipet ucunu döndürmeniz ve alttaki katmandan çok fazla RBC aspire etmemeye dikkat etmeniz önerilir (adım 2.3). İstenmeyen hücreleri (yani granülositler ve kırmızı kan hücreleri) bağlayan antikor kokteylini doyurmamak önemlidir, bu da verimi ve saflığıetkileyebilir 10. Buffy coat ekstraksiyonu sırasında toplanan eritrositleri en aza indirmek için, pipet ucu plazma ve buffy coat tabakası arasında olmalıdır. Buffy kaplamanın hacmi 1 mL’den artırılabilir; bununla birlikte, toplanan hacmin %10’undan fazlasının RBC içermediğinden emin olmak için yukarıda açıklandığı gibi özen gösterilmelidir. Alternatif olarak, buffy kaplamaları tutarlı bir şekilde toplamak için otomatik bir sıvı işleyici kullanılabilir18. Bununla birlikte, özellikle masraf göz önüne alındığında, sıvı işleme cihazı protokollerini kalibre etmek ve sorun gidermek için gereken özel saatler çoğu laboratuvar için uygun olmayabilir.

NSW Health Statewide Biobank’ın önümüzdeki 3 yıl içinde 23.000 PBMC’yi işleme hedefi göz önüne alındığında, otomasyon boncuğu tabanlı protokolün geçişi ve uygulanması çok önemliydi. Burada, PBMC’lerin ACD tüplerinden toplamadan 9 güne kadar ortalama canlılık ile >% 70) izole edilebileceği gösterilmiştir. Toplamadan 24 saat sonra verim optimum olsa da, numunelerin taşınması gerekebileceğinden bu zaman dilimi içinde işleme her zaman mümkün değildir. Manuel veya otomatik boncuk bazlı yöntemle izole edilen PBMC’lerin, toplandıktan sonraki 4 gün içinde izole edildiğinde >3 x 105 hücre / mL tam kan ve 10 gün içinde izole edildiğinde >1 x 105 hücre / mL tam kan verimine sahip olabileceği gösterilmiştir. 5 günün üzerindeki numuneler için düşük sayılar, bu analizin bir sınırlaması olarak belirtilmiştir. Ayrıca, bu bilgiler mevcut olmadığı için veriler katılımcı yaşlarına, cinsiyetlerine ve klinik geçmişine göre ayrılmamıştır. Her iki yöntem için de işlem sürelerindeki gecikmelerin etkilerini incelemek için karşılaştırmalı bir analize ihtiyaç duyulmasına rağmen, daha önce yoğunluk gradyan yöntemi kullanılarak PBMC izolasyonundaki gecikmelerin hücre kalitesini düşürdüğü ve RBC kontaminasyonunu önemli ölçüde artırdığı bildirilmiştir 19,20. Ek olarak, işleme gecikirse granülosit oranları artar ve bu nedenle, benzer “yaşlara” sahip numuneler, sonraki analizler için gruplandırılmalıdır 20,21,22. Dikkat çekici bir şekilde, bu deney asit sitrik dekstroz (yani trisodyum sitrat, sitrik asit ve dekstroz) ile antikoagüle edilmiş kan kullanılarak gerçekleştirildi; bununla birlikte, diğer antikoagülanlar kullanılırsa hücre tiplerinin verimi ve/veya oranı değişebilir23; bu nedenle araştırmacılara, amaçlanan aşağı akış PBMC analizlerine dayalı olarak uygun bir antikoagülan seçmeleri önerilir.

Özetle, yüksek verimli iş akışlarına uyarlanabilen manyetik boncuklar kullanan bir PBMC izolasyonu protokolü, hücre canlılığından ödün vermeden ölçeklendirme gereksinimlerini karşılamak için ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Hem manuel hem de otomatik yöntemler, başlatma ve yeniden süspansiyon hacimlerini değiştirerek spesifik hücre konsantrasyonları üretmek için optimize edilebilir. NSW Health Statewide Biobank, geleneksel yoğunluk gradyan ayırma tekniğini kullanarak ayda ~ 60 PBMC çıkarmaktan, bu otomasyonla uyumlu boncuk tabanlı yöntemi kullanarak ayda ~ 300 PBMC’ye geçiş yaptı. Yazarların bir sonraki hedefi, ayda 1200’e kadar PBMC’yi işlemek için otomatik platformu kullanmak ve hem manyetik boncuk tabanlı (manuel ve otomatik) hem de yoğunluk gradyan teknikleriyle izole edilen PBMC’leri daha fazla karşılaştırmak ve bu tekniğin uygulanmasına rehberlik etmek için özellikle biyobankalara odaklanan diğer laboratuvarlara rehberlik etmektir.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NSW Sağlık Eyalet Çapında Biyobanka, NSW Sağlık Patolojisi, NSW Sağlık ve Tıbbi Araştırma Ofisi ve Sidney Yerel Sağlık Bölgesi’nden gelen desteği minnetle kabul eder. Ek olarak, yazarlar, kurum içi oluşturulan verileri yayınlama ve kullanılmayan örnekleri araştırma amacıyla kullanma izni verdiği için Omico ve NSW Health Statewide Biobank tarafından desteklenen diğer araştırma çalışmalarına minnetle teşekkür eder. Yazarlar, eleştirel liderlik ve tartışmalar için Profesör Jennifer Bryne’a (NSW Sağlık Patolojisi, Sidney Üniversitesi) teşekkür eder. Şekil 1 , BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Materials

Cell cryopreservation media CS10, 100 mL (CRYOSTOR) StemCellTM Technologies 07930
Class II Biological Safety Cabinet Thermo ScientififcTM 51033311
CoolCell 1 mL FX BioTools BCS-407P This is the control rate freezing container used.
Distilled Water  Bacto Laboratories 561832
DxH 500 Hematology Analyzer  Beckman Coulter Life Sciences B40601 Referred to as external automated cell counter.
EasyEightsTM EasySepTM Magnet StemCellTM Technologies 18103
EasySepTM Direct Human PBMC Isolation Kit StemCellTM Technologies 19654 Kit includes the magnetic bead tube and the cocktail mix tube
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich Pty Ltd E6758-500G Instructions to make 0.1M EDTA solution from EDTA salt is located in supplemental file 2.
LymphoprepTM Density Gradient Medium StemCellTM Technologies 7851
Megafuge ST4 Plus Centrifuge Thermo ScientififcTM THR75009903
Orion Star A211 pH meter electrode Thermo ScientififcTM STARA2110
Orion™ ROSS Ultra™ Glass Triode™ pH/ATC Combination Electrodes Thermo ScientififcTM 8302BNURCA
Phosphate buffered saline (PBS), solution, 1X, 500ml Life Technologies Australia Pty Ltd 10010023
Prism GraphPad
RoboSepTM Buffer 1X StemCellTM Technologies 20104 Software used for statistical analysis.
RoboSepTM-S StemCellTM Technologies 21000 Fully automated cell separator instrument.
RoboSep™ Filter Tips StemCellTM Technologies 20125
SepMateTM-50 (IVD) tubes StemCellTM Technologies 85460 IVD – In vitro diagnostics. Also known as SepMateTM-50 tubes
Vi-CELL XR Cell Anlayzer Beckman Coulter Life Sciences Internal automated cell counter. Instrument obsolete and no longer available for purchase (as of December 31, 2022). Alternative instrument is the ViCell BLU Cell Viability Analyzer (Product no. C19196).
Vi-CELL XR Quad Pack Reagent Kit Beckman Coulter Life Sciences 383722
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alexovic, M., et al. Human peripheral blood mononuclear cells: A review of recent proteomic applications. Proteomics. 22 (15-16), e2200026 (2022).
  2. Zhang, M., Huang, B. The multi-differentiation potential of peripheral blood mononuclear cells. Stem Cell Res Ther. 3 (6), 48 (2012).
  3. Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research. Cryo Lett. 33 (5), 376-384 (2012).
  4. Kleeberger, C. A., et al. Viability and recovery of peripheral blood mononuclear cells cryopreserved for up to 12 years in a multicenter study. Clin Diagn Lab Immunol. 6 (1), 14-19 (1999).
  5. Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on percoll. Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).
  6. Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Curr Protoc Immunol. 7, 711-718 (2009).
  7. Gautam, A., et al. Investigating gene expression profiles of whole blood and peripheral blood mononuclear cells using multiple collection and processing methods. PLoS One. 14 (12), e0225137 (2019).
  8. Hamot, G., Ammerlaan, W., Mathay, C., Kofanova, O., Betsou, F. Method validation for automated isolation of viable peripheral blood mononuclear cells. Biopreserv Biobank. 13 (3), 152-163 (2015).
  9. Coppola, L., et al. Purification of viable peripheral blood mononuclear cells for biobanking using a robotized liquid handling workstation. J Transl Med. 17 (1), 371 (2019).
  10. Stemcell Technologies. . 27156, (2020).
  11. Hornschuh, M., et al. Negative magnetic sorting preserves the functionality of ex vivo cultivated non-adherent human monocytes. Biology (Basel). 11 (11), 1583 (2022).
  12. Bhattacharjee, J., Das, B., Mishra, A., Sahay, P., Upadhyay, P. Monocytes isolated by positive and negative magnetic sorting techniques show different molecular characteristics and immunophenotypic behaviour. F1000Res. 6, 2045 (2017).
  13. Ohlsson, S., Diedrich, B., Uhlin, M., Sandgren, P. Optimized processing for pathogen inactivation of double-dose buffy-coat platelet concentrates: Maintained in vitro quality over 7-day storage. Vox Sang. 113 (7), 611-621 (2018).
  14. Easysep direct human PBMC isolation kit for processing 100 mL buffy coat. Available from: https://www.stemcell.com/products/brands/easysep-cell-separation.html (2022)
  15. . Vi-cell XR cell viability analyzer instructions for use Available from: https://mbcbiolabs.com/wp-content/uploads/2022/08/Beckman-Coulter-ViCell-Manual.pdf (2017)
  16. Fuchs, Y. F., et al. Next-generation biobanking: Employing a robotic system for automated mononuclear cell isolation. Biopreserv Biobank. 21 (1), 106-110 (2023).
  17. Tigner, A., Ibrahim, S. A., Murray, I. V. . Histology, white blood cell. , (2024).
  18. Mathay, C., Ammerlaan, W., Betsou, F. Automatic buffy coat extract on: Methodology, feasibility, optimization, and validation study. Biopreserv Biobank. 10 (6), 543-547 (2012).
  19. Golke, T., et al. Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield, but severly compromise cell viability. Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).
  20. Yi, P. C., et al. Impact of delayed PBMC processing on functional and genomic assays. J Immunol Methods. 519, 113514 (2023).
  21. Mckenna, K. C., Beatty, K. M., Vicetti Miguel, R., Bilonick, R. A. Delayed processing of blood increases the frequency of activated CD11b+ CD15+ granulocytes which inhibit t-cell function. J Immunol Methods. 341 (1-2), 68-75 (2009).
  22. Mallone, R., et al. Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive t-cell responses: Position statement of the t-cell workshop committee of the immunology of diabetes society. Clin Exp Immunol. 163 (1), 33-49 (2011).
  23. Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Curr Pathobiol Rep. 7 (2), 17-27 (2019).

Tags

Peripheral Blood Mononuclear CellsPBMCsBuffy CoatsHigh-throughput WorkflowImmunomagnetic Bead SeparationDensity Gradient CentrifugationCryopreserved PBMCsCell ViabilityCell ConcentrationPopulation DistributionFlow CytometryImmunoassaysGenome Sequencing
This article has been published
Video Coming Soon
Keep me updated:

.

PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Villalva, M., Macphail, S., Li, Y., Caruana, B. Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells from Buffy Coats via High Throughput Immunomagnetic Bead Separation. J. Vis. Exp. (209), e66887, doi:10.3791/66887 (2024).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image