Metodi per abilitare la trascrittomica spaziale dei tessuti ossei
Summary
Qui descriviamo un metodo che consente la decalcificazione dei tessuti ossei appena ottenuti e la conservazione di RNA di alta qualità. Viene inoltre illustrato un metodo per il sezionamento di campioni FFPE (Formalin Fixed Paraffin Embedded) di ossa non demineralizzate per ottenere risultati di buona qualità se i tessuti freschi non sono disponibili o non possono essere raccolti.
Abstract
Comprendere la relazione tra le cellule e la loro posizione all’interno di ciascun tessuto è fondamentale per scoprire i processi biologici associati al normale sviluppo e alla patologia della malattia. La trascrittomica spaziale è un potente metodo che consente l’analisi dell’intero trascrittoma all’interno di campioni di tessuto, fornendo così informazioni sull’espressione genica cellulare e sul contesto istologico in cui risiedono le cellule. Sebbene questo metodo sia stato ampiamente utilizzato per molti tessuti molli, la sua applicazione per l’analisi di tessuti duri come l’osso è stata impegnativa. La sfida principale risiede nell’incapacità di preservare l’RNA di buona qualità e la morfologia dei tessuti durante l’elaborazione dei campioni di tessuto duro per il sezionamento. Pertanto, qui viene descritto un metodo per elaborare campioni di tessuto osseo appena ottenuti per generare efficacemente dati di trascrittomica spaziale. Il metodo consente la decalcificazione dei campioni, garantendo sezioni di tessuto di successo con dettagli morfologici preservati ed evitando la degradazione dell’RNA. Inoltre, vengono fornite linee guida dettagliate per i campioni precedentemente inclusi in paraffina, senza demineralizzazione, come i campioni raccolti dalle banche dei tessuti. Utilizzando queste linee guida, vengono mostrati dati di trascrittomica spaziale di alta qualità generati da campioni di banche di tessuti di tumore primario e metastasi polmonari dell’osteosarcoma osseo.
Introduction
L’osso è un tessuto connettivo specializzato composto principalmente da fibre di collagene di tipo 1 e sali inorganici1. Di conseguenza, l’osso è incredibilmente forte e rigido pur essendo allo stesso tempo leggero e resistente ai traumi. La grande forza dell’osso deriva dal suo contenuto di minerali. Infatti, per ogni dato aumento della percentuale di contenuto di minerali, la rigidità aumenta di cinque volte2. Di conseguenza, i ricercatori si trovano di fronte a problemi significativi quando analizzano, mediante sezionamento istologico, la biologia di un campione osseo.
L’istologia ossea non decalcificata è fattibile e talvolta richiesta, a seconda del tipo di indagine (ad esempio, per studiare la microarchitettura dell’osso); È, tuttavia, molto impegnativo, soprattutto se gli esemplari sono di grandi dimensioni. In questi casi, il processamento tissutale a fini istologici richiede diverse modifiche dei protocolli e delle tecniche standard3. In generale, per eseguire le comuni valutazioni istologiche, i tessuti ossei vengono decalcificati subito dopo la fissazione, un processo che può richiedere da alcuni giorni a diverse settimane, a seconda delle dimensioni del tessuto e dell’agente decalcificante utilizzato4. Le sezioni decalcificate sono spesso utilizzate per l’esame del midollo osseo, la diagnosi di tumori, ecc. Esistono tre tipi principali di agenti decalcificanti: acidi forti (ad es. acido nitrico, acido cloridrico), acidi deboli (ad es. acido formico) e agenti chelanti (ad es. acido etilendiamminotetracetico o EDTA)5. Gli acidi forti possono decalcificare l’osso molto rapidamente, ma possono danneggiare i tessuti; gli acidi deboli sono molto comuni e adatti per le procedure diagnostiche; Gli agenti chelanti sono di gran lunga i più utilizzati e appropriati per l’applicazione della ricerca poiché, in questo caso, il processo di demineralizzazione è lento e delicato, consentendo il mantenimento di una morfologia di alta qualità e la conservazione delle informazioni geniche e proteiche, come richiesto da molte procedure (ad esempio, ibridazione in situ , immunocolorazione). Tuttavia, quando l’intero trascrittoma deve essere preservato, ad esempio per le analisi dell’espressione genica, anche una demineralizzazione lenta e delicata può essere dannosa. Pertanto, sono necessari approcci e metodi migliori quando l’analisi morfologica dei tessuti deve essere abbinata all’analisi dell’espressione genica delle cellule.
Grazie ai recenti miglioramenti nel sequenziamento dell’RNA a singola cellula (scRNA-seq) e nella trascrittomica spaziale, è ora possibile studiare l’espressione genica di un campione di tessuto anche quando l’inclusione di paraffina per fissazione in formalina (FFPE) è stata utilizzata per conservare i campioni di tessuto 6,7,8. Questa opportunità ha permesso di accedere a un numero maggiore di campioni, come quelli conservati nelle banche dei tessuti di tutto il mondo. Se lo scRNA-seq deve essere impiegato, l’integrità dell’RNA è il requisito più importante; tuttavia, nel caso della trascrittomica spaziale di campioni FFPE, sono necessarie sia sezioni di tessuto di alta qualità che RNA di alta qualità per visualizzare l’espressione genica nel contesto istologico di ciascuna sezione di tessuto. Mentre questo è stato facilmente ottenuto con i tessuti molli, lo stesso non si può dire per i tessuti duri come le ossa. Infatti, per quanto ne sappiamo, nessuno studio che utilizzi la trascrittomica spaziale è mai stato condotto su campioni ossei FFPE. Ciò è dovuto alla mancanza di protocolli in grado di elaborare efficacemente i tessuti ossei FFPE preservandone il contenuto di RNA. In questo caso, viene fornito prima un metodo per elaborare e decalcificare i campioni di tessuto osseo appena ottenuti, evitando la degradazione dell’RNA. Quindi, riconoscendo la necessità di un’analisi trascrittomica dei campioni FFPE raccolti nelle banche dei tessuti di tutto il mondo, vengono presentate anche le linee guida sviluppate per gestire correttamente i campioni FFPE di ossa non demineralizzate.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, viene fornito un metodo dettagliato per preparare blocchi FFPE di ossa decalcificate e preservare l’integrità dell’RNA per il sequenziamento (ad esempio, sequenziamento di nuova generazione (NGS)) o per altre tecniche correlate all’RNA (ad esempio, ibridazione in situ , reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR), ecc.).
Il metodo utilizza l’EDTA per decalcificare campioni di tessuto osseo; l’incubazione con EDTA consente una demineralizzazio…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi del Pittsburgh Cure Sarcoma (PCS) e dell’Osteosarcoma Institute (OSI).
Materials
| Advanced orbital shaker | VWR | 76683-470 | Use to keep tissues under agitation during incubation as reported in the method instructions. |
| Camel Hair Brushes | Ted Pella | 11859 | Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines. |
| Dual Index Kit TS Set A 96 rxns | 10X Genomics | PN-1000251 | Use to perform spatial transcriptomics. |
| Ethanol 200 Proof | Decon Labs Inc | 2701 | Use to perform tissue dehydration as reported in the method instructions. |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (EDTA) | Thermo Fisher Scientific | S312-500 | Use to prepare EDTA 20% pH 8.0. |
| Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines. |
| Fisherbrand Fine Precision Probe | Fisher Scientific | 12-000-153 | Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines. |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Use to attach sectioned scrolls as reported in the guidelines. |
| High profile diamond microtome blades | CL Sturkey | D554DD | Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines. |
| Novaseq 150PE | Novogene | N/A | Sequencer. |
| Paraformaldehyde (PFA) 32% Aqueous Solution EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Dilute to final concentration of 4% with 1x PBS to perform tissue fixation. |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | Ready to use. Use to dilute PFA and to perform washes as reported in the method instructions. |
| Premiere Tissue Floating Bath | Fisher Scientific | A84600061 | Use to remove wrinkles from FFPE sections as reported in the guidelines. |
| RNase AWAY Surface Decontaminant | Thermo Fisher Scientific | 7002 | Use to clean all surfaces as reported in the method instructions. |
| RNeasy DSP FFPE Kit | Qiagen | 73604 | Use to isolate RNA from FFPE sections once they have been generated as reported in the guidelines. |
| Semi-Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | RM2245 | Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines. |
| Sodium hydroxide | Millipore Sigma | S8045-500 | Prepare 10 N solution by slowly dissolving 400 g in 1 liter of Milli-Q water. |
| Space Ranger | 10X Genomics | 2.0.1 | Use to process sequencing data output . |
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems | 39601006 | Use to perform tissue infliltration and embedding as reported in the method instructions. |
| Visium Accessory Kit | 10X Genomics | PN-1000194 | Use to perform spatial transcriptomic experiments. |
| Visium Human Transcriptome Probe Kit Small | 10X Genomics | PN-1000363 | Use to perform spatial transcriptomic experiments. |
| Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns | 10X Genomics | PN-1000188 | Use to place the sections if performing spatial transcriptomic experiments. |
| Xylene | Leica Biosystems | 3803665 | Use to perform tissue clearing as reported in the method instructions. |
References
- Baig, M. A., Bacha, D. . Histology. Bone. , (2024).
- Currey, J. D. The mechanical consequences of variation in the mineral content of bone. J Biomech. 2 (1), 1-11 (1969).
- Goldschlager, T., Abdelkader, A., Kerr, J., Boundy, I., Jenkin, G. Undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis. J Vis Exp. (35), e1707 (2010).
- Wallington, E. A. . Histological Methods for Bone. , (1972).
- Callis, G. M., Sterchi, D. L. Decalcification of bone: Literature review and practical study of various decalcifying agents. methods, and their effects on bone histology. J Histotechnol. 21 (1), 49-58 (1998).
- Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. The utilization of formalin fixed-paraffin-embedded specimens in high throughput genomic studies. Int J Genomics. 2017, 1926304 (2017).
- Trinks, A., et al. Robust detection of clinically relevant features in single-cell RNA profiles of patient-matched fresh and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) lung cancer tissue. Cell Oncol (Dordr). , (2024).
- Xu, Z., et al. High-throughput single nucleus total RNA sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded tissues by snRandom-seq. Nat Commun. 14 (1), 2734 (2023).
- 10x Genomics. Visium Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE – User Guide., Document Number C CG000407 Rev C. 10x Genomics. , (2021).
- 10x Genomics. Interpreting Space Ranger Web Summary Files for Visium Spatial Gene Expression for FFPE F FFPEAssay., Document Number CG000499 Rev A. 10x Genomics. , (2022).
- 10x Genomics. Visium Spatial Gene Expression for FFPE-Tissue Preparation Guide., Document Number C G CG000408 Rev D. 10x Genomics. , (2022).
