Summary

Modélisation in vitro du dépôt de graisse dans la maladie hépatique stéatotique associée à un dysfonctionnement métabolique

Published: July 19, 2024
doi:

Summary

Cet article décrit l’utilisation de cellules HepG2 induites par l’acide oléique comme modèle de maladie hépatique stéatotique associée à un dysfonctionnement métabolique.

Abstract

La prévalence de la maladie hépatique stéatotique associée à un dysfonctionnement métabolique (MASLD) a augmenté en raison de changements dans les modèles économiques et de mode de vie, entraînant d’importants problèmes de santé. Des rapports antérieurs ont étudié l’établissement de modèles animaux et cellulaires pour la MASLD, mettant en évidence les différences entre eux. Dans cette étude, un modèle cellulaire a été créé en induisant l’accumulation de graisse dans le MASLD. Les cellules HepG2 ont été stimulées avec l’acide oléique, un acide gras insaturé, à diverses concentrations (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) pour émuler le MASLD. L’efficacité du modèle a été évaluée à l’aide de tests du kit de comptage cellulaire 8, de la coloration Oil Red O et de l’analyse de la teneur en lipides. Cette étude visait à créer un modèle cellulaire simple à utiliser pour les cellules MASLD. Les résultats des tests du kit de comptage cellulaire 8 ont montré que la survie des cellules HepG2 dépendait de la concentration d’acide oléique, avec un IG50 de 1,875 mM. La viabilité cellulaire dans les groupes 0,5 mM et 1 mM était significativement plus faible que dans le groupe témoin (P < 0,05). De plus, la coloration au rouge d’huile O et l’analyse de la teneur en lipides ont examiné les dépôts de graisse à diverses concentrations d’acide oléique (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) sur les cellules HepG2. La teneur en lipides des groupes 0,25 mM, 0,5 mM et 1 mM était significativement plus élevée que celle du groupe témoin (P < 0,05). De plus, les taux de triglycérides dans les groupes OA étaient significativement plus élevés que ceux du groupe témoin (P < 0,05).

Introduction

La maladie hépatique stéatotique associée à un dysfonctionnement métabolique (MASLD) englobe une gamme d’affections, notamment la stéatose simple, la stéatohépatite non alcoolique (NASH), la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire 1,2,3,4,5,6, toutes attribuées à des facteurs autres que la consommation d’alcool 7. La MASLD est la maladie hépatique la plus répandue causée par des lésions métaboliques du foie, affectant près d’un quart de la population mondiale 8,9,10,11,12. Bien que la pathogenèse précise de la MASLD n’ait pas encore été élucidée, diverses théories tentent d’expliquer son développement. Une notion dominante suggère un abandon de la théorie classique des « deux coups » vers un modèle « à coups multiples »1. Au cœur de ces hypothèses se trouve le rôle de la résistance à l’insuline, qui serait essentielle dans la pathogenèse de la MASLD13. La recherche indique que la résistance à l’insuline dans les hépatocytes entraîne une augmentation des niveaux d’acides gras libres, formant par la suite des triglycérides stockés dans le foie14,15.

Les chercheurs ont utilisé des modèles in vivo et in vitro pour simuler le dépôt de graisse dans le MASLD ; Pourtant, reproduire pleinement son mécanisme pathologique reste un défi. Malgré cette limitation, ces modèles ont joué un rôle déterminant dans l’étude de cibles thérapeutiques potentielles pour la MASLD. Cependant, le développement d’un modèle stable de MASLD est crucial. Bien que les modèles animaux soient efficaces, ils prennent du temps et coûtent cher, ce qui souligne l’intérêt croissant pour les modèles cellulaires in vitro . Ces modèles utilisent souvent un ou plusieurs acides gras libres tels que l’acide oléique (OA) et l’acide palmitique pour recréer le MASLD induit par l’alimentation. Parmi ceux-ci, la lignée cellulaire de l’hépatoblastome humain HepG2 est souvent utilisée pour établir des modèles cellulaires in vitro de MASLD.

L’induction de l’OA stimule les cellules HepG2 à répliquer le dépôt graisseux semblable à la MASLD, une méthode dont l’histoire est bien établie. Le but de cette étude était de démontrer la viabilité, la coloration au rouge d’huile (ORO), la teneur en lipides et le taux de triglycérides (TG) des cellules HepG2 traitées avec 0,25 mM d’OA. L’objectif de cette expérience était de fournir des preuves supplémentaires pour le développement d’études de modélisation MAFLD.

Protocol

REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, instruments et réactifs utilisés dans ce protocole. 1. Culture cellulaire Cultiver des cellules HepG2 dans des flacons de culture contenant du milieu modifié Eagle de Dulbecco (DMEM) (contenant 10 % de sérum de bovin fœtal, 100 unités/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine). Maintenir les flacons de culture à 37 °C dans un incubateur à 5 % de …

Representative Results

Effet de l’acide oléique sur la viabilité cellulaireLes cellules HepG2 ont été exposées à des concentrations variables d’OA (0 mM, 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM), ce qui a entraîné une diminution des taux de survie cellulaire à 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM et 1 mM par rapport à 0 mM. Une signification statistique a été observée à 0,5 mM (P < 0,05) et 1 mM (P < 0,05) par rapport à 0 mM. Les résultats de l’impact de l’OA sur la viabilité cellulaire, tels qu’?…

Discussion

Le MASLD est un syndrome clinicopathologique caractérisé par un dépôt excessif de graisse intracellulaire dans les hépatocytes en raison de facteurs autres que l’alcool et d’autres agents hépatiques établis18. Le MASLD est étroitement lié au stress métabolique acquis, aux lésions hépatiques, notamment associées à la résistance à l’insuline et à la susceptibilité génétique. Pour étudier et dépister efficacement les médicaments pour la MASLD, il est crucial de sélection…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

L’étude actuelle a été financée par « Étude sur les questions clés de l’effet curatif de Koumiss sur les maladies régionales de la médecine mongole » en 2018 Projet soutenu du programme de science et de technologie du Département de la science et de la technologie de la région autonome de Mongolie intérieure.

Materials

0.22 µm filter Millex
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Trypsin-EDTA Gibco 25200-056
0.45 µm filter Millex
2 mL Crygenic Vials CORNING 430659
25 cm2 Cell Culture Flask CORNING 430639
6-well cell culture plate CORNING 3516
96-well cell culture plate CORNING 3599
Blood Count Plate Shanghai Jing Jing Biochemical Reagent & Instrument Co. 02270113
Cell Counting Kit-8 assays Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.  CA1210-1000T
CO2 incubator NUAIRE NU-5710E
 DMSO Dimethyl sulfoxide  Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.  D8371
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco 8122691
Enzyme Labeling Equipment Tecan Spark
Fetal Bovine Serum, Qualified Gibco 10099141
HepG2 cells line Beijing North China Chuanglian Biotechnology Research Institute (BNCC) 221031
Human Triglyceride (TG) ELISA instruction Nanjing Jiacheng Bioengineering Institute 20170301
Inverted Microscope for Cell Culture Leica DMi1 
Isopropanol Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co. 2021030141
Oil Red Stain Kit, For Cultured Cells Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.  G1262
Oleic acid  Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. A502071
Penicillin Streptomycin Gibco 15140122
SPSS 24.0 Statistics software

References

  1. Alisi, A., Feldstein, A. E., Villani, A., Raponi, M. Pediatric nonalcoholic fatty liver disease: a multidisciplinary approach. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9 (3), 152-161 (2012).
  2. Anania, C., Perla, F. M., Olivero, F., Pacifico, L., Chiesa, C. Mediterranean diet and nonalcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 24 (19), 2083-2094 (2018).
  3. Bessone, F., Razori, M. V., Roma, M. G. Molecular pathways of nonalcoholic fatty liver disease development and progression. Cell Mol Life Sci. 76 (1), 99-128 (2019).
  4. Katsiki, N., Mikhailidis, D. P., Mantzoros, C. S. Non-alcoholic fatty liver disease and dyslipidemia: An update. Metabolism. 65 (8), 1109-1123 (2016).
  5. European Association for the Study of the Liver (EASL). EASL-EASD-EASO Clinical Practice Guidelines for the Management of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease. Obes Facts. 9 (2), 65-90 (2016).
  6. Chalasani, N., et al. The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).
  7. Díaz, L. A., Arab, J. P., Louvet, A., Bataller, R., Arrese, M. The intersection between alcohol-related liver disease and nonalcoholic fatty liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 20 (12), 764-783 (2023).
  8. Cotter, T. G., Rinella, M. Nonalcoholic fatty liver disease 2020: The state of the disease. Gastroenterology. 158 (7), 1851-1864 (2020).
  9. Lonardo, A., et al. Metabolic mechanisms for and treatment of NAFLD or NASH occurring after liver transplantation. Nat Rev Endocrinol. 18 (10), 638-650 (2022).
  10. Papatheodoridi, M., Cholongitas, E. Diagnosis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD): Current concepts. Curr Pharm Des. 24 (38), 4574-4586 (2018).
  11. Van Herck, M. A., Vonghia, L., Francque, S. M. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease-a starter’s guide. Nutrients. 9 (10), 1072 (2017).
  12. Wieckowska, A., Feldstein, A. E. Diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease: invasive versus noninvasive. Semin Liver Dis. 28 (4), 386-395 (2008).
  13. Stein, L. L., Dong, M. H., Loomba, R. Insulin sensitizers in nonalcoholic fatty liver disease and steatohepatitis: Current status. Adv Ther. 26 (10), 893-907 (2009).
  14. Milić, S., Lulić, D., Štimac, D. Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: biochemical, metabolic and clinical presentations. World J Gastroenterol. 20 (28), 9330-9337 (2014).
  15. Neuschwander-Tetri, B. A., Caldwell, S. H. Nonalcoholic steatohepatitis: summary of an AASLD Single Topic Conference. Hepatology. 37 (5), 1202-1219 (2003).
  16. Du, J., Zhao, L., Kang, Q., He, Y., Bi, Y. An optimized method for Oil Red O staining with the salicylic acid ethanol solution. Adipocyte. 12 (1), 2179334 (2023).
  17. Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by Oil Red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nat Protoc. 8 (6), 1149-1154 (2013).
  18. Estes, C., Razavi, H., Loomba, R., Younossi, Z., Sanyal, A. J. Modeling the epidemic of nonalcoholic fatty liver disease demonstrates an exponential increase in burden of disease. Hepatology. 67 (1), 123-133 (2018).
  19. Watkins, P. A., Ellis, J. M. Peroxisomal acyl-CoA synthetases. Biochim Biophys Acta. 1822 (9), 1411-1420 (2012).
  20. Heeren, J., Scheja, L. Metabolic-associated fatty liver disease and lipoprotein metabolism. Mol Metab. 50, 101238 (2021).
  21. Kim, S. H., et al. Effect of isoquercitrin on free fatty acid-induced lipid accumulation in HepG2 cells. Molecules. 28 (3), 1476 (2023).
  22. Lee, M. R., Yang, H. J., Park, K. I., Ma, J. Y. Lycopus lucidus Turcz. ex Benth. attenuates free fatty acid-induced steatosis in HepG2 cells and non-alcoholic fatty liver disease in high-fat diet-induced obese mice. Phytomedicine. 55, 14-22 (2019).
  23. Li, J., et al. Hesperetin ameliorates hepatic oxidative stress and inflammation via the PI3K/AKT-Nrf2-ARE pathway in oleic acid-induced HepG2 cells and a rat model of high-fat diet-induced NAFLD. Food Funct. 12 (9), 3898-3918 (2021).
  24. Li, Y., et al. Protopanaxadiol ameliorates NAFLD by regulating hepatocyte lipid metabolism through AMPK/SIRT1 signaling pathway. Biomed Pharmacother. 160, 114319 (2023).
  25. Liu, H., et al. Zeaxanthin prevents ferroptosis by promoting mitochondrial function and inhibiting the p53 pathway in free fatty acid-induced HepG2 cells. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1868 (4), 159287 (2023).
  26. Mun, J., et al. Water extract of Curcuma longa L. ameliorates non-alcoholic fatty liver disease. Nutrients. 11 (10), 2536 (2019).
  27. Park, M., Yoo, J. H., Lee, Y. S., Lee, H. J. Lonicera caerulea extract attenuates non-alcoholic fatty liver disease in free fatty acid-induced HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Nutrients. 11 (3), 494 (2019).
  28. Xia, H., et al. Alpha-naphthoflavone attenuates non-alcoholic fatty liver disease in oleic acid-treated HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Biomed Pharmacother. 118, 109287 (2019).
  29. Alkhatatbeh, M. J., Lincz, L. F., Thorne, R. F. Low simvastatin concentrations reduce oleic acid-induced steatosis in HepG(2) cells: An in vitro model of non-alcoholic fatty liver disease. Exp Ther Med. 11 (4), 1487-1492 (2016).
  30. Cui, W., Chen, S. L., Hu, K. Q. Quantification and mechanisms of oleic acid-induced steatosis in HepG2 cells. Am J Transl Res. 2 (1), 95-104 (2010).
  31. Guo, X., Yin, X., Liu, Z., Wang, J. Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) pathogenesis and natural products for prevention and treatment. Int J Mol Sci. 23 (24), 15489 (2022).
  32. Rafiei, H., Omidian, K., Bandy, B. Dietary polyphenols protect against oleic acid-induced steatosis in an in vitro model of NAFLD by modulating lipid metabolism and improving mitochondrial function. Nutrients. 11 (3), 541 (2019).
  33. Tie, F., et al. Kaempferol and kaempferide attenuate oleic acid-Induced lipid accumulation and oxidative stress in HepG2 cells. Int J Mol Sci. 22 (16), 8847 (2021).
  34. Fang, K., et al. Diosgenin ameliorates palmitic acid-induced lipid accumulation via AMPK/ACC/CPT-1A and SREBP-1c/FAS signaling pathways in LO2 cells. BMC Complement Altern Med. 19 (1), 255 (2019).
  35. Wu, X., et al. MLKL-dependent signaling regulates autophagic flux in a murine model of non-alcohol-associated fatty liver and steatohepatitis. J Hepatol. 73 (3), 616-627 (2020).
  36. Scavo, M. P., et al. The oleic/palmitic acid imbalance in exosomes isolated from NAFLD patients induces necroptosis of liver cells via the elongase-6/RIP-1 pathway. Cell Death Dis. 14 (9), 635 (2023).
  37. Chavez-Tapia, N. C., Rosso, N., Tiribelli, C. Effect of intracellular lipid accumulation in a new model of non-alcoholic fatty liver disease. BMC Gastroenterol. 12, 20 (2012).
  38. Ricchi, M., et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes. J Gastroenterol Hepatol. 24 (5), 830-840 (2009).

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Citer Cet Article
Bao, Q., Zhang, X., Chen, Y., Wang, T., Siqin, B. In Vitro Modeling of Fat Deposition in Metabolic Dysfunction-Associated Steatotic Liver Disease. J. Vis. Exp. (209), e66810, doi:10.3791/66810 (2024).

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