뼈 조직의 공간 전사체학(spatial transcriptomics)을 가능하게 하는 방법
Summary
여기에서는 갓 얻은 뼈 조직의 석회질을 제거하고 고품질 RNA를 보존할 수 있는 방법을 설명합니다. 또한 새로운 조직을 구할 수 없거나 채취할 수 없는 경우 우수한 품질의 결과를 얻기 위해 비탈염된 뼈의 FFPE(Formalin Fixed Paraffin Embedded) 샘플을 절편하는 방법이 예시되어 있습니다.
Abstract
세포와 각 조직 내 세포 위치 간의 관계를 이해하는 것은 정상적인 발달 및 질병 병리와 관련된 생물학적 과정을 밝히는 데 중요합니다. 공간 전사체학(Spatial transcriptomics)은 조직 샘플 내 전체 전사체를 분석할 수 있는 강력한 방법으로, 세포 유전자 발현과 세포가 존재하는 조직학적 맥락에 대한 정보를 제공합니다. 이 방법은 많은 연조직에 광범위하게 활용되어 왔지만 뼈와 같은 경조직 분석에 적용하는 것은 까다로웠습니다. 가장 큰 문제는 절편을 위해 경질 조직 샘플을 처리하는 동안 우수한 품질의 RNA 및 조직 형태를 보존할 수 없다는 것입니다. 따라서, 공간 전사체학 데이터를 효과적으로 생성하기 위해 갓 얻은 뼈 조직 샘플을 처리하는 방법을 여기에서는 설명합니다. 이 방법을 사용하면 샘플의 석회질을 제거할 수 있으며, RNA 분해를 피하면서 형태학적 세부 사항이 보존된 성공적인 조직 절편을 얻을 수 있습니다. 또한, 조직 은행에서 채취한 샘플과 같이 이전에 탈염 없이 파라핀이 내장되어 있던 샘플에 대한 자세한 지침이 제공됩니다. 이 가이드라인을 사용하여 뼈 골육종의 원발성 종양 및 폐 전이의 조직 은행 샘플에서 생성된 고품질 공간 전사체학 데이터를 보여줍니다.
Introduction
뼈는 주로 콜라겐 유형 1과 무기 염1의 섬유로 구성된 특수 결합 조직입니다. 그 결과, 뼈는 믿을 수 없을 정도로 강하고 뻣뻣하며, 동시에 가볍고 외상에 강합니다. 뼈의 위대한 힘은 미네랄 함량에서 비롯됩니다. 실제로, 미네랄 함량의 비율이 증가할 때마다 강성은 5배 증가합니다2. 결과적으로, 연구자들은 조직학적 절편을 통해 뼈 표본의 생물학을 분석할 때 심각한 문제에 직면하게 됩니다.
석회질화되지 않은 뼈 조직학은 실현 가능하며 조사 유형에 따라 때때로 필요합니다(예: 뼈의 미세 구조 연구). 그러나 특히 표본이 큰 경우 매우 어렵습니다. 이러한 경우, 조직학적 목적을 위한 조직 처리는 표준 프로토콜 및 기법의 몇 가지 수정을 필요로 한다3. 일반적으로 일반적인 조직학적 평가를 수행하기 위해 뼈 조직은 고정 직후 석회질을 제거하는데, 이 과정은 조직의 크기와 사용된 석회질 제거제에 따라 며칠에서 몇 주가 걸릴 수 있습니다4. 석회질을 제거한 절편은 골수 검사, 종양 진단 등에 자주 사용됩니다. 석회질 제거제에는 강산(예: 질산, 염산), 약산(예: 포름산) 및 킬레이트제(예: 에틸렌디아민테트라트산 또는 EDTA)의 세 가지 주요 유형이 있습니다5. 강산은 뼈를 매우 빠르게 석회질을 제거할 수 있지만 조직을 손상시킬 수 있습니다. 약산은 매우 일반적이며 진단 절차에 적합합니다. 킬레이트제는 이 경우 탈염 과정이 느리고 부드러워 많은 절차(예: in situ hybridization, immunostaining)에서 요구하는 대로 고품질 형태를 유지하고 유전자 및 단백질 정보를 보존할 수 있기 때문에 연구 응용 분야에 가장 많이 사용되고 적합합니다. 그러나 유전자 발현 분석과 같이 전체 전사체를 보존해야 하는 경우 느리고 부드러운 탈염조차도 해로울 수 있습니다. 따라서 조직의 형태학적 분석이 세포의 유전자 발현 분석과 쌍을 이룰 필요가 있는 경우 더 나은 접근 방식과 방법이 필요합니다.
최근 단세포 RNA 염기서열분석(scRNA-seq) 및 공간 전사체학(spatial transcriptomics)의 개선 덕분에, 이제 포르말린 고정 파라핀 매매(FFPE)를 사용하여 조직 샘플을 보관한 경우에도 조직 샘플의 유전자 발현을 연구할 수 있습니다 6,7,8. 이 기회를 통해 전 세계 조직 은행에 보관된 것과 같은 더 많은 수의 샘플에 액세스할 수 있게 되었습니다. scRNA-seq를 사용하는 경우 RNA 무결성이 가장 중요한 요구 사항입니다. 그러나 FFPE 샘플의 공간 전사체학의 경우 각 조직 절편의 조직학적 맥락 내에서 유전자 발현을 시각화하기 위해 고품질 조직 절편과 고품질 RNA가 모두 필요합니다. 이것은 연조직에서는 쉽게 달성될 수 있지만 뼈와 같은 단단한 조직에서는 동일하게 말할 수 없습니다. 사실, 우리가 아는 한, 공간 전사체학을 사용한 연구는 FFPE 뼈 샘플에 대해 수행된 적이 없습니다. 이는 RNA 함량을 보존하면서 FFPE 뼈 조직을 효과적으로 처리할 수 있는 프로토콜이 없기 때문입니다. 여기에서는 RNA 분해를 피하면서 갓 얻은 뼈 조직 샘플을 처리하고 석회질을 제거하는 방법을 먼저 제공합니다. 그런 다음 전 세계 조직 은행에서 수집된 FFPE 샘플의 전사체학 분석의 필요성을 인식하여 탈염되지 않은 뼈의 FFPE 샘플을 적절하게 취급하기 위한 개발된 지침도 제시됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서는 석회질이 제거된 뼈의 FFPE 블록을 준비하고 염기서열분석(즉, 차세대 염기서열분석(NGS)) 또는 기타 RNA 관련 기술( 즉, in situ hybridization, 정량적 역전사 중합효소연쇄반응(qRT-PCR) 등)을 위해 RNA 무결성을 보존하기 위한 자세한 방법을 제공합니다.
이 방법은 EDTA를 사용하여 뼈 조직 샘플을 석회질화합니다. EDTA 배양은 샘플의 느리지만 미세한 탈염을 가능하게 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 Pittsburgh Cure Sarcoma (PCS)와 Osteosarcoma Institute (OSI)의 기금으로 지원되었습니다.
Materials
| Advanced orbital shaker | VWR | 76683-470 | Use to keep tissues under agitation during incubation as reported in the method instructions. |
| Camel Hair Brushes | Ted Pella | 11859 | Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines. |
| Dual Index Kit TS Set A 96 rxns | 10X Genomics | PN-1000251 | Use to perform spatial transcriptomics. |
| Ethanol 200 Proof | Decon Labs Inc | 2701 | Use to perform tissue dehydration as reported in the method instructions. |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (EDTA) | Thermo Fisher Scientific | S312-500 | Use to prepare EDTA 20% pH 8.0. |
| Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines. |
| Fisherbrand Fine Precision Probe | Fisher Scientific | 12-000-153 | Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines. |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Use to attach sectioned scrolls as reported in the guidelines. |
| High profile diamond microtome blades | CL Sturkey | D554DD | Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines. |
| Novaseq 150PE | Novogene | N/A | Sequencer. |
| Paraformaldehyde (PFA) 32% Aqueous Solution EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Dilute to final concentration of 4% with 1x PBS to perform tissue fixation. |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | Ready to use. Use to dilute PFA and to perform washes as reported in the method instructions. |
| Premiere Tissue Floating Bath | Fisher Scientific | A84600061 | Use to remove wrinkles from FFPE sections as reported in the guidelines. |
| RNase AWAY Surface Decontaminant | Thermo Fisher Scientific | 7002 | Use to clean all surfaces as reported in the method instructions. |
| RNeasy DSP FFPE Kit | Qiagen | 73604 | Use to isolate RNA from FFPE sections once they have been generated as reported in the guidelines. |
| Semi-Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | RM2245 | Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines. |
| Sodium hydroxide | Millipore Sigma | S8045-500 | Prepare 10 N solution by slowly dissolving 400 g in 1 liter of Milli-Q water. |
| Space Ranger | 10X Genomics | 2.0.1 | Use to process sequencing data output . |
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems | 39601006 | Use to perform tissue infliltration and embedding as reported in the method instructions. |
| Visium Accessory Kit | 10X Genomics | PN-1000194 | Use to perform spatial transcriptomic experiments. |
| Visium Human Transcriptome Probe Kit Small | 10X Genomics | PN-1000363 | Use to perform spatial transcriptomic experiments. |
| Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns | 10X Genomics | PN-1000188 | Use to place the sections if performing spatial transcriptomic experiments. |
| Xylene | Leica Biosystems | 3803665 | Use to perform tissue clearing as reported in the method instructions. |
References
- Baig, M. A., Bacha, D. . Histology. Bone. , (2024).
- Currey, J. D. The mechanical consequences of variation in the mineral content of bone. J Biomech. 2 (1), 1-11 (1969).
- Goldschlager, T., Abdelkader, A., Kerr, J., Boundy, I., Jenkin, G. Undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis. J Vis Exp. (35), e1707 (2010).
- Wallington, E. A. . Histological Methods for Bone. , (1972).
- Callis, G. M., Sterchi, D. L. Decalcification of bone: Literature review and practical study of various decalcifying agents. methods, and their effects on bone histology. J Histotechnol. 21 (1), 49-58 (1998).
- Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. The utilization of formalin fixed-paraffin-embedded specimens in high throughput genomic studies. Int J Genomics. 2017, 1926304 (2017).
- Trinks, A., et al. Robust detection of clinically relevant features in single-cell RNA profiles of patient-matched fresh and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) lung cancer tissue. Cell Oncol (Dordr). , (2024).
- Xu, Z., et al. High-throughput single nucleus total RNA sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded tissues by snRandom-seq. Nat Commun. 14 (1), 2734 (2023).
- 10x Genomics. Visium Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE – User Guide., Document Number C CG000407 Rev C. 10x Genomics. , (2021).
- 10x Genomics. Interpreting Space Ranger Web Summary Files for Visium Spatial Gene Expression for FFPE F FFPEAssay., Document Number CG000499 Rev A. 10x Genomics. , (2022).
- 10x Genomics. Visium Spatial Gene Expression for FFPE-Tissue Preparation Guide., Document Number C G CG000408 Rev D. 10x Genomics. , (2022).
