Valutazione del recupero funzionale dell'attività del diaframma eupneico dopo emisezione unilaterale del midollo spinale cervicale nei ratti

Ci sono più di 300.000 individui con lesione del midollo spinale (SCI) negli Stati Uniti, circa la metà dei quali ha lesioni cervicali¹. Queste lesioni provocano una significativa perdita di benessere e mettono a dura prova gli individui, le loro famiglie e il sistema sanitario. Fortunatamente, la maggior parte delle lesioni del midollo spinale sono incomplete, fornendo il potenziale per il rafforzamento dei percorsi risparmiati¹. Questa neuroplasticità può consentire il recupero di almeno alcune funzioni, inclusa l’attività DIAm, che è importante per i comportamenti ventilatori e non ventilatori. Pertanto, la promozione della neuroplasticità è una strada promettente di ricerca per aiutare le persone con lesione^{midollare 2}.

I modelli di roditori di lesione midollare hanno il potenziale per contribuire in modo sostanziale alla scoperta di trattamenti per migliorare la salute umana. Uno dei modelli classici di LM utilizzati per studiare la neuroplasticità è una transezione unilaterale (emisezione) del midollo spinale a C₂ (C₂SH), che lascia intatto il lato controlaterale ^{3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13}. L’effetto del C₂SH sulla produzione frenica e l’importanza di risparmiare le vie controlaterali sono state rivelate per la prima volta oltre cento anni fa da Porter¹², il cui articolo seminale ha gettato le basi per gli studi moderni sulla neuroplasticità respiratoria. Il modello C₂SH interrompe gli input discendenti dal gruppo respiratorio ventrale rostrale (rVRG) nel midollo, che contiene i neuroni premotori responsabili della trasmissione dell’output della generazione del ritmo respiratorio¹⁴. Questi neuroni premotori rVRG trasmettono anche l’impulso neurale eccitatorio ai motoneuroni frenici (Figura 1). Diversi ricercatori hanno adottato approcci diversi al modello C₂SH 10,11,15,16, il che può in parte spiegare parte della variabilità nel recupero tra gli studi. In breve, gli approcci variano in termini di risparmio dei funicoli dorsali, esecuzione di un’emisezione completa o esecuzione di una transezione parziale laterale che non interrompa completamente gli input discendenti dall’rVRG omolaterale. In generale, i modelli C₂SH sono particolarmente utili per lo studio della neuroplasticità respiratoria a causa dei tassi di recupero spontaneo dell’attività elettromiografica (EMG) dell’iDIAm eupneica nel tempo, che può essere migliorata da diversi fattori, tra cui la segnalazione neurotrofica 17,18,19,20,21. Tuttavia, una perdita iniziale di funzione, definita come il silenziamento dell’attività eupneica iDIAm EMG, deve essere stabilita prima che il recupero possa essere chiaramente classificato. Questa convalida dell’inattività al momento del C₂SH non viene effettuata in diversi studi 3,4,6,7,11,22,23.

Le valutazioni istologiche del midollo spinale asportato forniscono solo l’evidenza di un danno alla posizione appropriata delle vie bulbospinali eccitatorie omolaterali che innervano i motoneuroni frenici nel midollo spinale, ma l’istologia non sostituisce l’evidenza fisiologica (ad esempio, DIAm EMG). Inoltre, le valutazioni istologiche vengono eseguite in ex vivo in momenti terminali (spesso da diverse settimane a mesi dopo l’infortunio) e non forniscono informazioni “in tempo reale”. Alcuni ricercatori hanno notato che l’entità della lesione è correlata alla quantità di deficit funzionale o alla sua mancanza 5,24,25,26. È importante notare che la validità di tali affermazioni dipende probabilmente fortemente da come viene classificata la “funzione” (cioè, quali sono i compiti funzionali e come vengono quantificati), e la variabilità tra gli studi evidenzia la difficoltà di produrre lesioni funzionalmente identiche tra gli animali. In effetti, i ricercatori hanno sottolineato che la relazione tra l’entità della lesione e la funzione locomotoria dei muscoli degli arti (quantificata dal punteggio di Basso, Beattie e Bresnahan (BBB)²⁴) non è lineare^27,28. In studi precedenti, non abbiamo trovato alcuna relazione tra l’entità del C₂SH e l’entità del recupero dell’attività EMG eupneica iDIAm post-lesione 10,29,30,31, sebbene altri ricercatori abbiano riportato una relazione tra la funzione ventilatoria e l’entità della sostanza bianca che risparmia ⁵. Pertanto, nel caso del modello C₂SH, un approccio per la convalida funzionale dell’inattività di iDIAm al momento dell’intervento chirurgico e preferibilmente all’inizio del decorso temporale degli esperimenti di lesione cronica del midollo spinale è sia vantaggioso che necessario.

Il presente articolo sottolinea l’uso di DIAm EMG per la conferma in tempo reale della perdita iniziale di DIAm EMG durante la respirazione dopo il C₂SH, nonché per successive valutazioni di conferma a 3 giorni (Giorno 3) dopo l’infortunio 18,21,31,32,33. In precedenti lavori con il modello C₂SH, sono state eseguite laparotomie ripetute per registrare DIAm EMG 10,13,30,34. Tuttavia, lavori più recenti hanno utilizzato elettrodi EMG cronici, che consentono la registrazione dell’EMG in ratti anestetizzati e svegli. Inoltre, gli elettrodi cronici riducono il rischio di pneumotorace e non richiedono laparotomie ripetute, che possono causare l’inibizione del DIAm ^35,36. Sebbene le versioni del modello C₂SH siano state utilizzate da molti ricercatori, la conferma del silenziamento dell’attività di iDIAm non è stata fatta al momento dell’intervento^chirurgico 3,4,6,7,11,22,23. Senza una tale conferma di inattività, è difficile sapere quale parte del successivo recupero attribuire alla neuroplasticità delle vie omolaterali rispetto a quelle controlaterali, che possono avere impatti differenziali. Questa è una considerazione importante perché l’unità neurale inspiratoria dall’rVRG ai motoneuroni frenici è principalmente omolaterale, con una perdita di circa il 50% degli input glutammatergici eccitatori ai motoneuroni frenici dopo C₂SH³³. Tuttavia, ci sono rimanenti input eccitatori inspiratori dall’rVRG controlaterale che decussano al di sotto del sito della lesione per innervare i motoneuroni frenici omolaterali e possono essere rafforzati attraverso la neuroplasticità per promuovere il recupero funzionale. Rimuovendo l’input eccitatorio omolaterale predominante ai motoneuroni frenici, l’attività eupneica dell’iDIAm EMG viene persa (almeno sotto anestesia), mentre l’attività del cDIAm continua e viene persino migliorata. La perdita di attività dell’iDIAm EMG durante la respirazione è quindi una misura del successo di un C₂SH (Figura 2).

Un certo livello di attività EMG iDIAm è presente già 1-4 giorni dopo C₂SH negli animali svegli^23,37. Inoltre, negli animali decerebrati, l’attività di iDIAm è presente da pochi minuti a ore dopo l’emisezione cervicale superiore ed è soppressa dall’anestesia³⁸. Inoltre, il successo del C₂SH è convalidato dalla conferma dell’assenza di attività EMG iDIAm durante la respirazione (eupnea) nei ratti anestetizzati il giorno 3 dopo l’infortunio. Studi di imaging confocale hanno confermato la perdita di input sinaptici glutammatergici sui motoneuroni frenici durante questa fase iniziale della lesione³⁷. Al 3° giorno dopo l’infortunio, se c’è una qualsiasi attività EMG eupneica residua, questa viene interpretata come prova di rimozione incompleta dell’unità inspiratoria discendente omolaterale dall’rVRG. Il presente articolo è diviso in tre sezioni: (1) registrazioni croniche di DIAm EMG, (2) C₂SH e (3) acquisizione di dati EMG in animali svegli e anestetizzati. Questo protocollo descrive un modello C₂SH rigoroso, riproducibile e affidabile di cSCI nei ratti, che è un’eccellente piattaforma per lo studio della neuroplasticità respiratoria, dell’attività compensatoria del cDIAm e delle strategie terapeutiche e farmaceutiche.