Métodos para Habilitar a Transcriptômica Espacial de Tecidos Ósseos
Summary
Aqui, descrevemos um método que permite a descalcificação de tecidos ósseos recém-obtidos e a preservação de RNA de alta qualidade. Um método também é ilustrado para seccionar amostras de Formalina Fixada Parafina Embebida (FFPE) de ossos não desmineralizados para obter resultados de boa qualidade se os tecidos frescos não estiverem disponíveis ou não puderem ser coletados.
Abstract
Compreender a relação entre as células e sua localização dentro de cada tecido é fundamental para descobrir os processos biológicos associados ao desenvolvimento normal e à patologia da doença. A transcriptômica espacial é um método poderoso que permite a análise de todo o transcriptoma em amostras de tecido, fornecendo informações sobre a expressão gênica celular e o contexto histológico em que as células residem. Embora este método tenha sido amplamente utilizado para muitos tecidos moles, sua aplicação para as análises de tecidos duros, como o osso, tem sido um desafio. O maior desafio reside na incapacidade de preservar a morfologia do RNA e do tecido de boa qualidade durante o processamento das amostras de tecido duro para seccionamento. Portanto, um método é descrito aqui para processar amostras de tecido ósseo recém-obtidas para gerar efetivamente dados transcriptômicos espaciais. O método permite a descalcificação das amostras, garantindo cortes de tecido bem-sucedidos com detalhes morfológicos preservados, evitando a degradação do RNA. Além disso, são fornecidas diretrizes detalhadas para amostras que foram previamente embebidas em parafina, sem desmineralização, como amostras coletadas de bancos de tecidos. Usando essas diretrizes, são mostrados dados transcriptômicos espaciais de alta qualidade gerados a partir de amostras de banco de tecidos de tumor primário e metástase pulmonar de osteossarcoma ósseo.
Introduction
O osso é um tecido conjuntivo especializado composto principalmente por fibras de colágeno tipo 1 e sais inorgânicos1. Como resultado, o osso é incrivelmente forte e rígido, ao mesmo tempo em que é leve e resistente a traumas. A grande força do osso deriva de seu conteúdo mineral. De fato, para qualquer aumento na porcentagem de conteúdo mineral, a rigidez aumenta em cinco vezes2. Consequentemente, os investigadores enfrentam problemas significativos quando analisam, por meio de secção histológica, a biologia de uma amostra óssea.
A histologia óssea não descalcificada é viável e, às vezes, necessária, dependendo do tipo de investigação (por exemplo, para estudar a microarquitetura do osso); É, no entanto, muito desafiador, especialmente se os espécimes forem grandes. Nesses casos, o processamento de tecidos para fins histológicos requer várias modificações nos protocolos e técnicas padrão3. Em geral, para realizar avaliações histológicas comuns, os tecidos ósseos são descalcificados logo após a fixação, processo que pode levar de alguns dias a várias semanas, dependendo do tamanho do tecido e do agente descalcificante utilizado4. As seções descalcificadas são frequentemente usadas para o exame da medula óssea, o diagnóstico de tumores, etc. Existem três tipos principais de agentes descalcificantes: ácidos fortes (por exemplo, ácido nítrico, ácido clorídrico), ácidos fracos (por exemplo, ácido fórmico) e agentes quelantes (por exemplo, ácido etilenodiaminotetrético ou EDTA)5. Ácidos fortes podem descalcificar o osso muito rapidamente, mas podem danificar os tecidos; ácidos fracos são muito comuns e adequados para procedimentos diagnósticos; Os agentes quelantes são de longe os mais usados e apropriados para aplicação em pesquisa, pois, neste caso, o processo de desmineralização é lento e suave, permitindo a retenção de morfologia de alta qualidade e a preservação de informações de genes e proteínas, conforme exigido por muitos procedimentos (por exemplo, hibridização in situ , imunocoloração). No entanto, quando todo o transcriptoma precisa ser preservado, como para análises de expressão gênica, mesmo uma desmineralização lenta e suave pode ser prejudicial. Portanto, melhores abordagens e métodos são necessários quando a análise morfológica dos tecidos precisa ser combinada com análises de expressão gênica das células.
Graças às recentes melhorias no sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) e transcriptômica espacial, agora é possível estudar a expressão gênica de uma amostra de tecido, mesmo quando a inclusão de parafina de fixação em formalina (FFPE) foi usada para armazenar as amostras de tecido 6,7,8. Essa oportunidade desbloqueou o acesso a um número maior de amostras, como as armazenadas em bancos de tecidos em todo o mundo. Se o scRNA-seq for empregado, a integridade do RNA é o requisito mais importante; no entanto, no caso da transcriptômica espacial de amostras FFPE, tanto os cortes de tecido de alta qualidade quanto o RNA de alta qualidade são necessários para visualizar a expressão gênica dentro do contexto histológico de cada corte de tecido. Embora isso tenha sido facilmente alcançado com tecidos moles, o mesmo não pode ser dito para tecidos duros como ossos. De fato, até onde sabemos, nenhum estudo usando transcriptômica espacial foi realizado em amostras ósseas FFPE. Isso se deve à falta de protocolos que possam processar efetivamente os tecidos ósseos FFPE, preservando seu conteúdo de RNA. Aqui, um método para processar e descalcificar amostras de tecido ósseo recém-obtidas, evitando a degradação do RNA, é fornecido primeiro. Em seguida, reconhecendo a necessidade de análise transcriptômica das amostras de FFPE coletadas em bancos de tecidos em todo o mundo, também são apresentadas diretrizes desenvolvidas para lidar adequadamente com amostras de FFPE de ossos não desmineralizados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, um método detalhado é fornecido para preparar blocos FFPE de ossos descalcificados e preservar a integridade do RNA para sequenciamento (ou seja, sequenciamento de próxima geração (NGS)) ou para outras técnicas relacionadas ao RNA (ou seja, hibridização in situ , reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR), etc.).
O método utiliza EDTA para descalcificar amostras de tecido ósseo; a incubação de EDTA permite uma desmineralização…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por fundos do Pittsburgh Cure Sarcoma (PCS) e do Osteosarcoma Institute (OSI).
Materials
| Advanced orbital shaker | VWR | 76683-470 | Use to keep tissues under agitation during incubation as reported in the method instructions. |
| Camel Hair Brushes | Ted Pella | 11859 | Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines. |
| Dual Index Kit TS Set A 96 rxns | 10X Genomics | PN-1000251 | Use to perform spatial transcriptomics. |
| Ethanol 200 Proof | Decon Labs Inc | 2701 | Use to perform tissue dehydration as reported in the method instructions. |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (EDTA) | Thermo Fisher Scientific | S312-500 | Use to prepare EDTA 20% pH 8.0. |
| Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines. |
| Fisherbrand Fine Precision Probe | Fisher Scientific | 12-000-153 | Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines. |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Use to attach sectioned scrolls as reported in the guidelines. |
| High profile diamond microtome blades | CL Sturkey | D554DD | Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines. |
| Novaseq 150PE | Novogene | N/A | Sequencer. |
| Paraformaldehyde (PFA) 32% Aqueous Solution EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Dilute to final concentration of 4% with 1x PBS to perform tissue fixation. |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | Ready to use. Use to dilute PFA and to perform washes as reported in the method instructions. |
| Premiere Tissue Floating Bath | Fisher Scientific | A84600061 | Use to remove wrinkles from FFPE sections as reported in the guidelines. |
| RNase AWAY Surface Decontaminant | Thermo Fisher Scientific | 7002 | Use to clean all surfaces as reported in the method instructions. |
| RNeasy DSP FFPE Kit | Qiagen | 73604 | Use to isolate RNA from FFPE sections once they have been generated as reported in the guidelines. |
| Semi-Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | RM2245 | Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines. |
| Sodium hydroxide | Millipore Sigma | S8045-500 | Prepare 10 N solution by slowly dissolving 400 g in 1 liter of Milli-Q water. |
| Space Ranger | 10X Genomics | 2.0.1 | Use to process sequencing data output . |
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems | 39601006 | Use to perform tissue infliltration and embedding as reported in the method instructions. |
| Visium Accessory Kit | 10X Genomics | PN-1000194 | Use to perform spatial transcriptomic experiments. |
| Visium Human Transcriptome Probe Kit Small | 10X Genomics | PN-1000363 | Use to perform spatial transcriptomic experiments. |
| Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns | 10X Genomics | PN-1000188 | Use to place the sections if performing spatial transcriptomic experiments. |
| Xylene | Leica Biosystems | 3803665 | Use to perform tissue clearing as reported in the method instructions. |
References
- Baig, M. A., Bacha, D. . Histology. Bone. , (2024).
- Currey, J. D. The mechanical consequences of variation in the mineral content of bone. J Biomech. 2 (1), 1-11 (1969).
- Goldschlager, T., Abdelkader, A., Kerr, J., Boundy, I., Jenkin, G. Undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis. J Vis Exp. (35), e1707 (2010).
- Wallington, E. A. . Histological Methods for Bone. , (1972).
- Callis, G. M., Sterchi, D. L. Decalcification of bone: Literature review and practical study of various decalcifying agents. methods, and their effects on bone histology. J Histotechnol. 21 (1), 49-58 (1998).
- Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. The utilization of formalin fixed-paraffin-embedded specimens in high throughput genomic studies. Int J Genomics. 2017, 1926304 (2017).
- Trinks, A., et al. Robust detection of clinically relevant features in single-cell RNA profiles of patient-matched fresh and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) lung cancer tissue. Cell Oncol (Dordr). , (2024).
- Xu, Z., et al. High-throughput single nucleus total RNA sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded tissues by snRandom-seq. Nat Commun. 14 (1), 2734 (2023).
- 10x Genomics. Visium Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE – User Guide., Document Number C CG000407 Rev C. 10x Genomics. , (2021).
- 10x Genomics. Interpreting Space Ranger Web Summary Files for Visium Spatial Gene Expression for FFPE F FFPEAssay., Document Number CG000499 Rev A. 10x Genomics. , (2022).
- 10x Genomics. Visium Spatial Gene Expression for FFPE-Tissue Preparation Guide., Document Number C G CG000408 Rev D. 10x Genomics. , (2022).
