Summary

Etablissement d’un modèle d’implantation embryonnaire in vitro

Published: June 21, 2024
doi:

Summary

Ce protocole décrit des méthodologies permettant d’établir un modèle in vitro simple et efficace d’implantation embryonnaire pour évaluer les molécules pertinentes affectant le processus d’implantation embryonnaire.

Abstract

L’implantation embryonnaire est la première étape dans l’établissement d’une grossesse réussie. Un modèle in vitro d’implantation d’embryons est essentiel pour la recherche biologique fondamentale, le développement de médicaments et le dépistage. Cet article présente un modèle in vitro simple, rapide et très efficace pour l’implantation d’embryons. Dans ce protocole, nous introduisons d’abord l’acquisition de blastocystes de souris et la préparation de cellules d’adénocarcinome de l’endomètre humain (Ishikawa) pour l’implantation, puis la méthode de co-culture pour les embryons de souris et les cellules d’Ishikawa. Enfin, nous avons mené une étude pour évaluer l’impact de concentrations variables de 17-β-œstradiol (E2) et de progestérone (P4) sur les taux d’adhésion embryonnaire sur la base de ce modèle. Nos résultats ont révélé que des concentrations élevées de E2 réduisaient significativement l’adhésion embryonnaire, tandis que l’ajout de progestérone pouvait restaurer le taux d’adhésion. Ce modèle offre une plate-forme simple et rapide pour évaluer et cribler les molécules impliquées dans le processus d’adhésion, telles que les cytokines, les médicaments et les facteurs de transcription contrôlant l’implantation et la réceptivité de l’endomètre.

Introduction

L’implantation de l’embryon, première étape d’une grossesse réussie, est cruciale pour comprendre sa base biologique et relever les défis de l’infertilité. Cependant, les contraintes éthiques posent des limites importantes à la collecte d’échantillons cliniques d’embryons humains, ce qui entrave la recherche sur les interactions complexes entre les embryons humains et l’endomètre au début de la grossesse1. Une compréhension approfondie de ces mécanismes complexes est essentielle pour faire progresser la recherche biologique fondamentale, la découverte de médicaments et la santé reproductive.

Des modèles in vitro antérieurs utilisaient des modèles d’adhésion où des cellules épithéliales endométriales humaines monocouches (RL95-2)2 étaient co-cultivées avec des substituts embryonnaires, tels que les cellules de choriocarcinome BeWo, JAr ou Jeg-33 . Néanmoins, le choix de la taille des sphéroïdes, allant de 70 à 100 μm, était crucial car des agrégats cellulaires plus grands ou plus petits pouvaient compromettre la précision de l’expérience. Notamment, seulement 25 % des sphéroïdes de chaque préparation répondaient à la norme pourla taille 4 appropriée, et il y avait des différences significatives par rapport aux conditions physiologiques des blastocystes.

De plus, les systèmes de culture tridimensionnels (3D) de l’endomètre et du blastocyste offrent un environnement physiologiquement plus pertinent5, mais ils nécessitent une expertise technique élevée, une croissance cellulaire lente, des coûts de ressources et de maintenance élevés, une difficulté de standardisation et une faible reproductibilité6.

Dans ce protocole, nous présentons un modèle in vitro rentable et rapide d’implantation d’embryons qui peut être développé et utilisé dans la plupart des laboratoires. L’objectif global de cette méthode est de fournir une plateforme fiable et reproductible pour l’étude des interactions entre l’embryon et l’endomètre dans un environnement contrôlé. En simulant les événements clés de l’implantation embryonnaire in vitro, ce modèle vise à combler le fossé entre les modèles animaux et les environnements cliniques, permettant une recherche plus précise et plus ciblée.

Par rapport aux substituts embryonnaires, l’utilisation de blastocystes de souris offre une représentation plus pertinente sur le plan physiologique du processus d’implantation embryonnaire in vivo7. De plus, la lignée cellulaire Ishikawa, dérivée de l’adénocarcinome de l’endomètre humain, possède des caractéristiques mixtes de l’épithélium glandulaire et de l’épithélium1 de la lumière utérine, lui permettant d’exprimer des enzymes, des protéines structurelles et des récepteurs stéroïdiens fonctionnels similaires à ceux trouvés dans l’endomètre normal, fournissant ainsi un substrat physiologiquement pertinent pour l’implantation de l’embryon. La simplicité et la rapidité du système de co-culture permettent un dépistage à haut débit et des tests de drogues 8,9,10. En fournissant une plate-forme robuste et reproductible, cette méthode offre la possibilité de faire progresser notre compréhension de l’implantation embryonnaire et de son impact sur la santé humaine.

Protocol

La manipulation des souris et les études expérimentales ont été réalisées selon des protocoles approuvés par le Comité des animaux de l’Institut de Shanghai pour les technologies biomédicales et pharmaceutiques. Assurez les procédures de sécurité : Portez toujours un équipement de protection individuelle (EPI) approprié lorsque vous manipulez des produits chimiques ou des matières biologiques. 1. Acquisition d’embryons de souris REM…

Representative Results

Dans le processus des techniques de procréation assistée, l’hyperstimulation ovarienne contrôlée (COH) est une étape cruciale, conduisant à des niveaux d’œstrogènes significativement élevés chez les patientes de plus de 10 à 20 fois par rapport aux cycles naturels11. Dans ce contexte, nous nous sommes demandé si des concentrations élevées d’œstrogènes sériques avaient un impact sur l’implantation d’embryons lors du transfert d’embryons frais. Sur la base de ce modèle …

Discussion

La simplicité et la rapidité du modèle in vitro proposé pour l’implantation d’embryons offrent des avantages remarquables pour le dépistage précoce de médicaments et d’autres applications de recherche. La simplicité du protocole, associée à la nature à haut débit des lignées cellulaires d’Ishikawa, en fait un candidat idéal pour les criblages à grande échelle, en particulier dans les premières étapes de la découverte de médicaments. Liang13 a découvert que l?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos études ont été soutenues par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82171603), la Fondation de la Commission municipale de la santé de Shanghai (202140341), la Commission des sciences et de la technologie de la municipalité de Shanghai (23JC1403803) et le Programme de promotion de l’innovation du NHC et de Shanghai Key Labs, SIBPT (RC2023-02).

Materials

17-β-estradiol SIGMA 3301 Most potent mammalian estrogenic hormone
BD Falcon BD 353001 Bacteriological Petri Dishes 35 x 10 mm style w/tight lid, crystal-grade virgin polystyrene, sterile
Biosafety Cabinet ESCO class Equation 1BSC Aseptic operations, making culture dishes, aliquoting reagents, etc
CO2 Incubator Thermo 8000DH Embryo culture
Culture plate Corning 3506 Cell culture
DMEM/F12 Gibco 1133032 DMEM/F12 (1x), liquid 1:1,Contains L-glutamine and 15 mM HEPES buffer
Fetal Bovine Serum Gibco 10099141 Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin
Gelatin SIGMA G9391 Type B, powder, BioReagent, suitable for cell culture
HCG Nanjing Aibei M2520 Sterilization reagent, intraperitoneal injection, 50 IU/mL
Hyaluronidase  SIGMA V900833 Reagent grade, powder 
KSOM Merck MR-020P-D (1x), Powder, w/o Phenol Red, 5 x 10 mL
L-glutamine Gibco 25030081 L-glutamine-200 mM (100x), liquid
M2 Merck MR-015-D EmbryoMax M2 Medium (1x), Liquid, with Phenol Red
Mineral oil  SIGMA M8410 Mineral oil is suitable for use as a cover layer to control evaporation and cross-contamination in various molecular biology applications
Penicillin-Streptomycin, liquid Gibco 15140122 10,000 Units penicillin (base) and 10,000 units streptomycin (base), utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline
PMSG Nanjing Aibei M2620 Sterilization reagent ,intraperitoneal injection, 50 IU/mL
Progesterone SIGMA 5341 Steroid hormone secreted by the corpus luteum during the latter half of the menstrual cycle
Sodium pyruvate Gibco 11360070 Sodium pyruvate is commonly added to cell culture media as a carbon source in addition to glucose
Stereomicroscope Olympus SZX7 Embryo retrieval and observation of embryo development

References

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Citer Cet Article
Wang, X., Sun, Y., Shi, H., Xin, A. Establishment of an Embryo Implantation Model In Vitro. J. Vis. Exp. (208), e66873, doi:10.3791/66873 (2024).

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