Summary

Isolement et cryoconservation de cellules mononucléées du sang périphérique humain hautement viables à partir de sang total : un guide pour les débutants

Published: October 25, 2024
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Summary

Ce protocole présente un guide accessible pour la collecte, le stockage et la décongélation des cellules mononucléées du sang périphérique, adapté aux analyses en aval et aux flux de travail tels que la cytométrie en flux et le séquençage de l’ARN. Des collections de plasma et de couche leucocytaire sont également présentées.

Abstract

Les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) sont couramment utilisées dans la recherche biomédicale sur le système immunitaire et sa réponse aux maladies et aux agents pathogènes. Ce protocole détaillé décrit l’équipement, les fournitures et les étapes permettant d’isoler, de cryoconserver et de décongeler des PBMC de haute qualité et hautement viables à partir de cellules sanguines totales adaptées à des applications en aval telles que la cytométrie en flux et le séquençage de l’ARN. Des protocoles de traitement du plasma et de la couche leucocytaire à partir du sang entier en parallèle et en même temps que les PBMC sont également décrits. Ce protocole étape par étape facile à suivre, qui utilise la centrifugation par gradient de densité pour isoler les PBMC, est accompagné d’une liste de contrôle des fournitures, de l’équipement et des étapes de préparation. Ce protocole convient aux personnes ayant une expérience préalable des techniques de laboratoire et peut être mis en œuvre dans des laboratoires cliniques ou de recherche. La viabilité cellulaire et le séquençage de l’ARN de haute qualité ont résulté de PBMC collectés par des opérateurs sans expérience préalable en laboratoire de l’utilisation de ce protocole.

Introduction

Ce protocole fait la démonstration d’une méthode et d’un flux de travail accessibles pour l’isolement des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) du sang total. Ce protocole s’adresse particulièrement aux techniciens de recherche novices, aux étudiants et au personnel de laboratoire clinique dans le but de faciliter la collecte et la cryoconservation des PBMC sans supposer une formation préalable en techniques de laboratoire.

Ce protocole utilise la centrifugation pour séparer les composants du sang total par densité. Le sang total se compose de quatre composants principaux classés par ordre décroissant de densité : les globules rouges/érythrocytes (~45 % du volume), les globules blancs (<1 % du volume), les plaquettes (<1 % du volume) et le plasma (~55 % du volume)1,2,3,4,5,6. Les globules blancs peuvent être subdivisés en deux catégories en fonction des caractéristiques de leur noyau : rond ou multinucléé6. Les PBMC sont définis comme des globules blancs à noyaux ronds et se composent des types de cellules suivants : lymphocytes (lymphocytes T, lymphocytes B, cellules NK), cellules dendritiques et monocytes6. Les globules blancs multinucléés comprennent les granulocytes, qui se composent des types de cellules suivants : neutrophiles, basophiles et éosinophiles6. Les globules blancs multinucléés sont plus denses que les PBMC6. Les densités de chaque composant du sang total sont détaillées dans le tableau 1.

Dans ce protocole, le sang total est collecté dans des tubes de centrifugation à gradient de densité. Ces tubes contiennent un milieu à gradient de densité pré-emballé qui a une densité de 1,077 g/mL. Après la centrifugation, les cellules plus denses, y compris les globules blancs multinucléés et les érythrocytes, sont séparées des PBMC et des plaquettes par le milieu à gradient de densité (Figure 1A)6,7. La PBMC et la fraction plaquettaire sont ensuite recueillies, lavées et centrifugées pour éliminer les plaquettes. Les PBMC purifiés qui en résultent sont collectés et stockés à -80 °C ou dans de l’azote liquide. Les PBMC cryoconservés peuvent être décongelés de manière viable et directement utilisés dans les analyses en aval ou traités en outre pour isoler des types de cellules constitutives spécifiques.

Ce protocole a été optimisé pour un séquençage d’ARN de haute qualité à partir de PBMC hautement viables. Dans cet article, des PBMC ont été isolés et cryoconservés chez des patients dans une clinique externe. Par la suite, les monocytes ont été isolés des PBMC par FACS et analysés par séquençage de l’ARN. Cependant, le protocole peut être largement adapté à d’autres besoins expérimentaux tels que la culture cellulaire, l’édition de gènes, les études fonctionnelles ex-vivo, les analyses de cellules uniques, le phénotypage par cytométrie en flux ou cytométrie par temps de vol, l’isolement d’ADN/ARN ou de protéines, les lames pour l’immunohistochimie, entre autres 8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18.

En plus de la collecte PBMC à partir de tubes de centrifugation à gradient de densité, ce protocole examine comment collecter le plasma et la couche leucocytaire par centrifugation à l’aide d’un tube EDTA. Après centrifugation, le sang total est séparé en plasma, en érythrocytes et en une fine couche d’interface appelée couche leucocytaire contenant des leucocytes (Figure 1B)6. La couche leucocytaire est couramment utilisée pour l’extraction de l’ADN et les analyses génomiques ultérieures19,20. La couche de plasma contient les composants acellulaires du sang total et peut être utilisée pour les tests de biomarqueurs21,22.

Protocol

Le protocole d’étude a été approuvé par le programme de protection humaine de l’UCSD et du KUMC et est conforme à la Déclaration d’Helsinki. Toutes les personnes ont donné leur consentement éclairé pour la participation et la collecte de sang. 1. Traitement et cryoconservation des PBMC La veille du prélèvement sanguin, imprimez la liste de contrôle des matériaux et des réactifs énumérés au tableau 2</st…

Representative Results

Après la collecte et la cryoconservation des PBMC, la viabilité des PBMC, des monocytes et des lymphocytes décongelés de 56 échantillons uniques a été évaluée par cytométrie en flux à l’aide des réactifs énumérés dans le tableau 4 conformément aux instructions du fabricant (figure 2A-F). Une viabilité moyenne ± SD des PBMC, des monocytes et des lymphocytes de 94 ± 4,0 %, 98 ± 1,1 % et 93 ± 5,6 %, respe…

Discussion

Ce protocole de collecte et de cryoconservation des PBMC a été mis en œuvre avec succès par des personnes avec ou sans formation préalable en laboratoire de recherche. Dans notre application, le FACS et le séquençage de l’ARN de monocytes hautement viables purifiés à partir de PBMC stockés ont permis d’obtenir des séquences de haute qualité.

L’une des principales forces de ce protocole est son accessibilité. La technique présentée dans le …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier les patients qui ont donné leur consentement, leur temps et leur don d’échantillons de sang. Nous remercions également le Dr Patrick Moriarty, Julie-Ann Dutton et Mark McClellen du Centre médical de l’Université du Kansas pour leur collaboration et pour la mise en œuvre de ce protocole sur un site distant. CY a reçu un soutien à la recherche de la subvention NIH 1K08HL150271.

Materials

1000 µL Tips Gilson F174501 Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
15 mL tube Biopioneeer CNT-15 To hold Solutions 2/3
2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
2 mL Cryovials Globe Scientific 3012 Approximately 40 cryovials needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
20 µL Tips Gilson F174201 For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used. 1 tip is needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
50 mL Conical Tube CEM Corporation 50-187-7683 2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
3 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
CD14 Antibody Biolegend 325621
CD16 Antibody Biolegend 360723
CD19 Antibody Biolegend 363007
CD3 Antibody Biolegend 300405
CD56 Antibody Biolegend 318303
CD66b Antibody Biolegend 305103
Cell Strainer Biopioneeer DGN258367 1 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
CPT Mononuclear Cell Preparation Tube BD Biosciences 362753 6 tubes needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryo Freezer Box Southern Labware SB2CC-81 Holds 81 tubes
1 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryotube Rack Fisherbrand 05-669-45 Holds up to 50 cryovials
DMSO Invitrogen 15575020 Approximately 2.5 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen 10977015 Approximately 2 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Approximately 9 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
EDTA Tubes BD Biosciences 366643 1 tube needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Flavopiridol Sigma-Aldrich F3055-5MG
HLA-DR Antibody Biolegend 307609
Human Serum Albumin GeminiBio 800-120 Approximately 25 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Human Trustain FcX Biolegend 422301
Isopropanol Sigma-Aldrich W292912-1KG-K For use in Mr. Frosty
Label Printer Phomemo M110-WH
Live-Dead Stain Biolegend 423105
Mr. Frosty Thermo Scientific 5100-0001 Holds up to 18 tubes.
2 Mr. Frostys needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Multidispense Pipette Brandtech 705110
Multidispense Pipette Tips Brandtech 705744 Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
P1000 Pipette Gilson F144059M
P20 Pipette Gilson F144056M For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used.
Printer Labels Phomemo PM-M110-3020 Approximately 45 labels needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Approximately 5 labels needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
RNase-Free EDTA (0.5 M) Invitrogen AM9260G Approximately 40 µL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
RNase-Free PBS (10X) Invitrogen AM9625 Approximately 1 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
RNasin Promega N2111
RPMI Corning 10-040-CV Approximately 80 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Transfer Pipettes Fisherbrand 13-711-7M Approximately 5 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Tube Holder Endicott-Seymour 14-781-15 Holds up to 80 CPT/EDTA Tubes

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Citer Cet Article
Dinh, B., Hoeksema, M. A., Spann, N. J., Rendler, J., Cobo, I., Glass, C. K., Yeang, C. Isolation and Cryopreservation of Highly Viable Human Peripheral Blood Mononuclear Cells From Whole Blood: A Guide for Beginners. J. Vis. Exp. (212), e66794, doi:10.3791/66794 (2024).

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