La purification des protéines recombinantes des systèmes végétaux est généralement contestée par les protéines végétales. Ce travail fournit une méthode pour extraire et purifier efficacement une protéine recombinante sécrétée à partir de l’apoplast de Nicotiana benthamiana.
Les plantes sont un système d’expression eucaryote en cours d’exploration pour produire des protéines thérapeutiques. La purification des protéines recombinantes des plantes est l’une des étapes les plus critiques du processus de production. En règle générale, les protéines ont été purifiées à partir de protéines solubles totales (TSP), et la présence de protéines intracellulaires et de cytochromes divers pose des défis pour les étapes ultérieures de purification des protéines. De plus, la plupart des protéines thérapeutiques comme les antigènes et les anticorps sont sécrétées pour obtenir une glycosylation correcte, et la présence de protéines incomplètement modifiées conduit à des structures d’antigènes ou d’anticorps incohérentes. Ce travail introduit une méthode plus efficace pour obtenir des protéines recombinantes hautement purifiées à partir de l’espace apoplasique des plantes. La protéine fluorescente verte recombinante (GFP) est conçue pour être sécrétée dans l’apoplast de Nicotiana benthamiana et est ensuite extraite à l’aide d’une méthode d’infiltration-centrifugation. Le GFP-His de l’apoplaste extrait est ensuite purifié par chromatographie d’affinité au nickel. Contrairement aux méthodes traditionnelles de TSP, la purification à partir de l’apoplast produit des protéines recombinantes hautement purifiées. Il s’agit d’une amélioration technologique importante pour les systèmes de production végétale.
De nos jours, diverses protéines thérapeutiques recombinantes produites par des plantes sont à l’étude, notamment des anticorps, des vaccins, des protéines bioactives, des enzymes et de petits polypeptides 1,2,3,4,5,6. Les plantes deviennent une plate-forme de plus en plus utilisée pour produire des protéines thérapeutiques en raison de leur sécurité, de leur faible coût et de leur capacité à augmenter rapidement la production 7,8. L’expression et la modification des protéines dans les systèmes végétaux, ainsi que la purification des protéines, sont des facteurs critiques déterminant la productivité des bioréacteurs végétaux 9,10. L’amélioration de la productivité des plantes et l’obtention de protéines cibles de haute pureté sont les principaux défis auxquels sont confrontés les systèmes de production à base de plantes11,12.
La localisation subcellulaire et la modification des protéines recombinantes dépendent du peptide signal spécifique codé à l’extrémité N-terminale, qui cible la protéine vers sa destination finale d’organite lors de l’expression génique. Les protéines recombinantes sont conçues pour se localiser dans l’apoplaste, le réticulum endoplasmique (RE), le chloroplaste, la vacuole ou le cytoplasme, en fonction de leurs propriétés uniques13. Pour les antigènes et les anticorps, les protéines sécrétées sont préférées. Avant la sécrétion, les protéines progressent à travers le RE et Golgi pour un repliement correct et des modifications post-traductionnelles 14,15,16.
Après la production dans les plantes, les protéines recombinantes doivent être purifiées à partir d’extraits de plantes. En règle générale, les protéines sont purifiées à partir d’extraits de plantes solubles totaux, qui contiennent d’abondantes protéines intracellulaires, des produits mal repliés et non modifiés et des cytochromes17. Pour éliminer les impuretés, les extraits de plantes subissent un fractionnement important, y compris la chromatographie d’affinité spécifique de la ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygénase (RuBisCO), la précipitation des phytates, la précipitation du polyéthylène glycol et l’ajustement de la température et du pH18,19. Ces étapes d’élimination des impuretés sont laborieuses et peuvent compromettre la qualité des protéines.
Le compartiment cellulaire végétal au-delà de la membrane plasmique est défini comme l’apoplaste, englobant la paroi cellulaire, les espaces intercellulaires et le xylème20. La phase aqueuse est communément appelée liquide de lavage apoplast (AWF). L’AWF contient des molécules sécrétées par les cellules pour réguler de nombreux progrès biologiques tels que le transport, le métabolisme de la paroi cellulaire et les réponses au stress21,22. Contrairement à la TSP, les constituants moléculaires de l’AWF sont moins complexes. L’extraction de protéines recombinantes de l’AWF peut éviter la contamination par des protéines intracellulaires, des produits mal repliés et des restes cytoplasmiques. En bref, le lipide d’extraction pénètre dans les feuilles par les stomates sous pression négative, et l’AWF est collecté par centrifugation douce23. Bien que l’isolement de l’AWF soit largement utilisé pour étudier les progrès biologiques à l’intérieur de l’apoplast 24,25,26,27, il n’a pas été exploité dans les systèmes de production à base de plantes.
L’amélioration de la productivité des plantes et l’obtention de protéines cibles de haute pureté sont des défis centraux pour les systèmes de production végétale28. En règle générale, les protéines sont purifiées à partir d’extraits de plantes solubles contenant de grandes quantités de protéines intracellulaires, de produits mal repliés et non modifiés, et de cytochromes29, qui nécessitent des coûts élevés pour la purification ultérieure30. L’utilisation de méthodes d’extraction de protéines AWF pour l’extraction de protéines recombinantes exogènes sécrétées dans l’apoplast peut améliorer efficacement l’homogénéité des protéines recombinantes et réduire le coût de la purification des protéines. Ici, nous utilisons un peptide signal PR1a pour permettre la sécrétion de protéines exogènes dans l’espace de l’appoplast et introduisons une méthode détaillée pour la purification des protéines recombinantes de l’AWF de N. benthamiana.
L’utilisation de plantes pour produire des protéines thérapeutiques s’est rapidement développée ces dernières années 1,2,3,4,5,6. Les gènes codant pour des protéines sont clonés en vecteurs d’expression et délivrés dans les tissus végétaux par agroinfiltration. Après leur production par les cellules végé…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail est soutenu par l’Association pour la promotion de l’innovation des jeunes CAS (2021084) et le Fonds de soutien aux projets de déploiement clé du Plan d’action triennal de l’Institut de microbiologie de l’Académie chinoise des sciences.
100 mesh nylon fine mesh yarn | Guangzhou Huayu Trading limited company | hy-230724-2 | For AWF protein extraction |
50 ml centrifuge tubes | Vazyme | TCF00150 | For centrifuge |
ClonExpress II one step cloning kit | Vazyme | C112-02 | For clone |
FastDigest Sac1 | NEB | R3156S | For clone |
FastDigest XbaI | NEB | FD0685 | For clone |
ImageJ 1.5.0 | / | / | For greyscale analysis |
Large filter | Thermo Fisher | NEST | For filtering |
Laser scanning confocal microscopy | Leica SP8 | For subcellular localization | |
Ni sepharose excel | Cytiva | 10339806 | For protein purification |
Precast protein plus gel | YEASEN | 36246ES10 | For SDS-PAGE |
Small filter | Nalgene | 1660045 | For filtering |
SuperSignal West Femto Substrate Trial Kit | Thermo Fisher | 34076 | For western blotting |
Triton X-100 | SCR | 30188928 | To configure the extraction buffer |
Type rotaryvang vacuum pump | Zhejiang taizhouqiujing vacuum pump limited company | 2XZ-2 | For vacuum infiltration |
Vertical mixer | Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing limited company | BE-1200 | For mixing |
β-mercaptoethanol | SIGMA | BCBK8223V | To configure the extraction buffer |