薬効研究のためのシャーガス病モデルマウスのIn vivo生物発光イメージングの謎解き

この議定書に記載されているすべての手順は、サンパウロ大学のInstituto de Ciências Biomédicasの動物倫理委員会によって事前に設定されたガイドライン14 に従って提出、承認、および実施されました:プロトコルCEUA ICB/USP no 5787250522。 1. ソリューション 注:10 mL / kg(マウスの重量20 gの場合は200 μL)15,16の予め調整された投与容量を考慮してください。例えば、150 mg/mLの動物用投与量に達するには、15 mg/mLの作業溶液を調製します。 ヒドロキシプロピルメチルセルロース懸濁液(HPMC-SV)注:必要な試薬は、0.5%(w / v)ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、0.4%(v / v)Tween 80、および0.5%(v / v)ベンジルアルコールです。ビヒクル溶液200 mLの場合、HPMC1 gを秤量し、64 mLの熱い超純水に溶解します。2分間攪拌します。 氷冷した超純水120mLを加え、1時間撹拌する。ベンジルアルコール1mLを加えます。 次に、リバースピペッティング技術を使用して0.8 mLのTween 80を加え、溶液が透明になるまで攪拌を続けます。 最終容量の200mLに溶液を調整します。HPMC-SVは冷蔵(4°C)で最大3か月間保管してください。 ベンズニダゾール次のように、必要な化合物溶液の量を計算します。化合物溶液の量=(各日の投与量×日数×治療するマウスの数×各マウスの投与量)+30%追加。 必要な用量を考慮して、必要な量のベンズニダゾール(BZ)を秤量します。.根治的治療として、100 mg/kg を 1 日 1 回 10 日間経口投与すると、CD 慢性モデル17 で 100% 治癒します。 所望の最終容量を考慮して、5%(v / v)DMSOの濃度に達するための適切な量を計算し、BZをきれいなDMSOに完全に溶解します。 車両の適切な容量をガラス管に加えて、95%(v / v)HPMC-SVの濃度に到達します。DMSOに溶解したBZをHPMC-SVの入ったガラス管に移します。懸濁液を精力的に均質化し、4°Cで保存します。例:BZ製剤の最終容量 = 10 mL(ステップ1.2.1)BZの量= 100 mg(ステップ1.2.2)5% DMSO = 0.5 mL(ステップ 1.2.3)および 95% HPMC-SV = 9.5 mL(ステップ 1.2.4) 各薬物投与の前に、製剤を超音波水浴に37°Cで5分間入れ、動物投与前に精力的に均質化します。 シクロホスファミド必要な量のシクロホスファミドを超純水に溶解して、12.5 mg/mLの溶液にします。 溶液をろ過して滅菌し、4°Cで保存します。 ギムザステイン0.6 mgのGemsa粉末試薬を50 mLのメタノールに溶解します。グリセロール25mLを加えて混ぜます。濾紙と漏斗を使用して沈殿物を取り除きます。ストック溶液は、光から保護した室温(RT)で保管してください。 10 mLのGimsa溶液を90 mLのMix-Phosphate Buffer(20.5 M Na2HPO4、65.4 M KH2PO4 、pH 7.2)で希釈して、作業溶液を調製します。 2. トリパノソーマcruzi 培養 生物学的安全キャビネット(BSC)で、4 x 106 エピマスティゴート/mL の T. cruzi CL Brener Luc::Neon11 を LIT 培地 (68.44 mM NaCl、5.36 mM KCl、112.7 mM Na2HPO4、5 g/L トリプトン、5 g/L 肝臓注入ブロス、0.03 M ヘミン、4.16 mM グルコース) で培養し、10% (v/v) ウシ胎児血清 (FBS) を補充します。 100 μg/mL ペニシリン、100 U/mL ストレプトマイシン、150 μg/mL ハイグロマイシンを選択的薬物として 28 °C で投与。 寄生虫は通常、3〜4日で固定相を達成します。 10 mLのGrace’s Insect培地に3 x 108 エピマスティゴテスと10%(v / v)FBSを15 mLコニカルチューブ、28°C、28〜10日間インキュベートすることにより、感染性寄生虫を取得するためのメタサイクロジェネシスを誘導します。 Giemsa染色塗抹標本による分化率を評価します。そのためには、分化した寄生虫20μLをスライドガラスに広げ、10分間乾燥させます。 ドラフト内で、スライドガラスをきれいなメタノールで覆ってサンプルの固定を進め、完全に乾かします(1〜2分)。スライドガラスをギムサ作業溶液で20分間覆います。 スライドガラスを蒸留水でやさしく洗います。顕微鏡で、メタサイクリックトリポマスティゴートの割合を数えます。少なくとも 10% の差別化率が達成された場合は、次の手順に進みます。 寄生虫を遠心分離し(120 x g で10分間)、ペレットを10 mLのDPBSで再懸濁します。もう一度遠心分離し、10%(v / v)のFBS、100 μg / mLペニシリン、および100 U / mLストレプトマイシンを添加した5 mLのDMEMに寄生虫を再懸 ?? します。. 25cm2の培養フラスコにおいて、加湿インキュベーター18において、5%CO2中の37°Cで1.66×105LLC−MK2細胞(Macaca mulatta由来の腎臓上皮細胞)の感染を行う。 組織培養トリポマスチゴテ(TCT)は、8〜9日後に培地に放出されます。新鮮なLLC-MK2細胞単層にTCTを1:40の感染多重度(MOI)で感染させます。 3. フローサイトメーターによる Trypanosoma cruzi の集団均質性の解析 CL Brener Luc::NeonおよびCL Brener野生型株のTCTを回収し、120 x g で10分間遠心分離し、TCTをDPBSに再懸濁します。寄生虫の密度を調整して、1 x 106/mLになるようにします。 mNeonGreen 蛍光 (ex. 506/em. 517 nm)19 に基づくフローサイトメーターによるポピュレーション解析を進め、各サンプルについて少なくとも 20,000 のイベントを取得します。注:蛍光個体数の割合は、野生型とトランスフェクションされた寄生虫を比較することによって得られます。マウスの感染を進めるには、CL Brener Luc::Neon系統の蛍光寄生虫集団の最低95%を達成する必要があります(補足図1)。 4.マウス実験感染 注:寄生虫の量を増やすために、血流トリポマスティゴテス(BT)は免疫不全マウスから頻繁に得られる10,13。そのために、シクロホスファミド(CTX)を62.5mg/kgで96時間間隔で4回腹腔内注射することで軽度の免疫抑制が達成され、これはT. cruzi感染と同時に行われます。 T. cruzi 感染の 1 日前に、腹腔内注射 (i.p.) で 62.5 mg/kg の滅菌シクロホスファミドを投与します。 腹腔内経路を通じて、0.2 mLのDPBS中の1 x 104 TCTを各マウスに感染させます。病原体や針を取り扱う際の事故のリスクが高いことへの注意。BSCで感染を行い、手順全体を通して手袋とフェイスシールドを着用します。 血液中のBTを直接観察することにより、寄生虫症を毎日監視する(Pizzi-Brener法)20。寄生虫症のピーク時、感染後約13-17日(dpi)で採血を行います。そのためには、100 mg / kgのケタミンと10 mg / kgのキシラジンでマウスを麻酔します。 マウスが完全に麻酔されたら21、50μLの3.8%(w/v)クエン酸ナトリウムを含む24G X3/4針に取り付けられた1mLシリンジを使用して心臓穿刺を進める。針を抜き、血液を遠心チューブにそっと入れます。 BSCでは、アンモニウム-塩化カリウム(ACK)溶解緩衝液中の血液アリコートの希釈を行い、ノイバウアーチャンバー内の寄生虫をカウントします。小さな血栓が寄生虫のカウントに影響を与えるため、この手順を少なくとも2回繰り返します。注:カウントエラーを防ぐために、ノイバウアーチャンバー内のカウントが30未満および300を超えるトリポマスティゴートを避けるために希釈係数を調整します。 DPBSで必要な量の純血を混合することにより、寄生虫密度を5 x 103 BT / mLに調整します。 非免疫抑制BALB/cマウスに、マウスあたり0.2mLのDPBS(5×103BT/mL)に1×103 BTを感染させ、26G針を用いた腹腔内経路で感染させる(細い針は寄生虫溶解につながる)22。ボリュームを腹腔内に注入した後、逆流を避けるために針をマウス内に5秒間保持します。. 感染したマウスをペーパータオル付きの箱に一時的に入れて、漏れや出血の可能性を特定し、マウスをケージに戻します。 5. in vivo イメージング 注:ここで使用される用語集は次のとおりです。 イメージングセッション:特定の日に特定の実験のすべてのグループで行われた生物発光取得。 図 1A は、手順の概要を示しています。 イメージングラウンド:D-ルシフェリン注射から麻酔回復まで、3匹のマウスのサブグループで実施される手順。各実験群には、寄生虫負荷の固有の変動性や、以下に説明するBLI定量に影響を与えるその他の要因があるため、6匹のマウスを含めることをお勧めします。 イメージング取得:生物発光を定量化するためにイメージング機器によって行われる写真撮影により、写真と定量化された生物発光が擬似カラースケールとして示される画像オーバーレイが得られます。 イメージング手順:プロトコルのこのセッションで説明したすべての手順。 図1:BLIデータの取得 (A)シャーガス病生物発光マウスモデルを例に、感染症研究に適用した取得ワークフローの図。遺伝子組み換え T. cruzi に感染したマウスを、確立された時点の in vivo イメージングにより解析します。各イメージングラウンドで、最大3匹のマウスのグループに150 mg / kgの酵素基質(D-ルシフェリン)を注入します。5分後、酸素中の2.5%(v / v)イソフルランで麻酔を投与します。.完全に動かなくなった場合、マウスをイメージングシステムに入れ、定義された設定に従って取得を開始します。イメージング後、マウスは麻酔から回復し、ケージに戻されます。取得中に研究者が抱えている可能性のある、または直面する可能性のある頻繁な質問や問題は、赤で強調表示されています。 このスキームは、Lewis et al. (2014)12 (BioRender.com: UD26KWEVS2で作成) から修正されています。(B)D-ルシフェリン/赤方偏移ホタルルシフェラーゼ(PpyRE9h)の 生体内 動態。 T. cruzi 寄生虫血症ピーク(n = 3)のマウスに麻酔をかけ、150 mg / kgのD-ルシフェリンを注射しました。画像は1時間(露光時間:2分、ビニング:4)で取得しました。上:腹側全磁束(p / s)の定量化(左Y軸、赤)および最高平均測定値の割合(右Y軸、青)。データは平均値(曲線)と標準偏差(影付きの領域)で表示されます。下:最初の時点(4 分)、最も高い BLI 信号(30 分)、および最後(62 分)の時点の画像を取得。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 [Acquisition] ウィンドウの緑色のバーで、CCD(Charge-Coupled Device)カメラが低温(-90 °C)でないか確認します。バー(緑または赤)をクリックして、温度を視覚化します。注意: イメージング機器のマニュアルによると、CCDを冷たく保つために、イメージング機器とソフトウェアは常にオンにする必要があります。 自動背景調整が実行されたかどうかを確認します。これを行うには、「 Acquisition > Background」>「View available Dark Charge」をクリックします。いくつかの設定の組み合わせのリストが表示されます。注:この手順により、発光ノイズが低減されます。選択した構成の結果が 1000 より大きい値になる場合は、式 “露光時間 x (binning²)” に基づいて、ダーク チャージを無視しないでください。ソフトウェアの構成に応じて、ビニングは数値 (ビニング係数) または ‘small’ から ‘large’ の範囲として表示できます。範囲とビニング係数の対応関係は、デバイスのマニュアルに記載されています。 アクティビティウィンドウ(ソフトウェアの下部にある白い領域)が表示されない場合は、メニュービュー>アクティビティウィンドウで有効にします。 イメージングエリアを設定するには 、Acquisition Window > Field of Viewをクリックします。オプションC (13.2cm)は3匹、 オプションD (22cm)は5匹のマウスを取得します。 [Acquisition > Auto-Save]をクリックして自動保存オプションを選択し、各時点の新しいフォルダを選択または作成します。 つや消しの黒い紙をイメージングエリアに置き、仕切りスライドをインレットの間に垂直に置きます。メーカーがスライドを提供していない場合は、つや消しの黒紙(3 cm x 15 cm)を使用してください。 イメージングチャンバーの内部領域を調整して、ガラス製のノーズコーンを麻酔インレットに合わせます。黒い電気テープの小片を使用して、麻酔システムをプラットフォーム(画像領域の外側)に取り付けます。注意: イメージングデバイスの一部のバージョンでは、レーザーがイメージング領域を定義します。このツールが利用できない場合は、ソフトウェアを使用して画像を取得し、イメージングエリア内のパーティションスライドを確認してください。 イソフルラン気化器を、イメージングチャンバーと誘導チャンバーの酸素中2.5%(v / v)に設定します。ガスがシステム21を流れているかどうかを圧力計で確認してください。注:イメージングデバイスに吸入麻酔システムが取り付けられていない場合は、注射可能なキシラジンやケタミン23などの他の麻酔オプションが可能です。この場合、マウスの回復は遅く、死亡リスクは高い24。 注射器(31G針)にD-ルシフェリンを充填し(D-ルシフェリンを調製するための包括的なプロトコルは、異なる供給業者から提供されています)25,26、直射日光からそれらを保護し、ペーパータオルで内部を覆うことによって、いくつかのプラスチック容器または追加のケージを準備します。 時間を簡単に追跡できるように時計や時計を近くに置いておくと、マウスのグループ、ルシフェリン注射時間、および手順中のその他の情報を登録するための実験ノートがあります。 すべてのマウスの体重を量り、体重を登録します。各マウスの尻尾にペンマーカーまたはタトゥーで印を付けます。実験全体を通してマウスの識別を良好に表示します。このステップは、買収の前日に実行することもできます。注:インクが生物発光シグナルに干渉する可能性があるため、マークは大きな体面積を占めないようにする必要があります。異なる色の油性マーカーも、グループを区別するのに役立ちます。 イメージングセッションを開始するには、背景の発光画像を登録します(設定: 露光時間:5分; ビニング:「大」または「16」、 f /ストップ:1)マウスなしのイメージングチャンバー。この手順は、自動発光光源または機器の望ましくない問題を特定するのに役立ちます。注:BLIは酵素反応に基づいているため、実験の本質的な特徴は時間です。動物の取り扱いを開始する前に、上記のすべての項目と機器の設定を確認してください。 最初の3匹のマウスに150 mg / kg(i.p.)のD-ルシフェリンを注射します。マウスをコンテナボックスに入れて、D-ルシフェリンが漏れるかどうかを評価します(明るい黄色の溶液)。その場合はメモを取り、マウス群とD-ルシフェリンの投与時間を登録してください。 5分待ってから、マウスを麻酔導入チャンバーに移します。システムの電源を入れます。マウスが完全に麻酔されるまでに約3分かかります(足の震え、尻尾などの反応はありません)21. イメージングデバイスのドアを開け、イメージングチャンバーへの麻酔の流れをオンにすると同時に、誘導チャンバーをオフにします。 各マウスをノーズコーンの位置に置きます:マウス1〜3から左から右側へ。レーザーで示されるイメージング領域内に腹側を上にしてマウスを穏やかに収容します。アコモデーション中に、マウスのIDと位置を確認してください。鼻の円錐形に部分的に麻酔をかけたマウスの入場を強制しないでください。 パーショニングスライドをマウスの間に置き、撮像装置のドアを閉めます。 ソフトウェアの [取得]ウィンドウで取得設定を次のように調整します。非感染マウスの場合、 曝露時間 = 5 分 / ビニング = ‘large’ または ’16′(しきい値を設定するための最も数学的に敏感な構成のセット)。 急性モデルの感染マウスの場合: 曝露時間 = 2 分/ ビニング = ‘medium’ または ‘4’。 慢性モデルの感染マウスの場合: ばく露時間 = 5 分/ ビニング = ‘large’ または ’16’。 D-ルシフェリン注入時間が、取得開始の少なくとも10分前に行われたかどうかを確認します。そうでない場合は、ルシフェラーゼ信号のピーク時に画像を取得するために必要な期間待ちます(図1B)。それ以外の場合は、[ 取得 ]をクリックしてイメージング取得を開始します。 イメージングの開始後に [イメージ ラベル] ウィンドウが表示されます。ルシフェリン注射時間、実験、マウスの同定、時点、および記録を保持するのに役立つその他の必要な情報など、各グループに関する適切な情報をボックスに入力します。この情報は、測定テーブルファイルに含まれます。 画像取り込みの最後に警告サイン 「Saturated Image 」が表示されているかどうかを確認します。飽和した画像は受け入れられません。これが発生した場合は、ビニングを減らして新しい画像を取得します。分析で考慮するメモを取ります。 画像を取得したら、イメージングマシンのドアを開き、マウスを背側(裏面を上にして)に向けます。取得を再度実行し、適切にラベル付けします。 この画像取得の最後に、麻酔薬の流れをオフにしてください。マウスをイメージングチャンバーから静かに取り出し、容器に入れます。 マウスの体重を記録しながら、麻酔の回復を観察します。施術中に発見された異常な行動や身体の異常を記録します。マウスが動きに戻ったら、ケージに入れます。注意: 取得した各画像のBLI強度を確認します。取得終了後、記録された生物発光画像と写真は、考慮されるべきではない自動スケールでソフトウェアに表示されます。データ分析で定義するスケール(後述)を ツールパレット ウィンドウで設定します。 6. データ分析 注:上記のプロトコルは、市販の in vivo イメージングソフトウェアに基づいています。ただし、ソフトウェアライセンスフリーのバージョンでは、最も基本的な分析を実行できます。ソフトウェアの詳細については、 資料の表を参照してください。 ファイルを開きます。特定のイメージング時点から取得したデータが含まれているフォルダを開くには 、Menu>Fileを選択し、フォルダを選択します>フォルダを選択します (図2A -手順1)。注意: 新しいウィンドウが表形式で開き、取得したすべてのデータが選択したファイルに保存されます。ソフトウェアによって自動的に付与される画像ID(データ番号と時間番号)、取得中に研究者が画像ラベルウィンドウで提供した情報、および取得設定であるクリック番号記号が表示されます。これらのデータはすべて、飽和状態の画像を使用してはならないことを考えると、分析に使用できる画像を並べ替えるのに役立ちます。 選択したイメージに関連する複数の行 (感染していないコントロールを含む) を選択します。イメージ ID をラボ ノートブックに書き留め、イメージング セッション中に登録した情報と共に書き留めます。 [ グループとしてロード]をクリックして、選択した画像を組み立てます。この手順では、新しいシーケンス イメージを作成します。したがって、すべての画像の機能を同時に調整することが可能です。新しいシーケンスイメージをステップ6.1で使用したフォルダとは異なる新しいフォルダに保存して、必要に応じて生データの再解析を容易にします。 シーケンス画像で、[ オプション]>[表示]>[ビニング係数の選択 ]をクリックして、各画像に使用されているビニングを特定します(図2A ステップ2)。取得したビニング係数は、シーケンス内の各画像の上部に表示されます。 すべてのビン分割係数を同じ数値に修正します。これを行うには、調整する画像をダブルクリックします。 [ツール パレット] >ウィンドウの [イメージ調整 ] セクションで、適切なビニング係数 (図 2A – 手順 3) を選択します (ビニング係数の選択については、手順 5.18 を参照してください)。この手順は、すべての発散イメージで実行します。注:この手順はBLIの定量化に直接影響し(表1)、さらに「ディスカッション」セクションで説明します。 スケールを設定します。感染していないコントロールに基づいて、有効な生物発光シグナル(デバイスのマニュアルによると600カウント以上)を区別します。そのためには、感染していないマウスの画像をダブルクリックします。次に、新しいウィンドウの左上隅にある [単位] フィールドで [カウント] オプションを選択します。次に、[カラー スケール](Color Scale)を最小値の 600 に調整します。結果の画像は、放射輝度の最小スケールを設定するためのベースラインになります。 シーケンスウィンドウがアクティブな状態で、[単位]フィールドで[放射輝度]オプションを選択します。ツールパレットでカラースケールとカラーテーブルを調整します。そのためには、カラースケール制限領域の個別ボックスを無効にします。 ボックスには[ Logarithmic Scale ]と[ Manual ]に印を付けます(図2A -手順4)。非感染コントロール(ステップ6.8で観察)に従って最小スケール番号を設定し、最大として最も信号が強い領域( 図2A の矢印で示されている)を設定します。注:In vivo 2D光測定は相対的な定量化です。各デバイスのバージョンとキャリブレーションの違いにより、異なるスケール値を見つけることができます。したがって、代表的な結果で示された値は、他のデバイスで行われた他の実験に適合しないにもかかわらず、内部コントロール(非感染者および未感染者)によれば同等に有効であることができませんでした。 すべての画像に同じスケールを設定した後、各画像をダブルクリックし、ウィンドウを最大化し、[ グラフィックのエクスポート ]ボタンを使用して画像ビューを画像形式(.jpg、.tiffなど)でエクスポートし、 treatment_miceID_timeポイントごとにファイルに名前を付けます。(図2A -ステップ5)。この手順をすべての画像に対して実行します。 測定を実行します。シーケンスから任意の画像を選択し、ダブルクリックします。 [Tool Palette ] >ウィンドウの [ROI tools] セクションで、[ Square ] ボタン (図 2B- ステップ 1) をクリックし、マウス全体を覆う長方形を描きます。 作成した ROI の境界線をクリックし、各マウスに同じ ROI をコピーして貼り付けます (画像には 3 つの ROI が生成されます)。 ROI Tools セクションの Save をクリックして、ROI を保存します。保存したROIをすべての画像に適用するには、[ Apply to Sequence]ボックスを選択し、[ Load]をクリックします 保存されたROIは、実験全体のすべてのマウスに使用されます。 各マウスのROI位置を調整して、動物が測定領域により適合するようにします。すべてのマウスにラベルが付けられたら、[ Measure ROIs ]ボタンをクリックします(図2B-ステップ2)。 ROI測定テーブル が表示されます。 測定タイプを選択します:放射輝度;画像属性: すべての可能な値。ROI寸法:cm。次に、[ すべて選択 ]ボタンをクリックし、[ コピー ]ボタンをクリックします。 データをテーブル分析ソフトウェア(スプレッドシート)に直接貼り付けます。または、ファイルを.csv形式または.txt形式でエクスポートします。 データに取り組みます。テーブル解析ソフトウェアでは、データをグループ(治療、非感染者、非治療者など)ごとに整理します。 寄生虫の負荷は、全身の生物発光として示されます。したがって、同じマウスの腹側と背側のTotal Flux値と一致するようにデータを配置して、それらを合計します。 各グループを考慮して、合計値の平均と標準偏差を計算します(例: 補足表1)。データをグラフ作成および統計ソフトウェアにプロットします。 画像またはスライドプレゼンテーションソフトウェアで生物発光画像を含むパネルを準備します。各マウスを列に配置し、行の各時点に配置して、データの視覚化と解釈を容易にする薬効マトリックスを構築します。注:手順6.2.4(イメージレイアウトウィンドウの表示)を実行せずに、イメージをイメージングソフトウェアに直接ビルドするオプションがあります>。ただし、ソフトウェアのインターフェイスとツールでは、データの整理が制限されます。 図2:画像スケールの設定から発光の定量化までのデータ解析ステップ(A)画像データ処理用のLiving Image Softwareビュー。ステップ1:Browserツールを使用して、取得したデータをシーケンスとしてアップロードします。ステップ2:各取得に使用されたビニングを特定します(個々の画像の上に表示されます)。ステップ3:感染したマウスのすべての画像を同じビニング係数に設定し、非感染マウスにビニング係数16を適用します。ステップ4:非感染マウス(紫の矢印)に基づいてカラースケールを手動で設定し、画面上では非生物発光として表示されるはずの感染マウスと未治療のマウス(赤い矢印)は、赤で見えるはずです。ステップ5:書かれた情報のない画像を取得するには、各画像をダブルクリックし、 グラフィックをエクスポート ボタン。(b)関心領域(ROI)ツールの表示。ステップ1:マウス全体を覆うROIを描き、各動物に同じROIをコピーして貼り付けます。調整されたROIを保存し、実験内のすべての画像に適用します。ステップ2:[ROIの測定]ボタンをクリックして、.csvまたは.txtとしてエクスポートするテーブルを生成します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 7. 生体外 法 150 mg/kg D-ルシフェリン i.p. をマウスに注入し ( ex vivo ラウンドごとに 1 回)、3 分間待ちます。100 mg / kgケタミンと10 mg / kgキシラジンi.p.を使用してマウスを麻酔します。 生物学的安全キャビネットでは、マウスが足のつまみにまったく反応しない場合は、マウスの皮膚を切って腹膜(腹腔を開かずに)と左側の腋窩の組織を露出させます。腋窩動脈と血管を切断して放血を進めます。 使い捨てのパスツールピペットを使用して血液を採取します。次に、心臓の左心室を通じて、0.3 mg / mLのD-ルシフェリン10 mLをDPBS溶液に注入します。. 選択した臓器をペトリ皿の所定の場所に広げ、0.3 mg / mL d-ルシフェリン溶液に浸します。.この手順は、最大30分以内に実行する必要があります。 切除された臓器(心臓、肺、胸腺、肝臓、大腿四頭筋、腸間膜、脾臓、腎臓、副腎、内臓脂肪、食道、胃、小腸、盲腸、結腸、脳、皮下脂肪、子宮、性腺脂肪、膀胱、腹膜)の発光画像を、信号強度(飽和画像は許容されません)に応じて、5分間の露光時間とビニング16を使用して取得します22。注:しきい値を設定するには、感染していないマウスで、感染したマウスの前に同じ手順を実行する必要があります。