Laboratory Maintenance of the Lower Dipteran Fly <i>Bradysia (Sciara) coprophila</i>: A New/Old Emerging Model Organism

Susan  A. Gerbi

doi:10.3791/66751

JoVE Journal > Biology

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biologie

Mantenimiento de laboratorio de la mosca díptera inferior Bradysia (Sciara) coprophila: un nuevo/viejo organismo modelo emergente

Published: April 19, 2024

doi:

10.3791/66751

Susan A. Gerbi

¹Department of Molecular and Cell Biology and Biochemistry, Division of Biology and Medicine,Brown University

Summary

Este artículo describe el mantenimiento en laboratorio (incluyendo el apareamiento y la alimentación) de la mosca díptera inferior Bradysia (Sciara) coprophila.

Abstract

Las existencias de laboratorio de la mosca del díptero inferior, Bradysia (Sciara) coprophila, se han mantenido durante más de un siglo. Aquí se presentan los protocolos para el mantenimiento en laboratorio de B. coprophila . Estos protocolos serán útiles para el número cada vez mayor de laboratorios que estudian B. coprophila para aprovechar sus características biológicas únicas, que incluyen (1) un huso monopolar en la meiosis masculina I; (2) no disyunción de la díada X en la meiosis masculina II; (3) impronta cromosómica para distinguir los homólogos maternos de los paternos; (4) cromosomas (L) limitados por línea germinal; (5) eliminación cromosómica (cromosomas paternos en la meiosis masculina I; uno a dos cromosomas X en embriones tempranos; Cromosomas L del soma en embriones tempranos); (6) determinación del sexo por parte de la madre (no hay cromosoma Y); y (7) amplificación de ADN regulada por el desarrollo en los loci puff de ADN en los cromosomas politénicos de las glándulas salivales larvarias.

Ahora es posible explorar estas muchas características únicas de la mecánica cromosómica mediante el uso de los avances recientes en la secuenciación y el ensamblaje del genoma de B. coprophila y el desarrollo de la metodología de transformación para la ingeniería genómica. La creciente comunidad científica que utiliza B. coprophila para la investigación se beneficiará de los protocolos descritos aquí para el apareamiento de las moscas (marcadores fenotípicos para las madres que tendrán solo hijos o solo hijas; detalles del apareamiento masivo para experimentos bioquímicos), la verificación de la eclosión de los embriones, la alimentación de las larvas y otros comentarios sobre su crianza.

Introduction

Una comprensión completa de los principios biológicos requiere el estudio de muchos organismos diversos que abarcan el Árbol de la Vida. Aunque se describió una amplia gama de organismos a finales^{del siglo XIX} , a mediados del siglo^XX los estudios experimentales se restringieron a un puñado de menos de una docena de organismos modelo. Con el advenimiento de la era genómica y el objetivo de secuenciar los genomas de todas las especies en el Árbol de la Vida¹, ahora estamos en condiciones de expandir los tipos de organismos que se utilizan para experimentos de laboratorio y aprovechar su diversidad. Esta expansión de los organismos modelo emergentes para experimentos tiene como requisito previo para poder mantenerlos en el laboratorio. Aquí, se describen los protocolos para la cría de uno de estos organismos modelo emergentes/antiguos.

La mayor parte de la vida animal en la Tierra se explica por cuatro super-radiaciones de insectos². Dentro de los insectos, hay alrededor de 158.000 especies de dípteros (moscas verdaderas)³, con alrededor de 3000 especies de la familia Sciaridae (moscas del hongo negro)⁴. La mosca de la fruta Drosophila es la más estudiada de las moscas dípteros. La mosca díptera inferior (Nematocera), Bradysia (anteriormente llamada Sciara) coprophila, divergió hace 200 millones de años de Drosophila, que es una mosca “díptera superior” (Brachycera). Por lo tanto, B. coprophila se encuentra en una posición taxonómica favorable para estudios comparativos con D. melanogaster (Figura 1). Además, B. coprophila tiene muchas características biológicas únicas que son dignas de estudio por derecho propio ^5,6,7. Muchas de estas características desobedecen la regla de constancia del ADN en la que todas las células de un organismo tienen el mismo contenido de ADN. En B. coprophila, (i) el genoma paterno se elimina en un huso monopolar en la meiosis masculina I; (ii) no hay disyunción de la díada X en la meiosis masculina II; (iii) los cromosomas (L) limitados por la línea germinal se eliminan del soma; y (iv) uno o dos cromosomas X se eliminan en el embrión temprano dependiendo del sexo del individuo. La impronta cromosómica para distinguir los homólogos maternos de los paternos se descubrió por primera vez en B. coprophila y está en juego en muchos de estos eventos de eliminación cromosómica. Además de la eliminación cromosómica, se produce otra derivación de la constancia del ADN a través de la amplificación de ADN específica del locus regulada por el desarrollo en los loci puff de ADN en los cromosomas politénicos de las glándulas salivales de las larvas. Los estudios de estas características únicas requieren el mantenimiento en laboratorio de B. coprophila; Aquí se presentan detalles de su cría para facilitar dichos estudios.

Figura 1: Filogenia de Bradysia (Sciara) coprophila. Los organismos modelo populares se indican en letra azul y su orden taxonómico en fuente roja. Bradysia y otros mosquitos del hongo Esciárido, así como mosquitos, son moscas dípteras inferiores (anteriormente, suborden Nematocera), mientras que las especies de Drosophila son moscas dípteras superiores (suborden: Brachysera). La información del lado izquierdo de la figura es de Misof et ^al.33; la información del lado derecho es de Bertone et ^al.34 y Wiegmann et ^al.2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Anteriormente, el género Sciara tenía el mayor número (700) de especies para cualquier eucariota, lo que llevó a Steffan a subdividirlos⁸. Posteriormente, Shin propuso que la familia Sciaridae se subdividiera en la subfamilia Sciarinae (con seis géneros que incluyen Sciara, Tricosia y Leptosciarella), la subfamilia Megalosphyinae (incluido el género Bradysia) y otros tres grupos (incluida Pseudolycoriella)⁹. La filogenia de los Sciaridae ha sido estudiada más a fondo por varios grupos en los últimos años ^9,10,11. En las últimas décadas, los nombres de muchos organismos de la familia Sciaridae han cambiado¹². Aunque la mayor parte de la literatura de más de un siglo se refiere al organismo que estudiamos como Sciara coprophila, su nombre taxonómico actual es ahora Bradysia coprophila (sinónimos) de Bradysia tilicola y otros sinónimos10. Se encuentran en todo el mundo y se les conoce comúnmente como moscas de los hongos, ya que comen hongos y otros hongos. Fueron descritos por primera vez en 1804 por Meigen¹³ en Europa y posteriormente por Johannsen^14,15 en América del Norte. B. coprophila fue colectada en el Laboratorio de Cold Spring Harbor y las existencias de laboratorio fueron establecidas por Charles Metz a principios de 1900 cuando era estudiante graduado en la Universidad de Columbia con Thomas Hunt Morgan. Por lo tanto, las poblaciones actuales reflejan un siglo de endogamia. De manera similar, la biología de B. coprophila fue dilucidada aún más por décadas de estudios citogenéticos por Helen Crouse (quien hizo su trabajo de doctorado con Barbara McClintock).

En la década de 1930, Bradysia (Sciara) compitió con Drosophila melanogaster como sistema modelo para estudios genéticos. A pesar de sus muchas características biológicas únicas, B. coprophila fue eclipsada por D. melanogaster como un organismo modelo popular, ya que las mutaciones fenotípicas inducidas por la radiación eran necesarias para los estudios genéticos y eran más fáciles de lograr en este último, a pesar de que B. coprophila es solo ligeramente más resistente a la irradiación gamma que D. melanogaster¹⁶. En la era moderna de la genómica, esto ya no es una preocupación. Dado que la secuencia del genoma ^17,18,19 (Urban, Gerbi y Spradling, datos no mostrados) y los métodos para la transformación ^20,21 (Yamamoto y Gerbi, datos no mostrados) para B. coprophila han estado disponibles recientemente, ha llegado el momento de utilizarlo como un nuevo/viejo sistema modelo emergente, como lo ha visto la creciente comunidad de científicos que lo han adoptado para sus investigaciones. En este artículo se describen los procedimientos para su mantenimiento en el laboratorio.

B. coprophila carece de un cromosoma Y, y el sexo de la descendencia está determinado por la madre. Las mujeres que tienen el cromosoma X’ (“X-prime”) con una inversión paracéntrica larga tendrán solo hijas, mientras que las mujeres que son homocigóticas para el cromosoma X estándar (no invertido) tendrán solo hijos⁵ (Figura 2). Se dispone de información sobre la secuencia del cromosoma¹⁹ del cromosoma X’, pero aún no se ha dilucidado el mecanismo molecular de cómo el cromosoma X determina que la descendencia será hembra. Los machos nunca tienen el cromosoma X’, y después de la fecundación, las hembras son X’X (heterocigóticas para el X’) o XX. Las hembras adultas X’X se pueden distinguir de las hembras XX por marcadores fenotípicos en el ala (Figura 3). Las hembras X’X (que solo tendrán hijas) pueden ser reconocidas por el marcador de ala ondulado (W) dominante en la X’ (como en la cepa HoLo2)²². Alternativamente, las hembras XX (que solo tendrán hijos varones) pueden ser reconocidas por el marcador de ala pequeña (p) recesiva en la X como en el stock^{91S 23}. En este caso, las hembras X’Xp tendrán alas largas (no pequeñas) y solo tendrán hijas. La culata 6980 lleva un marcador recesivo en el cromosoma X para las venas inflamadas (sw)²⁴, así como el marcador dominante ondulado en el X’, lo que permite dos marcadores para la selección de cruzas. El grado de expresión de Wavy puede variar y parece más débil en viales abarrotados donde la comida es limitante o si la temperatura se calienta demasiado. El fenotipo de alas onduladas es excepcionalmente fuerte si las larvas se mantienen en la cámara frigorífica (4°-8 °C) en lugar de los 21 °C habituales. Aunque el marcador recesivo de ala pequeña no es variable y es muy fácil de identificar, las cepas de 91S se utilizan con menos frecuencia, ya que son menos saludables que las de HoLo2. Los esquemas de apareamiento de B. coprophila se presentan aquí (Figura 2) y se describen en detalle para las poblaciones HoLo2, 7298 y W14 (Archivo Suplementario 1), la cepa 91S (Archivo Suplementario 1), la cepa 6980 (Archivo Suplementario 1) y las existencias de translocación (Archivo Suplementario 1). Las existencias de translocación ya no existen; eran translocaciones recíprocas de heterocromómeros (H1, H2 y H3) en el brazo corto del X que contiene los genes de ARN ribosómico 25,26,27.

Figura 2: Esquema de apareamiento de B. coprophila. Este organismo no tiene cromosoma Y (el soma masculino tiene un solo cromosoma X); Las madres determinan el sexo de sus crías. XX madres tienen solo hijos y X’X hembras solo tienen hijas. El cromosoma X’ tiene una inversión paracéntrica larga en comparación con el cromosoma X. El linaje paterno o materno del cromosoma X (o X’) se denota con azul o rojo, respectivamente, en esta figura. Los espermatozoides son haploides para los autosomas, pero tienen dos copias del cromosoma X debido a la no disyunción en la meiosis II. El linaje somático de los embriones tempranos elimina una o dos copias de la X derivada del padre si van a ser femeninas o masculinas, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Fenotipos de las alas de B. coprophila. Las moscas hembras adultas se muestran con varios fenotipos de alas: (A) ala recta (XX), (B) ala ondulada (_X’WX), (C) fenotipo extremo de ala ondulada (_X’WX) que tiene una apariencia arrugada después de almacenar larvas en el campo frío, (D) ala pequeña (XpXp) que es vestigial, (E) ala recta con tipo silvestre (XX) y no venas hinchadas, (F) ala recta con venas hinchadas (XswXsw) donde aparecen pequeñas burbujas (flechas negras) en el borde superior del ala y/o cerca de la punta de ambas alas, (G) ejemplo extremo de hinchazón donde se produce una ampolla (flecha blanca) en una o ambas alas. Los machos carecen del cromosoma X’ y, por lo tanto, nunca tendrán alas onduladas, pero tienen alas pequeñas o hinchadas en el stock 91S o 6980, respectivamente. Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El objetivo en el mantenimiento del ganado es realizar cruzamientos en los que la mitad de los cruzamientos sean de madres productoras de hembras y la mitad de los cruzamientos de madres productoras de machos para tener el mismo número de adultos femeninos y masculinos en la próxima generación para los cruces subsiguientes. Sin embargo, esto también implica planificación, ya que el ciclo de vida de los machos es más corto que el de las hembras y los machos adultos emergen hasta una semana antes que las hembras adultas. La naturaleza se adapta a esta asincronía entre los sexos haciendo que los embriones masculinos emerjan como larvas 1-2 días después de las larvas femeninas de un cruce en la misma fecha. Sin embargo, para garantizar que los machos y las hembras adultas estén disponibles al mismo tiempo para los cruces de laboratorio, el desarrollo de las hembras puede acelerarse un poco dejando los viales con larvas femeninas a temperatura ambiente en lugar de a 21 °C o colocando los viales con larvas masculinas a temperaturas ligeramente más frías (por ejemplo, 16 °C). Otra ruta que es más infalible es hacer cruces con madres productoras el lunes y cruces con madres productoras masculinas el viernes de la misma semana. La ruta más fácil, que es la que empleamos, es realizar cruces con madres productoras y productoras masculinas el mismo día cada semana y realizar cruces ese día en cada semana consecutiva. En ese enfoque, las hembras adultas de un cruce en la semana 1 pueden aparearse con machos adultos que emergieron de un cruce en la semana 2.

El ciclo de vida de las hembras de B. coprophila es de 5 semanas cuando se crían a 21 °C (Tabla 1). La duración de su ciclo de vida es algo más larga a temperaturas más frías o si están mal alimentados. El ciclo de vida de los machos de B. coprophila es de ~4-4,5 semanas, ya que pupan 0,5-1 semana antes que las hembras. El final de cada estadio larvario está marcado por el desprendimiento de la cutícula, que se desencadena por un estallido en el nivel de la hormona esteroide ecdisona. A diferencia de D. melanogaster, que tiene tres estadios larvarios, B. coprophila tiene cuatro estadios larvarios.

Etapa de desarrollo	Días posteriores al apareamiento (dpm)	Duración de la etapa (días)
Puesta de huevos	1-2
Embrión	De 1-2 a 7-8	~7 días
Larva
Estadios larvales 1, 2 y 3	7-8 al 16-19	~10
4º estadio larvario pre-mancha ocular	De 16-19 a 21-24	5
4º estadio larvario de manchas oculares	21-24 al 25-28	4
Crisálida	25-28 al 30-33	5
Adulto	Vive de 1 a 2 días a 21 °C si está apareado o de 2 a 3 semanas a 16 °C si no está apareado.

Tabla 1: Ciclo de vida de la hembra de B. coprophila a 21 °C.

B. coprophila puede mantenerse en cualquier lugar en el rango de 15 °C a 25 °C, y el desarrollo progresa más lentamente a temperaturas más frías. Este insecto prefiere un ambiente húmedo (se encuentra en el suelo de las plantas de interior o en los lechos de hongos), por lo que mantenemos un vaso de precipitados con agua desionizada en la incubadora. B. coprophila se puede mantener a temperatura ambiente en una caja de pan de metal con una tapa holgada y que contiene un vaso de precipitados con agua, pero entran en choque térmico a 37 ° C²⁸, lo que es un peligro en climas cálidos. Michael Ashburner y otros han intentado, con poco éxito, almacenar D. melanogaster en el frío para reducir el tiempo necesario para el mantenimiento de existencias. Por el contrario, una gran ventaja de B. coprophila es que los viales con larvas en etapa intermedia se pueden almacenar hasta por 3 meses en un estante abierto en la cámara frigorífica (4-8 °C) con el cuidado mínimo de alimentarse solo una vez al mes. Se desarrollan muy lentamente en el frío hasta la etapa de pupa y emergerán como adultos fértiles cuando los viales se devuelvan a 21 ° C. Presumiblemente, esto imita su hibernación en la naturaleza. Este estancamiento del desarrollo inducido por el frío podría ser comparable al observado después de la irradiación gamma de las larvas de B. coprophila en etapa media¹⁶, pero el estancamiento del desarrollo no se observa en las larvas en etapa tardía que han pasado el punto de no retorno para su progresión normal del desarrollo.

Protocol

Los protocolos descritos aquí representan un siglo de experiencia de los centros de stock de Bradysia (Sciara) supervisados secuencialmente por Charles Metz, Helen Crouse y Susan Gerbi, así como las aportaciones de otros. 1. Cruces de apareamiento Utilice una hembra adulta y dos machos adultos por vial de vidrio de 28 mm de diámetro. Una vez que se haya logrado el 100% de éxito en el reconocimiento de los fenotipos de las alas de las madres que solo tendrán hijas o hijos, use dos hembras y dos machos por vial para aumentar el número de larvas / vial. Agregue hembras a cada vial antes de agregar los machos que se despiertan más rápido de la anestesia que las hembras.NOTA: La descripción a continuación supone que tiene CO2; Alternativamente, se puede usar éter para anestesiar a las moscas adultas. Si usa éter para anestesiar a las moscas adultas, pegue con cinta adhesiva una almohadilla de toallitas de laboratorio dobladas (por ejemplo, toallitas kim) en el interior de una tapa de vidrio redonda de un frasco Coplin y use un gotero para transferir un poco de éter de la botella para humedecer la almohadilla de toallitas de laboratorio (pero no saturada y tan húmeda que el líquido del éter se desprenderá y correrá el riesgo de ahogar a las moscas). Para el paso 1.6 a continuación, coloque la almohadilla de éter humedecida encima del vial abierto durante ~ 1 minuto hasta que los adultos dejen de moverse. Una vez que los adultos han sido transferidos a una placa de baldosas de cerámica blanca (utilizada en lugar de la almohadilla blanca), periódicamente (cuando las patas de las moscas comiencen a temblar) sostenga la almohadilla que ha sido recién humedecida con éter sobre (sin tocar) las moscas en el plato durante ~ 1 min.PRECAUCIÓN: El éter es inflamable y debe almacenarse en una campana de ventilación y no en un refrigerador. Coloque al alcance de la mano una bandeja con viales de hembras adultas, una bandeja con machos adultos y una bandeja de viales vacíos que contengan agar al 2,2% (peso/vol). En la mesa del laboratorio, coloque notas en el cartel que indiquen “hembra” o “macho” y el fenotipo del ala de la madre para que el frasco con adultos seleccionado para el cruzamiento se coloque en el grupo correcto, donde todos los viales de un grupo tendrán solo progenie masculina y todos los viales del otro grupo tendrán solo progenie femenina.NOTA: Asegúrese de que no haya gotas de condensación dentro del vial, ya que los adultos se adherirán a las gotas. Si los viales se almacenaron en una caja de plástico, colóquelos en una mesa de laboratorio a temperatura ambiente durante al menos 1 h antes de usarlos para permitir que la condensación se evapore. Encienda el gas CO2 y la lámpara del microscopio de disección.NOTA: Se prefiere una fuente de luz con fibra óptica ya que emite menos calor, lo que hace que las moscas anestesiadas se despierten más rápido. Golpee vigorosamente el frasco con adultos sobre una almohadilla de goma para que los adultos caigan al fondo del vial y retire el tapón; Inserte la boquilla de la pistola de CO2 y vuelva a agregar el tapón. Presione el gatillo de la boquilla para que el CO2 fluya hacia el vial durante ~ 1 minuto para anestesiar a los adultos. Coloque un pie en el pedal para que el CO2 fluya hacia la almohadilla blanca en lugar de la boquilla de la pistola. Mantenga el pedal presionado todo el tiempo que las moscas estén en la almohadilla blanca (o bien pise intermitentemente el pedal cada vez que las patas de las moscas comiencen a temblar). Retire la boquilla y el tapón del vial e invierta el vial sobre una almohadilla blanca bajo un microscopio de disección. Golpee la parte inferior del vial invertido contra el microscopio para que los adultos caigan del frasco sobre la almohadilla blanca. Seleccione los adultos más gordos (recientemente cerrados con abdómenes blancos) y use pinzas de punta fina para levantar suavemente al adulto por su pata media o trasera. No lesione las patas delanteras que se utilizan para la danza de apareamiento. No utilice adultos que acaben de cerrar y cuyos cuerpos son completamente blancos y aún no se han vuelto negros porque sus alas serán cortas y no estarán completamente desarrolladas, por lo que el fenotipo del ala no se puede marcar. Los adultos con abdomen más delgado aún pueden ser utilizados, aunque tienen una fertilidad reducida. No use adultos flacos cuyas alas estén levantadas verticalmente lejos de su cuerpo, ya que están muertos. Con la otra mano, retire el tapón del vial con agar al 2,2% (peso/vol). Con la mano que sostiene las pinzas con el adulto, golpee las pinzas vigorosamente contra la pared superior interior del vial para que el adulto caiga al fondo del vial. Vuelva a colocar el tapón en el vial. Repita los pasos 1.5 a 1.11 anteriores para configurar cada vial que contenga mujeres adultas. Use un pincel para barrer las moscas no utilizadas de la almohadilla blanca y devolverlas a su frasco principal. Coloque una marca de verificación en la etiqueta del vial principal para indicar que se ha utilizado para el apareamiento (aunque se puede volver a usar si es necesario). Para el mantenimiento rutinario de las existencias, prepare de 6 a 8 viales con madres productoras y de 6 a 8 viales de madres productoras masculinas (Figura 4). Configure la mitad de los viales con madres (o padres) a partir de un vial adulto y la otra mitad de los viales nuevos con un vial adulto diferente para minimizar los cuellos de botella genéticos.Ocasionalmente, un evento de segregación incorrecta producirá un macho excepcional en viales productores de hembras. Si un frasco con hembras adultas tiene un macho excepcional, retírelo y aplástelo para matar a ese macho. Si es posible, deseche todas las hembras de ese frasco y espere unos días hasta que se cierren más hembras adultas y puedan usarse de manera segura para los cruces.NOTA: Es preferible no utilizar las hembras de ese frasco para los cruces porque pueden haberse apareado con el macho excepcional y no producir un cruce fértil. Una vez que se hayan añadido las hembras adultas a todos los viales, repita los pasos 1.5-1.11 para añadir dos machos adultos (Figura 4) a cada vial que ya contenga moscas hembra. Golpee el vial con hembras en una almohadilla de goma para que no se escapen cuando se agreguen los dos machos secuencialmente.NOTA: Trabaje rápidamente y no anestesie en exceso a las moscas adultas, ya que eso las matará. Agregue una etiqueta a cada vial que indique el stock, la cruz (para progenie femenina o masculina), si la madre proviene del vial adulto # 1 o # 2, y la fecha de apareamiento. También ingrese la información anterior en un cuaderno e indique el número de viales configurados para cada cruz.NOTA: Es conveniente agregar una toalla de papel para separar los viales productores de machos de los viales productores de hembras en la bandeja. Deje los viales intactos en la encimera durante ~ 15 minutos para asegurarse de que los adultos se despierten y vuelen. Observe si se están apareando (muy pronto después de despertar) donde la hembra y el macho están orientados de atrás hacia atrás (el macho agarrará el ovipositor puntiagudo de la hembra) (Figura 4, abajo).NOTA: Una hembra adulta aceptará a un macho adulto solo una vez, así que no empuje los viales después del apareamiento, ya que esto podría separar al macho de la hembra mientras está en el proceso de apareamiento y esa hembra no volverá a aparearse. Coloque la bandeja con viales acoplados en la incubadora (por ejemplo, a 21 °C). Etiquete la bandeja con el nombre de la acción (por ejemplo, HoLo2) y la semana del ciclo de 5 semanas (semanas 1, 2, 3, 4 o 5).NOTA: Mantenga la bandeja con moscas recién apareadas en una parte separada de la incubadora o en otra incubadora como recordatorio de no alimentar los viales hasta que las larvas hayan emergido (descrito a continuación). 2. Apareamiento masivo NOTA: Por lo general, una sola madre B. coprophila tendrá 60 crías en su cría. Cuando se requiere un mayor número de crías para los experimentos, se puede realizar un apareamiento masivo en lugar del apareamiento de una sola pareja descrito anteriormente. El apareamiento masivo se puede realizar en los viales de vidrio estándar de 28 cm de diámetro cuando las madres se recogerán un día después para la puesta de huevos inducida y la recolección de embriones. Sin embargo, si se necesita un mayor número de larvas, el apareamiento masivo se realiza en un frasco con una superficie más grande para evitar el hacinamiento. Perfora varios agujeros pequeños en la tapa del frasco para que las larvas puedan respirar un poco de aire. Siga los pasos anteriores en la sección 1, pero use pinzas de punta fina para mover a todas las madres productoras (o a todas las madres productoras masculinas) a una esquina delantera de la almohadilla blanca. Use de 10 a 15 hembras adultas gordas anestesiadas y barra este grupo con un pincel en el frasco o frasco con pequeños agujeros perforados en la tapa.NOTA: Realice los pasos 2.1 y 2.2. rápidamente para el apareamiento masivo para evitar el exceso de anestesia que evitaría los cruces fértiles. Seleccione de 20 a 25 hombres adultos gordos anestesiados y muévalos con pinzas de punta fina a la esquina delantera de la almohadilla blanca. Golpee vigorosamente el frasco o frasco con las hembras sobre una almohadilla de goma para que no se escapen cuando se retire el tapón o la tapa para barrer el grupo anestesiado de machos adultos de la almohadilla blanca con un pincel. 3. Recolección de embriones después del apareamiento masivo Un día (24 h) después del apareamiento, realice los pasos 1.5-1.11 para anestesiar las moscas adultas (mezcla de hembras y machos) y transfiéralas a una mosca blanca.NOTA: La ovogénesis aún no se completa cuando las moscas adultas se aparean, lo que desencadena la meiosis final; Los óvulos maduros son fecundados por los espermatozoides almacenados en la espermateca cuando los óvulos son expulsados 29. La finalización de la ovogénesis puede tardar de 1 a 2 días, por lo que se permite 1 día después del apareamiento antes de inducir la puesta de huevos. Con pinzas de punta fina, levante a una hembra adulta por sus alas y colóquela en una placa de Petri de 100 mm de diámetro que contenga agar al 2,2% (peso/vol), con sus alas insertadas en el agar. Repita este paso secuencialmente para cada hembra adulta en la almohadilla blanca. Deseche los machos adultos en la almohadilla para moscas. Una vez que todas las moscas hembras estén empaladas en el agar, induzca la puesta de huevos apretando suavemente la cabeza con fórceps hasta que la mosca hembra tenga movimientos similares a las convulsiones. Alternativamente, aprieta suavemente su tórax. A continuación, pondrá un racimo de huevos fecundados en un plazo de 30 a 60 minutos. Cubra la placa de Petri con su tapa humedecida con una toallita de laboratorio humedecida con agua para evitar la atracción electrostática de los huevos hacia la tapa. 4. Comprobación de la “eclosión” de las larvas Verifique si las larvas “eclosionan” 1 semana después del apareamiento; Retire el tapón del frasco y use un microscopio de disección para detectar larvas. Su mandíbula negra se abrirá y cerrará repetidamente y avanzarán lentamente. Si solo hay unas pocas larvas, escriba “pocas” en la etiqueta del vial, como recordatorio de que debe alimentar menos ese vial. Examine cada vial de la bandeja con esa cruz e introduzca el número de viales con larvas en el cuaderno en una columna junto al número de viales que se instalaron en ese apareamiento.NOTA: No se desarrollarán huevos de color amarillo intenso. Es probable que se desarrollen huevos blancos y 1 día antes de que emerjan las larvas, se desarrollará pigmento negro (la futura mandíbula) en el extremo anterior del huevo. No confunda el moho con un filamento blanco que termina en una esfera negra en su extremo con las larvas: el moho no se moverá, a diferencia de las larvas que se arrastran hacia adelante en el agar. Agregue un pequeño trozo de paja (solo una vez) a cada vial con larvas para controlar el exceso de humedad y proporcionar un escondite de cobertura para las larvas. Mueva la bandeja a la incubadora (por ejemplo, a 21 °C) con bandejas de larvas de cruces de apareamiento de semanas anteriores y comience a alimentar los viales con larvas recién emergidas (consulte la sección más abajo sobre alimentación).NOTA: Generalmente, las larvas estarán en un grupo cerca de su madre muerta y comenzarán a comerla; Presumiblemente, esto transfiere la levadura del intestino de la madre al intestino de las larvas. Puede comenzar a alimentarse el día en que emergen las larvas o dentro de los 2 días posteriores. PRECAUCIÓN: Si se retrasa la alimentación, las larvas se comerán entre sí, ¡y solo quedará una larva gorda por vial! Continúe revisando los viales que aún no tienen larvas durante 3 días a la semana. Si no han emergido larvas después de 7-10 días, deseche el vial o guárdelo para lavarlo. 5. Preparación de la comida NOTA: ¡Todos los ingredientes de los alimentos deben estar libres de pesticidas! Use una cucharada para medir los siguientes ingredientes por volumen y deposítelos en una sartén de metal o vidrio (por ejemplo, una bandeja para hornear de metal de 8 pulgadas x 8 pulgadas): 4 partes de paja de avena (8 cucharadas), 2 partes de polvo de hongos Shitake (4 cucharadas), 1 parte de espinaca en polvo (2 cucharadas), 1 parte de ortiga en polvo (2 cucharadas). Use la cucharada para mezclar bien los ingredientes en la sartén.NOTA: Alternativamente, se pueden usar 2 partes de solo espinaca en polvo o solo ortiga en polvo en lugar de 1 parte de cada uno. Cubra la sartén con papel de aluminio y autoclave en un ciclo de secado durante 20-30 min. Deje que se enfríe a temperatura ambiente durante la noche o más. Retire el papel de aluminio de la sartén y rompa la mezcla de alimentos esterilizados apelmazados, usando un movimiento de molienda con la cucharada para crear una mezcla en polvo. Agregue 1 parte (2 cucharadas colmadas) de levadura de cerveza y mezcle bien con la mezcla de alimentos esterilizada en autoclave.NOTA: La levadura de cerveza no se esteriliza en autoclave, ya que eso mataría la levadura. Transfiera la mezcla de alimentos a un frasco estéril con tapa.NOTA: Se puede usar el mismo tipo de frasco de 240 ml que se usa para el apareamiento masivo, y la receta anterior llenará el frasco. Del mismo modo, el mismo tipo de frasco con tapa esterilizado debe llenarse solo con paja que se esterilizó en autoclave en una sartén cubierta con papel de aluminio. 6. Alimentación NOTA: Ajuste la cantidad de alimento que se le da de acuerdo con la edad y la cantidad de larvas. Dé mucho alimento a los frascos con muchas larvas de un apareamiento masivo. Dé solo una pizca ligera de alimento a las placas de Petri con larvas que se almacenan durante unos días para la etapa de desarrollo. El método de alimentación que se describe a continuación fue desarrollado en el laboratorio de Charles Metz 29, y ha sido utilizado con éxito por su laboratorio y por Helen Crouse, Susan Gerbi y otros durante un siglo. Lávese las manos y enjuague bien para eliminar el jabón.NOTA: No se recomiendan los guantes, ya que disminuyen la sensación de los dedos para regular la cantidad de comida que se le da a cada vial. Guarde un frasco estéril tapado con paja molida y un frasco estéril con alimentos en la incubadora (por ejemplo, a 21 °C) donde se guardan las larvas. Retire la tapa del frasco y vierta algo de comida en un recipiente limpio (por ejemplo, un plato de dulces) para facilitar el acceso; Vuelva a colocar la tapa del frasco que contiene la comida restante. Mantenga el recipiente abierto con la comida en una bandeja pequeña de metal o vidrio; Esto evitará que los ácaros u otros insectos se arrastren por la pared de la bandeja para entrar en el recipiente con comida. Recoge algo de comida entre el segundo y el tercer dedo (o entre el pulgar y el segundo dedo). Con la otra mano, retire un vial de la bandeja y retire el tapón, sosteniéndolo con los dedos mientras alimenta. Examine el frasco para determinar la edad y el número de larvas y deposite la cantidad adecuada de alimento en el vial girando los dos dedos que sostienen el alimento uno contra el otro. Los viales con larvas recién emergidas solo necesitan unos pocos granos de alimento. Los viales con larvas más viejas deben tener una capa delgada de alimento que cubra la parte superior del agar. Si hay moho blanco en el vial, use etanol al 70% rociado en una toallita de laboratorio para limpiar una sonda larga de metal (por ejemplo, con un mango de madera), retire el tapón e inserte la sonda limpia en el frasco para golpear el molde en la superficie del agar. Si hay mucho moho, gire la sonda para envolver el molde alrededor de la sonda y sacarla del vial. No perturbe la parte superior del agar ya que las larvas viven allí; Agregue solo una pequeña cantidad de alimento y vuelva a colocar el tapón en el vial. Limpie la sonda con una toallita de laboratorio humedecida con etanol al 70% antes de almacenar la sonda o usarla para limpiar otro vial. Una vez que se hayan alimentado todos los viales de una bandeja, vuelva a colocar la bandeja en la incubadora y retire la siguiente bandeja para la alimentación como se indica en el paso 6.3. Una vez completada la alimentación, vierta el resto de la comida del tazón en el frasco previamente esterilizado, tape el frasco y guárdelo en la incubadora. 7. Recolección de larvas o pupas en placas de Petri Para un pequeño número de larvas, utilice una sonda o espátula de metal que se haya limpiado con etanol al 70% para excavar en la capa superior de agar en un vial para transferir el agar adherido con algunas larvas a una placa de Petri estéril de 100 mm de diámetro medio llena con agar al 2,2% (peso / vol). Para un mayor número de larvas, inserte una espátula a lo largo de la pared en la parte inferior del vial para facilitar la extracción del tapón de agar del vial y deposítelo boca arriba en una placa de Petri vacía. Utilice un microscopio de disección para encontrar las larvas en la parte superior del tapón de agar y transfiéralas con pinzas de punta fina a una placa de Petri estéril de 100 mm de diámetro llena hasta la mitad con agar al 2,2% (peso por vol). Use un microscopio de disección para clasificar las larvas con pinzas de punta fina en grupos de la misma etapa de desarrollo.NOTA: Debido a una ligera asincronía en el desarrollo, habrá varios grupos diferentes de larvas clasificadas en la placa de Petri con agar al 2,2% (peso / vol). Agregue una pizca de comida y coloque la placa de Petri con larvas en la incubadora. Retírelo diariamente para su observación con el microscopio de disección para seleccionar la etapa de desarrollo deseada.NOTA: Para los estudios de inhalación de ADN, las larvas tempranas de manchas oculares pasan por las etapas de 10×5, 12×6, 14×7 y borde del ojo/mandíbula caída con ~ 1 día en cada una de estas etapas 30,31. Elija pupas cuyos ojos estén llenos de pigmento de 1/4 a 1/2 para tener etapas de meiosis I y II en los testículos de la pupa. 8. Almacenamiento de larvas en cámara frigorífica Como respaldo, mantenga en la cámara frigorífica unos cuatro viales de larvas femeninas y cuatro viales de larvas masculinas de 2 semanas consecutivas de cruzamientos. Para el almacenamiento de respaldo, alimente las larvas que se encuentran en el4º estadio temprano (etapa previa a la mancha ocular) y colóquelas en una bandeja abierta en un estante en la cámara frigorífica; Alimente estos viales solo una vez al mes. Retire los 16 viales de las 2 semanas consecutivas de cruzamientos de apareamiento del frío después de 2-3 meses (marque esto en un calendario como recordatorio); colóquelos en una incubadora (por ejemplo, a 21 °C) para alimentarlos normalmente y déjelos convertirse en adultos para usarlos como cruzamientos. Cuando los viales se retiren de la cámara frigorífica, coloque un nuevo juego de viales con larvas tempranas de4º estadio en la cámara frigorífica para que estos viales estén siempre disponibles como respaldo para las existencias.NOTA: La viabilidad después del almacenamiento en cámara frigorífica no se ha probado sistemáticamente para diferentes etapas de desarrollo, pero nuestra experiencia revela que el almacenamiento en frío de larvas tempranas de4º estadio funciona bien. 9. Lavado de viales Después de que los adultos hayan muerto (~ 2-3 semanas después de la eclosión), retire los viales de la incubadora y colóquelos a 60-70 ° C durante 1 hora para matar los organismos restantes. Retire los tapones de algodón y guárdelos en una caja de plástico. Use una espátula para raspar el tapón de agar del vial y colóquelo en una lata de basura. Remoje los viales durante la noche o más sumergidos en agua en una cacerola. Utilice un cepillo de tubo de ensayo guardado solo para este propósito (nunca se use para recipientes con productos químicos ni con jabón) y frote hacia arriba y hacia abajo en el vial con agua corriente del grifo. Coloque el frasco limpio con el lado abierto hacia abajo en una canasta de metal. Llene la cesta con viales limpios.NOTA: Nunca use jabón en los viales, ya que cualquier residuo de jabón podría matar a B. coprophila. Agregue una tapa de malla de alambre a la canasta y, mientras mantiene la tapa en su lugar, invierta la canasta para llenar todos los viales con agua desionizada. Mientras mantiene la tapa en su lugar, invierta la canasta para vaciar el agua desionizada de los viales. Repita los enjuagues con agua desionizada 4 veces. Coloque las cestas con los viales limpios sobre toallas de papel o una plataforma de malla abierta (por ejemplo, un carro de laboratorio) para que se sequen durante la noche o por más tiempo. Guarde los viales secos en un cajón.NOTA: No deje que los viales con adultos muertos permanezcan demasiado tiempo antes de lavarlos, ya que podría invitar a una infestación de ácaros. 10. Agar vertido Llene un recipiente grande (canasta de metal o bandeja de metal) con viales limpios y agregue un tapón de algodón a cada vial. Reutilice los tapones tomados de los viales viejos cuando se lavaron los viales, y use los tapones repetidamente hasta que se degraden y se deshagan y deban desecharse. Esterilice el recipiente con los viales taponados en un ciclo de secado durante ~ 30 minutos y déjelos enfriar a temperatura ambiente para almacenarlos en el contenedor del autoclave. Tenga siempre a mano dos recipientes (uno en uso activo y otro de repuesto) con viales taponados esterilizados en autoclave. Coloque 11,0 g de polvo de agar en un matraz Erlenmeyer de 1 L y agregue 500 mL de agua destilada para hacer una solución de agar al 2,2% (peso/vol) suficiente para verter ~24 viales (~21 mL/vial). Agite el matraz y colóquelo en un horno microondas.NOTA: A partir de aquí, utilice un guante de autoclave resistente al calor para manipular el matraz. La misma solución de agar al 2,2% (peso / vol) se puede verter en placas de Petri (para larvas seleccionadas) o frascos (para apareamientos masivos) si se necesitan. Cocine en el microondas durante 1 minuto, retire el matraz para agitarlo, vuelva a colocarlo en el horno microondas y vuelva a calentarlo en el microondas durante 1 minuto. Repita esto varias veces. Observe el matraz a través de la puerta de vidrio del horno microondas. Cuando la solución de agar comience a hacer espuma y hervir, use inmediatamente el botón de parada manual. No agite el matraz en este punto (podría hervir), y retírelo con cuidado del horno a la encimera y déjelo reposar durante unos minutos. Retire el tapón de un vial esterilizado y sujételo con una mano; Utilice la otra mano para verter agar al 2,2% de ~2,5 cm de altura en el vial esterilizado. Luego, vuelva a colocar el enchufe en el vial. Repita esto hasta que se haya vertido todo el agar.NOTA: Si se vierte muy poco agar en el vial, se secará más rápidamente durante el uso y se alejará de las paredes del vial. Si se vierte demasiado agar en el vial, es difícil concentrarse en la capa superior al marcar la “eclosión” de las larvas con un microscopio de disección. Deje que los viales vertidos permanezcan en el mostrador a temperatura ambiente durante 1-2 días para que el agar se endurezca y la humedad se evapore por completo. Use los viales para cruzar cruzes de apareamiento o guárdelos acostados de lado en una caja de plástico con tapa hermética; Coloque una toalla de papel humedecida con agua encima de los viales antes de colocar la tapa en la caja (esto evitará que el agar se seque y se encoja de la pared del vial). Guarde la caja con los viales vertidos a temperatura ambiente durante unos días o en un frigorífico o cámara frigorífica a 4 °C durante un máximo de 2 semanas. Antes de usar los viales almacenados, sáquelos de la caja y déjelos en el mostrador a temperatura ambiente durante una o dos horas para permitir que la condensación se evapore del interior de los viales (las moscas adultas se pegarían al condensado y se ahogarían). 11. Fabricación de tapones para viales Coloque un frasco limpio en un soporte de tubo de ensayo de espuma de poliestireno de 50 ml (fuerce el tubo para que quede recto). Corta un cuadrado de gasa (de 2 a 4 capas de grosor) y colócalo encima del vial. Coloque trozos de gasa de tapones hechos previamente encima de la gasa para crear una capa más gruesa. Coloque algodón encima de la gasa y presione hacia abajo en el vial, asegurándose de llenar bien la pulgada superior más o menos del vial. Sostén la parte superior de los extremos de la gasa y átala con una cuerda. Corta el exceso de cuerda y el exceso de gasa (deja suficientes colas de la cuerda para mantenerla atada y suficiente gasa para agarrar cómodamente el tapón).NOTA: Coloque los enchufes de manera que queden ajustados. Debes poder sacarlos con los dedos índice e índice mientras los sostienes con una mano. Si levanta el vial por el tapón y se cae, está demasiado suelto. Si hace un fuerte chasquido cuando se saca, es posible que esté demasiado apretado. Si está demasiado apretado o si el tapón tiene una capa de agar duro y seco, las moscas pueden asfixiarse. Si el tapón está demasiado flojo o se desliza por los lados del vial, se puede golpear en la encimera para aplastarlo en un tamaño un poco más ancho. 12. Horario semanal típico (para una mayor eficiencia, realice las tareas en el orden indicado) Lunes (~30 min)Alimente los viales con larvas. Vierta agar en viales estériles y limpios con tapones. Miércoles (~2 h)Coloque los viales con adultos muertos en un horno durante 1 h y guárdelos para lavarlos. Compruebe si hay larvas “eclosionadoras de bebés”. Alimente los viales con larvas. Realizar cruces de apareamiento semanales. Otras tareas según sea necesario: autoclave de limpieza de viales con tapones para tener un suministro de reserva según sea necesario; preparar nuevos alimentos y paja de autoclave según sea necesario; frascos de autoclave según sea necesario para alimentos y paja. Viernes (~30 min)Compruebe si hay larvas “eclosionadoras de bebés”. Alimente los viales con larvas.

Representative Results

Los protocolos descritos aquí han llevado a un éxito comprobado en la cría de B. coprophila. Cuando se eligen adultos gordos recién cerrados para el apareamiento (Figura 4), más del 90% de los cruzamientos pueden ser fértiles y producir descendencia. El éxito de la fertilidad varía con los diferentes grupos (Tabla 2). El stock 7298 (cromosoma X’ con marcador ondulado) fue el más saludable de los stocks, pero pasó por un período de declive, aparentemente debido a la activación de elementos móviles del ADN que crean reordenamientos del genoma32. La cepa HoLo2 representa una cepa saludable derivada de la 7298, donde aparentemente los reordenamientos del genoma se han estabilizado, y ha reemplazado a la cepa parental 7298 en el centro de la cepa. El stock de HoLo2 es el que se utilizó para secuenciar el genoma de B. coprophila y es el más utilizado por diversos grupos de laboratorio. Recientemente, la mutagénesis CRISPR de moscas HoLo2 se ha utilizado para crear el stock W14 con un fenotipo de ojo blanco que se utilizará para la transformación con marcadores oculares fluorescentes (Yamamoto y Gerbi, datos no mostrados). La cepa W14 es excepcionalmente robusta. La culata 6980 (marcadores de ala ondulada y venas hinchadas) es algo menos robusta y la culata 91S (marcador de ala pequeña) es aún menos robusta. Los cruces exitosos dan como resultado embriones (Figura 5). Los embriones se someten a la eliminación de los cromosomas X paternos impresos en la división de escisión7ª a9ª . Además, los cromosomas L limitados de la línea germinal se eliminan del linaje somático en los embriones en la división de escisión5ª a6ª . Los embriones emergen como larvas, que no deben confundirse con el moho que también puede estar presente (Figura 6). Las manchas oculares (anlage a los ojos adultos) aparecen en la segunda mitad del4º estadio larvario (Figura 7). El tamaño de las manchas oculares proporciona un marcador fenotípico conveniente para el inicio y la progresión de la amplificación de la inhalación de ADN, que es uno de los dos únicos ejemplos conocidos de amplificación de ADN (gen) intracromosómica específica del sitio regulada por el desarrollo natural. Posteriormente, las pupas se desarrollan, y la cantidad de pigmento que llena sus ojos puede servir como un marcador de desarrollo para la meiosis I y II en la espermatogénesis (Figura 8) con sus comportamientos cromosómicos únicos en estas divisiones. Figura 4: Apareamiento de moscas adultas de B. coprophila . El panel superior muestra los tres tipos de moscas adultas en el stock de HoLo2: madres productoras de hembras con alas onduladas (X’WX hembras adultas), madres productoras de machos con alas rectas (XX hembras adultas) y machos con alas rectas (X0 machos adultos). Nótese el ovipositor puntiagudo en el extremo posterior de las moscas hembras y el broche en forma de gancho en el extremo posterior de las moscas macho. El panel inferior muestra un apareamiento entre macho y hembra, donde el macho ha agarrado el ovipositor de la hembra. Los espermatozoides se almacenarán en la espermateca de la hembra y fertilizarán los óvulos a medida que se descargan al exterior. La longitud de los adultos es de 2,0 mm (machos), 2,5 mm (hembras). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Embriones de B. coprophila . El panel superior izquierdo es una vista de embriones usando luz estándar en un microscopio de disección; Los núcleos del citoplasma sincitial aparecen como puntos negros. El panel de la derecha utiliza microscopía de fluorescencia para visualizar los núcleos de los embriones teñidos con yoduro de propidio. Los embriones tienen una longitud media de 200 micras y una anchura media de 150 micras. Los núcleos de las células germinales se agrupan en el polo posterior del embrión, como se ve en los ciclos 6 (embrión inclinado hacia adelante) y 7-9, después de lo cual se intercalan con núcleos somáticos. La eliminación del cromosoma L en el linaje somático ocurre en la división de escisión 5 o 6; La eliminación del cromosoma X en el linaje somático se produce en la7ª,8ª o9ª división de escisión. La celularización ocurre durante la interfase del ciclo 11. La tabla de la izquierda muestra la duración media de cada ciclo de división a 22 °C. La mesa de la izquierda y el panel de la derecha están adaptados con permiso de de Saint Phalle y Sullivan35. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: Los embriones de B. coprophila emergen como larvas. Un grupo de embriones (flecha gruesa azul) se ve cerca del ovipositor de la hembra adulta que murió después de la puesta de huevos. Una semana después de la puesta de huevos, los embriones se convierten en larvas jóvenes, varias de las cuales están indicadas por las flechas negras. Las larvas recién emergidas tienen una mandíbula negra en el extremo anterior y un cuerpo translúcido. Se mueven sobre la superficie del agar y no deben confundirse con el moho que no se mueve. El recuadro muestra algo de moho, con un filamento blanco (flecha roja) y una espora negra en su punta (flecha verde), y es muy ligeramente más pequeño que las larvas recién emergidas. Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 7: Estadios de las manchas oculares de las larvas de B. coprophila . Las manchas oculares se forman en la parte anterior de la larva, justo detrás de la mandíbula, y están compuestas de gránulos de pigmento que aumentan en número. Las manchas oculares son el anlage del ojo adulto. El panel superior muestra las larvas que fueron visualizadas con un microscopio de disección; El panel inferior es una vista ampliada de las manchas oculares utilizando un microscopio de contraste de fase para visualizar una larva en un portaobjetos de microscopio con una gota de agua destilada y un cubreobjetos flotando ligeramente en la parte superior. La nomenclatura de los estadios de las manchas oculares es de acuerdo con Gabrusewycz-Garcia30 , donde el número de gránulos se cuenta en la fila más larga (por ejemplo, 12) y el número de filas adicionales excluyendo la fila más larga se anota (por ejemplo, 6 para la etapa de manchas oculares 12×6). El inicio de la amplificación del ADN específico del sitio en los cromosomas politénicos de la glándula salival comienza en la etapa de mancha ocular 10×5 y se completa en 14×7 cuando hay un estallido de transcripción en el locus y expansión de las bocanadas de ADN31. En la siguiente etapa de ojo de borde/mandíbula caída, los gránulos de la mancha ocular comienzan a fusionarse y se alejan lateralmente de la línea media; La longitud del cuerpo larvario se acorta. Además, las bocanadas de ADN se condensan en esta etapa. Se tarda aproximadamente un día a 21 °C en atravesar cada etapa de la mancha ocular. Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 8: Desarrollo de las pupas de B. coprophila . Durante la pupa, todos los tejidos larvarios histalizan excepto el sistema nervioso y son reemplazados por tejidos adultos que surgen por divisiones celulares de los discos imaginales. El color del cuerpo cambia de blanco a tostado, marrón a negro. El pigmento se llena gradualmente en el ojo de la pupa; Las meiosis I y II ocurren en pupas masculinas con ojos que están llenos de 1/4 a 1/2 pigmento36. Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Nombre de la acción Marcadores Tasa de fecundidad Comentarios 7298 Ala ondulada (W) ~75% HoLo2 Ala ondulada (W) ~90% Derivado de 7298 W14 Ala ondulada (W); Ojos blancos ~95% derivado de HoLo2 6980 Ala ondulada (W); venas inflamadas (SW) ~65% AÑOS 91 ala ondulada débil (W); alas pequeñas (p) ~50% el marcador ondulado se introdujo en una cruz para rescatar el 91S Tabla 2: Poblaciones de Bradysia (Sciara) coprophila. En la Tabla 1 de Gerbi6 se enumeran estos marcadores y otros que ya no existen. Cinco translocaciones (T1, T23, T29, T32, T70) en el extremo del centrómero del X27 se resumen en la Figura 8 de Gerbi6 , pero ya no existen. Archivo Suplementario 1: Cruces HoLo2 (y 7298 y W14), cruce 91S y rescate, cruce 6980, cruces de translocación. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Los protocolos presentados aquí para la cría de B. coprophila serán útiles para los científicos que deseen criar este organismo en sus laboratorios para realizar experimentos que profundicen en sus características biológicas únicas. La descripción inicial del método de alimentación utilizando levadura y polvo de hongos espolvoreados sobre una base de agar para mantener B. coprophila²⁹ se utilizó en el laboratorio de Metz para criar 14 especies diferentes de moscas Sciarid⁵. Posteriormente, se observó que la adición de ortiga y/o espinaca en polvo aumentaba aún más la vitalidad de B. coprophila (Gabrusewycz-García, comunicación personal). Estos métodos han sido exitosos para el mantenimiento de especies relacionadas dentro de la familia Sciaridae, incluyendo Bradysia impatiens y Lycoriella ingenua que se encuentran actualmente en cultivo (Robert Baird, comunicación personal).

Se han probado otros métodos (como los métodos de alimentación alternativos que se describen a continuación) para criar B. coprophila, pero los protocolos descritos aquí se han optimizado para tener la proporción más favorable de larvas por área de superficie de agar para obtener los adultos de grasa más fértiles y minimizar el crecimiento de moho. Para ampliar, el acoplamiento masivo se puede realizar en viales de vidrio, como se describe en el protocolo 2 anterior. Alternativamente, se pueden colocar unas pocas (2-4) hembras adultas junto con el doble de machos adultos en un matraz como el que se usa para criar Drosophila (botella desechable de polipropileno de Drosophila de 6 oz. = 177.4 mL de fondo cuadrado). En ambos casos, el investigador debe estar plenamente seguro de que el matraz contiene sólo todas las madres productoras femeninas o todas las madres productoras masculinas.

Solo alimenta a las larvas ya que las pupas y los adultos no comen. No alimente el vial si las larvas se han convertido en pupas (un signo de esto es cuando aparecen las primeras moscas adultas que emergen temprano). Una vez que los adultos se cierren, coloque los viales en una incubadora más fría (por ejemplo, 16 ° C) si está disponible, ya que esto permitirá que los adultos vivan más tiempo. Alimente tres veces por semana (por ejemplo, lunes, miércoles y viernes), aumentando la cantidad de alimento que se le da por vial a medida que las larvas envejecen. Aliméntelo generosamente y será recompensado con adultos gordos y fértiles. Sin embargo, si alimenta demasiado, aparecerá moho blanco y esa es una señal para reducir la cantidad de comida que está depositando en un vial. Además, si alimenta demasiado, se desarrollará una almohadilla espesa de comida en la parte superior del agar y dificultará la salida de los adultos (puede quitar la almohadilla con una pinza, pero tenga cuidado de no sacar las larvas con la almohadilla, es mejor no tener que hacer esto en absoluto). Los viales con pocas larvas (marcados como “pocas”) necesitan menos alimento. Si alimenta demasiado poco, las larvas treparán por las paredes del vial en busca de alimento. Las larvas mal alimentadas dan lugar a adultos pequeños que son menos fértiles.

Métodos alternativos de alimentación
Se han intentado varios métodos para alimentar a las larvas solo una vez durante la etapa larvaria en lugar de 3 veces por semana. B. coprophila no crecerá en alimentos al estilo de Drosophila . John Urban (comunicación personal) intentó mezclar comida de B. coprophila con el agar, pero creció demasiado moho. Descubrió que la adición de dos inhibidores de moho (tegosept y ácido propiónico) en combinación y por separado, probando varias concentraciones diferentes, eran todos tóxicos para B. coprophila a niveles que inhiben el moho. El agar debe tener un pH de 6-7 (neutro) ya que B. coprophila se enferma a un pH ácido (como con el ácido propio). Alternativamente, para obviar la alimentación tres veces por semana, intentó usar una espátula o jeringa sin aguja para dispensar una pasta de levadura espesa (levadura seca activa Red Star mezclada con un poco de agua destilada para humedecerla) como una cucharada encima del agar en cada vial una semana después del apareamiento (es decir, aproximadamente en el momento en que las larvas comenzarán a emerger).

Otro método para evitar la alimentación tres veces por semana es agregar un cultivo vivo de hongos a cada vial. Bath y Sponsler³⁷ informaron que una superficie de agar inclinada con el medio de Sabouraud debe ser veteada con un cultivo fúngico de los géneros Chaetoconidia (best) o bien Baplosporangia o Xllescheria. El hongo se cultivó de varios días a una semana antes de que se introdujera B. coprophila . Después de esto, no fue necesario alimentarse. Una variante de este método también fue empleada por Ellen Rasch (comunicación personal). En nuestras manos, los viales estaban demasiado mojados con este método y las larvas se ahogaban, pero se pudo intentar de nuevo para optimizar el número de larvas en relación con los viales con hongos vivos.

Arthur Forer (comunicación personal) ha tenido cierto éxito en la cría de B. coprophila de la misma manera que las moscas de la grulla³⁸. Con este enfoque, las pupas se criaban en papel maché húmedo. Posteriormente, los adultos se aparearon y los huevos se depositaron en papel maché fresco y húmedo. Las larvas resultantes se mantuvieron en papel maché en placas de Petri y se alimentaron con hojas de ortiga en polvo dos veces por semana. Las pupas se colocaban en una jaula para repetir el ciclo.

Yukiko Yamashita (comunicación personal) ha intentado sin éxito criar B. coprophila en el suelo, imitando las condiciones en las que se encuentran en la naturaleza en plantas en macetas e invernaderos con alta humedad. Sin embargo, el moho puede convertirse en un problema cuando se eleva el nivel de humedad. No obstante, el suelo húmedo se ha utilizado con éxito para criar larvas de Pseudolycoriella (anteriormente Bradysia) hygida en cajas de plástico con suelo húmedo; se alimentan con hojas de Ilex paraguariensis descompuestas, suplementadas en la vida larvaria tardía con 1,2% de extracto de levadura, 1,4% de almidón de maíz, 0,8% de harina de avena, 1,2% de agar¹². Del mismo modo, el suelo húmedo puede ser reemplazado por turba húmeda con frijoles rojos triturados para criar moscas Sciarid^39,40.

Se han empleado otros métodos para mantener cultivos de laboratorio de Bradysia: (i) papa esterilizada en autoclave a la que se agrega levadura y fertilizante de sangre seca⁴¹; ii) estiércol 42,43,44 al que se puede añadir sangre seca⁴⁵; iii) Recipientes de plástico con almohadillas de algodón y toallas de papel humedecidas con soja molida⁴⁶.

Ácaros
Los ácaros pueden transferirse de Drosophila a B. coprophila. Para minimizar esto, es mejor mantener B . coprophila en una incubadora o habitación separada, no cerca de las poblaciones de Drosophila . Además, realice cualquier trabajo de mantenimiento de B. coprophila temprano en el día antes de manipular Drosophila. Los ácaros también pueden transferirse a B. coprophila desde las plantas de interior, así que no mantenga las plantas en la misma habitación que B. coprophila. Si los ácaros invaden los viales, se pueden ver como pequeños organismos esféricos blancos arrastrándose por el cuerpo de B. coprophila. Los tratamientos químicos que funcionan para destruir los ácaros en Drosophila no se pueden usar para B. coprophila, ya que los productos químicos matan a B. coprophila (B. coprophila también es sensible a los humos orgánicos como el fenol). El único tratamiento para eliminar las reservas de ácaros de B. coprophila es recolectar manualmente los embriones en una placa de agar, examinar cada uno para detectar la ausencia de ácaros y luego transferirlos a viales de agar frescos con un pincel fino. Los tapones de gasa rellenos de algodón y los tapones de espuma de acetato de celulosa (como los utilizados para los viales de polipropileno de Drosophila ) ayudan a prevenir la entrada de ácaros en los viales.

Utilidad de los protocolos de cría
Los protocolos descritos aquí permitirán a la creciente comunidad de científicos criar B. coprophila como un organismo modelo emergente nuevo/antiguo para estudiar sus características biológicas únicas. Se anima a nuevos grupos de laboratorio a unirse a la creciente comunidad para mantener e investigar las características biológicas únicas de Bradysia (Sciara).

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Un agradecimiento especial a los anteriores ganaderos de B. coprophila (Jacob E. Bliss, Paula Bonazinga, Anne W. Kerrebrock, Ingrid M. Mercer, Heidi S. Smith) y al personal de investigación (especialmente a Robert Baird, Michael S. Foulk, Donna Kubai, John M. Urban, Yutaka Yamamoto) por afinar los protocolos de cría. Las instrucciones iniciales sobre el cuidado de B. coprophila fueron proporcionadas por Helen V. Crouse, Natalia Gabrusewycz-Garcia, Reba M. Goodman, Charles W. Metz y Ellen Rasch. Con gratitud a Yukiko Yamashita y Anne W. Kerrebrock por hacerse cargo del centro de acciones de Bradysia (Sciara). Mucho agradecimiento a las siguientes personas por su útil preparación de las figuras: Brian Wiegmann (Figura 1), John M. Urban (Figura 4 panel superior), Laura Ross (Figura 4 panel inferior), Yutaka Yamamoto (Figura 5 panel izquierdo), Leo Kadota (Figura 7 y Figura 8). Muchas gracias a Ava Filiss y al Laboratorio Multidisciplinario de la Universidad de Brown por su ayuda con la fotografía y la filmación. Gracias a Robert Baird por sus comentarios sobre este manuscrito. Nuestra investigación y mantenimiento de B. coprophila ha sido apoyada por los NIH y la NSF, incluido el apoyo más reciente de NIH GM121455 a S.A.G. Más detalles sobre B. coprophila están disponibles en los sitios web del Bradysia (Sciara) Stock Center (https://sites.brown.edu/sciara/ y https://sciara.wi.mit.edu) que se están construyendo actualmente.

Materials

Agar (bacteriological)	U.S. Biological	A0930	https://www.usbio.net;
CO₂ FlyStuff Foot Pedal	Genesee Scientific	59-121
CO2 FlyStuff Blowgun	Genesee Scientific	54-104
CO2 FlyStuff UltimaterFlypad	Genesee Scientific	59-172	https://www.geneseesci.com
Ether fume hood	Labconco	3955220	Sits on top of lab bench
			Filter replacement cat # 6961300
Food: Brewer’s Yeast Powder	Solgar		Obtain from Amazon or health food store
			https://www.solgar.com;
Food: Nettle Powder (pesticide free)	Starwest Botanicals	209460-51
Food: Shitake Mushrooms (pesticide free)	Starwest Botanicals	202127-5	https://www.starwest-botanicals.com;
Food: Spinach Powder ( pesticide free)	Starwest Botanicals	209583-5
Food: Straw (pesticide free )	Starwest Botanicals	209465-3
Jar: clear glass, polypropylene lid	Fisher Scientific:	FB02911765	73 mm dia, 89 mm ht (240 ml) https://www.fishersci.com;
Needle Probe, wooden handle	US Geo Supply Inc	SKU: 4190	5.75” long probe, stainless steel needle https://usgeosupply.com; (970)-434-3708
Vials: glass, preferred:	Wilmad LabGlass
Wilmad-glass custom vials			28-33 mm inner dia, 33 mm outer dia, 9.5 cm ht Wilmad: https://www.SP-WilmadLabglass.com
Vials: glass (cheaper and ok)	Fisher Scientific	03-339-26H	29 mm outer dia, 9.5 cm h https://www.fishersci.com;
Vials: glass (a bit narrow)	Genesee Scientific	32-201	24.5 mm outer dia,9.5 cm h thttps://www.geneseesci.com
Vials: polypropylene	Genesee Scientific	32-114	28.5 mm outer dia,9.5 cm ht
Vial Plugs
roll of non-absorbent cotton	Fisher Scientific	22-456881
cheesecloth	Fisher Scientific	22-055053	https://www.fishersci.com;

References

Lewin, H. A., et al. Earth BioGenome project: Sequencing life for the future of life. Proc Natl Acad Sci USA. 115 (17), 4325-4333 (2018).
Wiegmann, B. M., et al. Episodic radiations in the fly tree of life. Proc Nat Acad Sci USA. 108 (14), 5690-5695 (2011).
Yeates, D. K., Wiegmann, B. M. Phylogeny of Diptera. Manual of Afrotropical Diptera.Suricata. 3, 149-161 (2017).
Vilkamaa, P., Burdíková, N., Ševčík, J. The genus Spinopygina gen. nov. (Diptera, Sciaridae) from Western North America: Preliminary molecular phylogeny and description of seven new species. Insects. 14 (2), 173 (2023).
Metz, C. W. Chromosome behavior, inheritance and sex determination in Sciara. Amer Naturalist. 72 (743), 485-520 (1938).
Gerbi, S. A., Hennig, N. Unusual chromosome movements in Sciarid flies. Results and Problems in Cell Differentiation. Vol 13 Germ Line – Soma Differentiation. 13, 71-104 (1986).
Gerbi, S. A., Larracuente, A., Hanlon, S. Non-random chromosome segregation and chromosome eliminations in the fly Bradysia (Sciara). 34;Non-Mendelian Inheritance and Meiotic Drive.", Chromosome Research.(special issue). 30, 273-288 (2022).
Steffan, W. A. A generic revision of the family Sciaridae (Diptera) of America North of Mexico. University of California Publications in Entomology. 44, 1-77 (1966).
Shin, S., Jung, S., Menzel, F., Heller, K., Lee, H. Molecular phylogeny of black fungus gnats (Diptera: Sciaroidea: Sciaridae) and the evolution of larval habitats. Molec Phylogenetics Evolution. 66 (3), 833-846 (2013).
Mohrig, W., Heller, K., Hippa, H., Vilkamaa, P., Menzel, F. Revision of the black fungus gnats (Diptera: Sciaridae) of North America. Studia Dipterologica. 19 (1-2), 141-286 (2013).
Ševčík, J., et al. Molecular phylogeny of the megadiverse insect infraorder Bibionomorpha sensu lato (Diptera). PeerJ. 4, e2563 (2016).
Menzel, F., et al. Pseudolycoriella hygida (Sauaia and Alves)-An overview of a model organism in genetics, with new aspects in morphology and systematics. Insects. 15 (2), 118 (2024).
Meigen, J. W. . Klassifikazion und Beschreibung der europäischen zweiflügligen Insekten (Diptera Linn). 1 (1), (1804).
Johannsen, O. A. The fungus gnats of North America part I. Maine Agricultural Experimental Station Bulletin. 172, 209-276 (1909).
Johannsen, O. A. Mycetophilidae of North America. Maine Agricultural Experimental Station Bulletin. 200, 57-146 (1912).
Urban, J. M., et al. Bradysia (Sciara) coprophila larvae up-regulate DNA repair pathways and down-regulate developmental regulators in response to ionizing radiation. Génétique. (3), (2024).
Hodson, C. N., Jaron, K. S., Gerbi, S., Ross, L. Gene-rich germline-restricted chromosomes in black-winged fungus gnats evolved through hybridization. PLoS Biology. 20 (2), e3001559 (2021).
Urban, J. M., et al. High contiguity de novo genome assembly and DNA modification analyses for the fungus fly, Sciara coprophila, using single-molecule sequencing. BMC Genomics. 22, 643 (2021).
Baird, R. B., et al. Recent evolution of a maternally acting sex-determining supergene in a fly with single-sex broods. Mol Biol Evol. 40 (7), (2023).
Yamamoto, Y., Gerbi, S. A. Making ends meet: targeted integration of DNA fragments by genome editing. Chromosoma. 127 (4), 405-420 (2018).
Yamamoto, Y., Gerbi, S. A. Development of transformation for genome editing of an emerging model organism. Genes. 13 (7), 1108-1124 (2022).
Metz, C. W., Smith, H. B. Further observation on the nature of the x-prime (X’) chromosome in Sciara. Proc Nat Acad Sci USA. 17 (4), 195-198 (1931).
Crouse, H. V. X-ray induced sex-linked recessive lethals and visibles in Sciara coprophila. Amer Naturalist. 95 (880), 21-26 (1961).
Metz, C. W., Ullian, S. S. Genetic identification of the sex chromosomes in Sciara (Diptera). Proc Nat Acad Sci USA. 15 (2), 82-85 (1929).
Crouse, H. V. X heterochromatin subdivision and cytogenetic analysis in Sciara coprophila (Diptera, Sciaridae). I. Centromere localization. Chromosoma. 63, 39-55 (1977).
Crouse, H. V., Gerbi, S. A., Liang, C. M., Magnus, L., Mercer, I. M. Localization of ribosomal DNA within the proximal X heterochromatin of Sciara coprophila (Diptera, Sciaridae). Chromosoma. 64 (4), 305-318 (1977).
Crouse, H. V. X heterochromatin subdivision and cytogenetic analysis in Sciara coprophila (Diptera, Sciaridae). II. The controlling element. Chromosoma. 74, 219-239 (1979).
Mok, E. H., et al. Maintenance of the DNA puff expanded state is independent of active replication and transcription. Chromosoma. 110 (3), 186-196 (2001).
Smith-Stocking, H. Genetic studies on selective segregation of chromosomes in Sciara coprophila Lintner. Génétique. 21 (4), 421-443 (1936).
Gabrusewycz-Garcia, N. Cytological and autoradiographic studies in Sciara coprophila salivary gland chromosomes. Chromosoma. 15, 312-344 (1964).
Wu, N., Liang, C., DiBartolomeis, S. M., Smith, H. S., Gerbi, S. A. Developmental progression of DNA puffs in Sciara coprophila: amplification and transcription. Dev Biol. 160 (1), 73-84 (1993).
Yamamoto, Y., Gustafson, E. A., Foulk, M. S., Smith, H. S., Gerbi, S. A. Anatomy and evolution of a DNA replication origin. Chromosoma. 130 (2-3), 199-214 (2021).
Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
Bertone, M. A., Courtney, G. W., Wiegmann, B. M. Phylogenetics and temporal diversification of the earliest true flies (Insecta: Diptera) based on multiple nuclear genes. Syst Entomol. 33, 668-687 (2008).
de Saint Phalle, B., Sullivan, W. Incomplete sister chromatid separation is the mechanism of programmed chromosome elimination during early Sciara coprophila embryogenesis. Development. 122 (12), 3775-3784 (1996).
de Saint Phalle, B., Oldenbourg, R., Kubai, D., Salmon, E. D., Gerbi, S. A. Paternal chromosome elimination and X non-disjunction on asymmetric spindles in Sciara male meiosis. BioRxiv. , (2021).
Bath, J. D., Sponsler, O. L. An alternative method for the culture of Sciara larvae. Science. 109 (2828), 255 (1949).
Forer, A. Crane fly spermatocytes and spermatids: A system for studying cytoskeletal components. Methods Cell Biol. 25, 227-252 (1982).
Gillespie, D. R. A simple rearing method for fungus gnats Corynoptera sp. (Diptera: Sciaridae) with notes on life history. J Entomol Soc Br Colum. 83, 45-48 (1986).
Gardiner, R. B., Jarvis, W. R., Shipp, J. L. Ingestion of Pythium spp. by larvae of the fungus gnat Bradysia impatiens (Diptera: Sciaridae). Ann Appl Biol. 116, 205-212 (1990).
Hungerford, H. B. Sciara maggots injurious to potted plants. J Econ Entomol. 9 (6), 538-549 (1916).
Thomas, C. A. A method for rearing mushroom insects and mites. Entomol News. 40, 222-225 (1929).
Austin, M. D., Pitcher, R. S. A laboratory method for rearing Sciara and phorid flies. Entomol Mon Mag. 72, 12-15 (1936).
Butt, F. H., Galtsoff, P. S., Lutz, F. E., Welch, P. S., Needham, J. G. Culture of Sciara. Culture methods for invertebrate animals. , 400-401 (1937).
Hudson, E. K. Regulation of greenhouse sciarid fly populations using Tetradonema plicans (Nematoda: Mermithoidea). J Invert Pathol. 23 (1), 85-91 (1974).
Wilkinson, J. D., Daughterty, D. M. Comparative development of Bradysia impatiens (Diptera: Sciaridae) under constant and variable temperatures. Ann Entomol Soc Am. 63 (4), 1079-1083 (1970).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citer Cet Article

Gerbi, S. A. Laboratory Maintenance of the Lower Dipteran Fly Bradysia (Sciara) coprophila: A New/Old Emerging Model Organism. J. Vis. Exp. (206), e66751, doi:10.3791/66751 (2024).