揭开查加斯病小鼠模型的体内生物发光成像的神秘面纱，用于药物疗效研究

本协议中描述的所有程序均根据圣保罗大学 Instituto de Ciências Biomédicas 动物伦理委员会预先制定的准则14 提交、批准和执行：协议 CEUA ICB/USP no 5787250522。 1. 解决方案 注：考虑 10 mL/kg 的预给药体积（小鼠 20 g 重量为 200 μL）15,16。例如，制备 15 mg/mL 的工作溶液以达到 150 mg/kg 的动物剂量。 羟丙基甲基纤维素悬浮液 （HPMC-SV）注：所需的试剂是 0.5% （w/v） 羟丙基甲基纤维素 （HPMC）、0.4% （v/v） Tween 80 和 0.5% （v/v） 苯甲醇。对于 200 mL 的载体溶液，称取 1 g HPMC 并溶于 64 mL 热超纯水中。搅拌 2 分钟。 加入 120 mL 冰冷的超纯水并搅拌 1 小时。加入 1 mL 苯甲醇。 然后使用反向移液技术加入 0.8 mL 的 Tween 80 并继续搅拌，直到溶液变得透明。 调整溶液，使最终体积为 200 mL。将 HPMC-SV 在冷藏 （4 °C） 下储存最多 3 个月。 苄硝唑计算所需的复合溶液量，如下：化合物溶液的体积 = （每天的剂量数 x 天数 x 待治疗的小鼠数 x 每只小鼠的给药体积） + 30% 额外。 考虑到所需剂量，称取必要量的苄硝唑 （BZ）。对于根治性治疗，口服剂量 100 mg/kg，每天一次，持续 10 天，在 CD 慢性模型17 中达到 100% 治愈。 考虑到所需的最终体积，计算达到 5% （v/v） DMSO 浓度的适量，并将 BZ 完全溶解在纯 DMSO 中。 将适当体积的载体添加到玻璃管中，以达到 95% （v/v） HPMC-SV 的浓度。将溶解在 DMSO 中的 BZ 转移到含有 HPMC-SV 的玻璃管中。强烈均质悬浮液并将其储存在 4 °C。例如：BZ 制剂的最终体积 = 10 mL（步骤 1.2.1）BZ 的量 = 100 毫克（步骤 1.2.2）5% DMSO = 0.5 mL（步骤 1.2.3）和 95% HPMC-SV = 9.5 mL（步骤 1.2.4） 在每次给药前，将制剂置于37°C的超声水浴中5分钟，并在动物给药前剧烈匀浆。 环磷酰胺将所需量的环磷酰胺溶于超纯水中，得到 12.5 mg/mL 溶液。 通过过滤对溶液进行消毒并储存在 4 °C。 Giemsa 染色将 0.6 mg Giemsa 粉末试剂溶于 50 mL 甲醇中。加入 25 mL 甘油并混合。使用滤纸和漏斗去除沉淀物。将储备液储存在室温 （RT） 下，避光保存。 在 90 mL 混合磷酸盐缓冲液（pH 7.2 下，20.5 M Na2HPO4、65.4 M KH2PO4 ）中稀释 10 mL Giemsa 溶液，制备工作溶液。 2. 克氏锥虫 培养 在生物安全柜 （BSC） 中工作，在 LIT 培养基（68.44 mM NaCl、5.36 mM KCl、112.7 mM Na2HPO4、5 g/L 胰蛋白胨、5 g/L 肝脏输注肉汤、0.03 M 血红素、4.16 mM 葡萄糖）中培养 4 x 106 个上鞭毛体/mL，补充有 10% （v/v） 胎牛血清 （FBS）， 100 μg/mL 青霉素、100 U/mL 链霉素和 150 μg/mL 潮霉素作为 28 °C 下的选择性药物。 寄生虫通常在 3-4 天内达到稳定期。 通过在 28 °C 下将 3 x 108 个表鞭毛体在 10 mL Grace 昆虫培养基中与 10% （v/v） FBS 在 15 mL 锥形管中孵育 7-10 天，诱导变环生成以获得感染性寄生虫。 通过 Giemsa 染色涂片评估分化率。为此，将 20 μL 分化的寄生虫涂抹在载玻片中并干燥 10 分钟。 在通风橱中，用纯甲醇覆盖载玻片进行样品固定，并完全干燥（1-2 分钟）。用 Giemsa 工作溶液覆盖载玻片 20 分钟。 用蒸馏水轻轻清洗载玻片。在显微镜下，计算准环锥鞭毛体的百分比。如果达到至少 10% 的区分率，请继续执行下一步。 离心寄生虫（120 x g 10 分钟）并用 10 mL DPBS 重悬沉淀。再次离心并将寄生虫重悬于 5 mL 补充有 10% （v/v） FBS、100 μg/mL 青霉素和 100 U/mL 链霉素的 DMEM 中。 在 25 cm2 培养瓶中，在 37 °C 和 5% CO2 中，在加湿培养箱18 中对 1.66 x 105 LLC-MK2 细胞（来自猕猴的肾上皮细胞）进行感染。 组织培养的锥鞭毛体 （TCT） 在 8-9 天后释放到培养基中。用 TCT 以 1：40 的感染倍数 （MOI） 感染新鲜的 LLC-MK2 细胞单层。 3. 用流式细胞仪分析 克氏锥虫 种群同质性 收集 CL Brener Luc：：Neon 和 CL Brener 野生型菌株的 TCT，以 120 x g 离心 10 分钟，并将 TCT 重悬于 DPBS 中。调整寄生虫密度以达到 1 x 106/mL。 通过流式细胞仪基于 mNeonGreen 荧光（例如 506/em. 517 nm）19 进行群体分析，为每个样品获取至少 20,000 个事件。注：荧光种群百分比是通过比较野生型与转染的寄生虫获得的。为了继续小鼠感染，应达到 CL Brener Luc：：Neon 谱系的至少 95% 的荧光寄生虫种群（补充图 1）。 4. 小鼠实验性感染 注：为了增加寄生虫的数量，经常从免疫缺陷小鼠那里获得血流锥鞭毛体 （BT）10,13。在这里，使用 BALB/C 小鼠的化学免疫抑制来获得 BT。为此，通过以 62.5 mg/kg 的间隔以 96 小时的间隔腹膜内注射四次环磷酰胺 （CTX） 来实现轻度免疫抑制，这与克氏锥虫感染同时进行。 在 T. cruzi 感染前 62.5 天通过腹膜内注射 （ip） 施用 1 mg/kg 无菌环磷酰胺。 通过腹膜内途径，用 0.2 mL DPBS 中的 1 x 104 个 TCT 感染每只小鼠。注意处理病原体和针头时发生事故的高风险。在 BSC 中进行感染，在整个过程中戴上手套和面罩。 通过直接观察血液中的 BT（Pizzi-Brener 方法）每天监测寄生虫血症20。在寄生虫血症高峰期，感染后 （dpi） 约 13-17 天，进行血液采集。为此，用 100 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 甲苯噻嗪麻醉小鼠。 当小鼠完全麻醉时21，使用 1 mL 注射器进行心脏穿刺，该注射器连接到含有 50 μL 3.8% （w/v） 柠檬酸钠的 24 G X3/4 针头。拔下针头，轻轻地将血液放入离心管中。 在 BSC 中，在氯化铵钾 （ACK） 裂解缓冲液中稀释等分试样的血液，并在 Neubauer 腔室中计数寄生虫。重复此过程至少两次，因为小血凝块会影响寄生虫计数。注：为防止计数错误，请调整稀释因子以避免在 Neubauer 腔室中计数低于 30 和高于 300 个锥鞭毛体。 通过在 DPBS 中混合必要量的纯血，将寄生虫密度调节至 5 x 103 BT/mL。 使用 26 G 针（较窄的针头导致寄生虫裂解），通过腹膜内途径，用每只小鼠 0.2 mL DPBS （5 x 103 BT/mL） 中的 1 x 103 BT 感染非免疫抑制的 BALB/c 小鼠22。腹膜内注射体积后，将针头放在鼠标内 5 秒以避免回流。 将受感染的小鼠暂时放在一个带有纸巾的盒子中，以识别潜在的渗漏或出血，然后将小鼠放回笼子中。 5. 活体 成像 注意：此处使用的术语表如下： 成像会话：在给定的一天对某个实验的所有组进行生物发光采集。 图 1A 显示了该过程的概述。 成像回合：在三只小鼠的亚组中进行的手术，从 D-荧光素注射到麻醉恢复。建议每个实验组包含 6 只小鼠，因为小鼠的寄生虫负荷的内在变异性以及影响 BLI 定量的其他因素如下所述。 成像采集：由成像设备进行拍摄以量化生物发光，从而产生照片的图像叠加和量化的生物发光显示为伪彩色刻度。 成像程序：本实验方案中讨论的所有步骤。 图 1：获取 BLI 数据。（A） 以美洲锥虫病生物发光小鼠模型为例，应用于传染病研究的采集工作流程示意图。通过在既定时间点上通过体内成像分析感染转基因克氏锥虫的小鼠。在每轮成像中，向最多三只小鼠的一组注射150mg / kg的酶底物（D-荧光素）。5分钟后，在氧气中以2.5%（v / v）异氟醚进行麻醉。当完全静止时，将小鼠置于成像系统中，并按照定义的设置开始采集。成像后，小鼠从麻醉中恢复并被送回笼子。常见问题以及研究人员在采集过程中可能遇到和面临的问题以红色突出显示。此方案已从 Lewis et al. （2014）12（使用 BioRender.com：UD26KWEVS2 创建）修改而来。（B） D-荧光素/红移萤火虫荧光素酶 （PpyRE9h） 的体内动力学。麻醉克氏毛滴虫寄生虫血症峰值 （n = 3） 的小鼠并注射 150 mg/kg D-荧光素。获取图像 1 小时（曝光时间：2 分钟;合并：4）。顶部：腹侧总通量 （p/s） 量化（左 Y 轴，红色）和最高平均测量值的百分比（右 Y 轴，蓝色）。数据显示为平均值 （曲线） 和标准差 （阴影区域）。底部：第一个 （4 分钟）、最高 BLI 信号 （30 分钟） 和最后一个 （62 分钟） 时间点的采集图像。请单击此处查看此图的较大版本。 检查 Acquisition 窗口中的绿色条，以验证电荷耦合器件 （CCD） 相机是否处于低温 （-90 °C） 状态。单击条形（绿色或红色）以可视化温度。注意：根据成像设备手册，成像设备和软件应始终开启，以保持 CCD 低温。 验证是否执行了自动背景调整。为此，请单击 Acquisition > Background > View available Dark Charge。将出现一个包含多个设置组合的列表。注意：此过程可减少发光噪声。如果所选配置导致的值高于 1000，则根据公式“曝光时间 x （binning²）”，则不应忽略暗电荷。根据软件配置，分箱可以显示为数字（分箱因子）或从“小”到“大”的范围。范围和分档因子之间的对应关系可以在设备手册中找到。 如果未显示 活动窗口 （软件底部的白色区域），请在 菜单视图 > 活动窗口 启用它。 通过单击 “采集窗口”>“视野”来设置成像区域。选项 C （13.2 cm） 获得 3 只小鼠， 选项 D （22 cm） 获得 5 只小鼠。 通过单击 Acquisition > Auto-Save 并选择自动保存选项，然后为每个时间点选择或创建一个新文件夹。 在成像区域铺一张哑光黑纸，并将分区玻片垂直放置在入口之间。如果制造商没有提供幻灯片，请使用磨砂黑纸 （3 厘米 x 15 厘米）。 调整成像室的内部区域，以将玻璃鼻锥与麻醉入口相适应。使用小块黑色电工胶带将麻醉系统连接到平台上（图像区域外）。注意：在某些版本的成像设备中，激光定义成像区域。如果此工具不可用，请通过软件获取图像以检查成像区域内的分区载玻片。 将异氟醚蒸发器设置为成像和感应室的氧气中 2.5% （v/v）。通过压力表检查气体是否流经系统21。注意：如果成像设备没有连接吸入麻醉系统，则可以使用其他麻醉选项，例如注射甲苯噻嗪和氯胺酮23。在这种情况下，小鼠恢复缓慢，死亡风险高24。 用 D-荧光素填充注射器（31 G 针头）（制备 D-荧光素的综合方案由不同的供应商提供）25,26，保护它们免受阳光直射，并准备一些塑料容器或额外的笼子用纸巾覆盖内部。 在附近放置一个时钟/手表以轻松跟踪时间，并放置一个实验室笔记本来记录小鼠组、荧光素注射时间和手术过程中的任何其他信息。 称量所有小鼠并记录它们的体重。用钢笔记号笔或尾巴上的纹身标记每只鼠标。在整个实验过程中保持小鼠识别的良好显示。此步骤也可以在采集前一天执行。注意：标记不应占据较大的主体区域，因为墨水可能会干扰生物发光信号。不同颜色的永久性标记也有助于区分各组。 要启动成像会话，请注册背景发光图像（设置： 曝光时间：5 分钟; Binning： ‘large’ 或 ’16’， f/stop： 1） 没有鼠标的成像室。此程序有助于识别设备上的自动发光光源或意外问题。注意：由于 BLI 基于酶促反应，因此时间是实验的基本特征。在开始处理动物之前，请检查上面列出的所有项目和设备设置。 在前 3 只小鼠中注射 150 mg/kg （ip） 的 D-荧光素，而不到达内脏器官。将小鼠放入容器盒中，以评估 D-荧光素是否泄漏（亮黄色溶液）。如果发生这种情况，请记下并记录小鼠组和 D-荧光素注射时间。 等待 5 分钟，然后将小鼠转移到麻醉诱导室。打开系统。小鼠完全麻醉大约需要 3 分钟（没有反应，如颤抖腿、尾巴等）21. 打开成像设备的门，打开流向成像室的麻醉剂，同时关闭感应室。 将每个鼠标放在鼻锥位置：从鼠标 1-3，从左到右侧。轻轻地将小鼠腹面朝上容纳在激光显示的成像区域内。在住宿期间，验证老鼠的 ID 和位置。不要强行进入鼻锥中部分麻醉的小鼠。 将隔板放在小鼠之间，然后关闭成像设备的门。 在软件 Acquisition （采集） 窗口中调整采集设置，如下所示：对于未感染的小鼠， 暴露时间 = 5 分钟 / 像素合并 = “大” 或 “16”（用于设置阈值的最数学敏感的配置集）。 对于急性模型中受感染的小鼠： 暴露时间 = 2 分钟/ 分档 = ‘medium’ 或 ‘4’。 对于慢性模型中受感染的小鼠： 暴露时间 = 5 分钟/ 像素合并 = ‘大’ 或 ’16’。 验证 D-荧光素注射时间是否在开始采集前至少 10 分钟进行。如果没有，请等待必要的时间以在荧光素酶信号峰值期间获得图像（图 1B）;否则，单击 Acquire 开始成像采集。 映像开始后，将出现 Image Labels 窗口。在框中填写有关每组的适当信息，包括荧光素注射时间、实验、小鼠识别、时间点以及任何其他有助于保存记录的所需信息。此信息将包含在测量表文件中。 验证成像采集结束时是否显示警告标志 Saturated Image 。饱和图像是不可接受的。如果发生这种情况，请减少像素合并并获取新图像。记下分析中要考虑的笔记。 获取图像后，打开成像机门，将小鼠转向背视图（背面朝上）。再次执行客户获取并相应地标记它。 在此成像采集结束时，关闭麻醉剂流。轻轻地将小鼠从成像室中取出并将它们放入容器中。 在观察麻醉恢复的同时记录小鼠的体重。记录手术过程中发现的任何异常行为或身体异常。一旦老鼠恢复活动，就把它们放在笼子里。注意：验证每个采集的图像的 BLI 强度。采集结束后，记录的生物发光图像和照片将以不应考虑的自动刻度显示在软件上。在 工具调色板 窗口上设置数据分析中定义的比例（如下所述）。 6. 数据分析 注意：上述协议基于商业 体内 成像软件。但是，软件免许可证版本可以执行最基本的分析。软件详细信息可在 材料表中找到。 打开文件。通过选择 Menu File > Browser > Select the folder （图2A – 步骤1）打开包含从某个成像时间点采集的数据的文件夹（图2A – 步骤1）。注意：将以表格格式打开一个新窗口，所有采集的数据都保存在所选文件中。它将显示 点击编号 符号，这是软件自动提供的图像 ID（数据和小时数字）、研究人员在采集期间在 图像标签 窗口中提供的信息以及采集设置。所有这些数据都有助于对可用于分析的图像进行排序，因为不能使用饱和图像。 选择与所选图像相关的多行，包括未感染的控件。记下实验室笔记本中的映像 ID 以及在映像会话期间注册的信息。 通过单击组合所选图像 Load as Group.此过程将创建一个新的序列图像。因此，可以同时调整所有图像的特征。将新序列图像保存在与步骤 6.1 中使用的文件夹不同的新文件夹中，以便在需要时重新分析原始数据。 在序列图像中，通过单击 “选项”>“显示”>“选择合并因子 ”来确定用于每个图像的合并（图 2A – 步骤 2）。获取的像素合并因子将显示在序列中每张图像的顶部。 将所有分箱因子更正为相同的数字。为此，请双击要调整的图像。在 “工具调色板 ”窗口 >“图像调整 ”部分，选择合适的合并因子（图 2A – 步骤 3） – 有关合并因子的选择，请参见步骤 5.18。在所有发散图像中执行此过程。注：此过程直接影响 BLI 定量（表 1），并在讨论部分进一步讨论。 设置比例。根据未感染的对照区分有效的生物发光信号（根据设备手册超过 600 计数）。为此，双击未感染小鼠的图像。然后，在新窗口的左上角，选择 Counts 选项 Units 字段。然后，将 Color Scale 调整为最小值 600。生成的图像将是设置最小辐射比例的基线。 在序列窗口处于活动状态时，在 Units 字段中选择选项 Radiance。调整 色阶 和 颜色表 在工具调色板中。为此，请禁用 Color Scale Limits 区域中的 Individual 框。 标记对 数刻度 和 手动 框（图 2A – 步骤 4）。根据未感染的对照（如步骤 6.8 中观察到的）和具有最高信号的区域设置为最大值（如 图 2A 中的箭头所示）设置最小刻度数字。注意：体内 2D 光测量是一种相对量化。由于每个设备的版本和校准不同，可以找到不同的刻度值。因此，代表性结果中证明的值不能适合在其他设备上进行的其他实验，但根据内部对照（未感染和未处理的感染）同样有效。 为所有图像设置相同的比例后，双击每个图像，最大化窗口，然后使用 Export Graphics （导出图形 ） 按钮以图像格式（.jpg、.tiff 等）导出图像视图，并按 treatment_miceID_time点命名文件。（图 2A – 步骤 5）。对所有图像执行此过程。 执行测量。从序列中选择任何图像并双击它。在 Tool Palette 窗口> ROI 工具部分，单击 方形 按钮（图 2B – 步骤 1）并绘制一个覆盖整个鼠标的矩形。 单击创建的 ROI 的边框，然后为每个鼠标复制并粘贴相同的 ROI（在图像中产生三个 ROI）。通过单击 ROI 工具 部分上的保存来保存 ROI。通过选中 Apply to Sequence 框，然后单击 Load ，为所有图像应用保存的 ROI。 保存的 ROI 将用于整个实验中的所有小鼠。 调整每只鼠标的 ROI 位置，以更好地适应动物在测量区域中的位置。标记所有小鼠后，单击 “测量 ROI” 按钮（图 2B – 步骤 2）。此时将出现 ROI Measurements Table 。选择 测量类型：辐射度;image attributes：所有可能的值;ROI 尺寸：厘米。然后，点击 选择全部 按钮，然后 复制 按钮。 将数据直接粘贴到表格分析软件（电子表格）中。或者，以 .csv 或 .txt 格式导出文件。 处理数据。在表格分析软件中，按组（治疗、对照、未感染、未处理等）组织数据。 寄生虫载量显示为全身生物发光。因此，排列数据以匹配同一小鼠的腹侧和背侧总通量值，并将它们相加。 计算考虑每组的求和值的平均值和标准差（例如： 补充表 1）。将数据绘制到绘图和统计软件中。 在图像或幻灯片演示软件中准备带有生物发光图像的面板。将每只小鼠放在一列中，将每个时间点放在行中，以构建药物疗效矩阵，以促进数据的可视化和解释。注意：有一个选项可以将图像直接构建到成像软件中，而无需执行步骤 6.2.4（查看>图像布局窗口）。但是，软件界面和工具限制了数据组织。 图 2：从设置图像比例到量化发光的数据分析步骤。 （A） 用于图像数据处理的 Living Image Software 视图。第 1 步：使用 浏览器 工具。第 2 步：确定用于每次采集的像素合并（将显示在单个图像的顶部）。第 3 步：将受感染小鼠的所有图像设置为相同的分档因子，并对未感染的小鼠应用分档因子 16。第 4 步：根据未感染的小鼠（紫色箭头）手动设置色标，该小鼠应在屏幕上显示为非生物发光，而感染和未处理的小鼠位于最高的生物发光焦点（红色箭头），应显示为红色。第5步： 要获取没有任何书面信息的图像，请双击每张图像并使用 导出图形 按钮。（b） 感兴趣区域视图 （ROI） 工具。第 1 步：绘制一个完全覆盖小鼠的 ROI，然后为每只动物复制并粘贴相同的 ROI。保存调整后的 ROI 并将其应用于实验中的所有图像。第 2 步：点击 Measure ROIs 按钮生成要导出为 .csv 或 .txt 的表格。 请单击此处查看此图的较大版本。 7. 离体 程序 在小鼠中腹腔注射 150 mg/kg D-荧光素（每 体外 一轮）并等待 3 分钟。使用 100 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 甲苯噻嗪腹腔注射麻醉小鼠。 在生物安全柜中，当小鼠对捏爪子完全没有反应时，切开小鼠皮肤以露出腹膜（不打开腹膜腔）和左侧腋窝的组织。通过切开腋动脉和血管进行放血。 使用一次性巴斯德移液器收集血液。然后通过心脏左心室灌注 10 mL 0.3 mg/mL 的 D-荧光素在 DPBS 溶液中。 将选定的器官放在培养皿上预先建立的位置上，并将它们浸泡在 0.3 mg/mL d-荧光素溶液中。此过程必须在最多 30 分钟内执行。 使用 5 分钟的曝光时间和分档 16 获取切除器官（心脏、肺、胸腺、肝脏、股四头肌、肠系膜、脾脏、肾脏、肾上腺、内脏脂肪、食道、胃、小肠、盲肠、结肠、脑、皮下脂肪、子宫、性腺脂肪、膀胱和腹膜）的发光图像，具体取决于信号强度（饱和图像不可接受）22。注意：必须在未感染的小鼠之前对未感染的小鼠执行相同的过程，以设置阈值。