Nous présentons un protocole pour la préparation de condensats biomoléculaires synthétiques constitués de nanoétoiles d’ADN amphiphiles à partir de leurs oligonucléotides d’ADN constitutifs. Les condensats sont produits à partir d’un seul composant nano-étoile ou de deux composants et sont modifiés pour soutenir la transcription in vitro de l’ARN à partir d’une matrice d’ADN intégrée.
Les gouttelettes et les condensats synthétiques deviennent des constituants de plus en plus courants des systèmes biomimétiques avancés et des cellules synthétiques, où ils peuvent être utilisés pour établir une compartimentation et maintenir des réponses réalistes. Les nanostructures d’ADN synthétique ont démontré un potentiel important en tant que blocs de construction formant des condensats en raison de leur forme programmable, de leur fonctionnalisation chimique et de leur comportement d’auto-assemblage. Nous avons récemment démontré que les « nanoétoiles » d’ADN amphiphile, obtenues par marquage de jonctions d’ADN avec des fractions hydrophobes, constituent une solution particulièrement robuste et polyvalente. Les condensats d’ADN amphiphiles qui en résultent peuvent être programmés pour afficher des architectures internes complexes à plusieurs compartiments, répondre structurellement à divers stimuli externes, synthétiser des macromolécules, capturer et libérer des charges utiles, subir des transformations morphologiques et interagir avec des cellules vivantes. Ici, nous démontrons des protocoles de préparation de condensats d’ADN amphiphiles à partir d’oligonucléotides d’ADN constitutifs. Nous aborderons (i) les systèmes à un composant formant des condensats uniformes, (ii) les systèmes à deux composants formant des condensats cœur-coquille, et (iii) les systèmes dans lesquels les condensats sont modifiés pour soutenir la transcription in vitro des nanostructures d’ARN.
Les cellules synthétiques sont des dispositifs à l’échelle micrométrique (10-50 μm) construits de bas en haut pour reproduire les fonctions et les structures des cellules biologiques existantes 1,2. Les cellules synthétiques sont souvent liées par des membranes construites à partir de vésicules bicouches lipidiques 3,4,5,6,7, de polymères 8,9 ou de protéinosomes10,11, qui peuvent également être utilisés pour établir une compartimentation interne12,13. Inspirées par les organites sans membrane connus pour soutenir diverses fonctionnalités dans les cellules vivantes14, des structures telles que les coacerces de polymères, les condensats biomoléculaires et les hydrogels gagnent du terrain en tant qu’alternatives polyvalentes et robustes pour établir la compartimentation externe et interne dans les cellules synthétiques 15,16,17,18.
Tirant parti de la boîte à outils polyvalente de la nanotechnologie de l’ADN19, de multiples solutions ont été développées pour concevoir des gouttelettes et des condensats synthétiques à partir de l’auto-assemblage de nanostructures d’ADN artificiel, dont la taille, la forme, la fonctionnalité, la valence et les interactions mutuelles peuvent être programmées avec précision20. Les gouttelettes d’ADN ou les condensats sont biocompatibles et peuvent servir d’échafaudages pour les cellules synthétiques et les organites, hébergeant des réactions chimiques et biomoléculaires21, calculant des informations22,23, capturant et libérant des cargaisons24,25 et soutenant les réponses structurelles26.
Parmi les diverses conceptions de nanostructures d’ADN formant des condensats, les nanoétoiles d’ADN amphiphiles – surnommées étoiles C – se sont révélées robustes et polyvalentes27. Les étoiles C sont de simples motifs ramifiés constitués d’une jonction d’ADN fixe (généralement à quatre voies), d’où émergent des bras d’ADN double brin (ds)28. Les bras sont ensuite terminés par des fractions hydrophobes, généralement du cholestérol, ce qui rend les nanostructures amphiphiles et entraîne leur condensation à la suite d’un simple recuit en un seul pot. Les condensats C-star offrent une programmabilité structurelle et fonctionnelle précise, y compris la possibilité d’établir des architectures multi-compartiments29,30, de répondre structurellement aux déclencheurs d’ADN et de cations31, de synthétiser des macromolécules29, de capturer et de libérer des charges utiles32 et d’interagir avec des cellules vivantes33. Ci-dessous, nous décrirons et discuterons des protocoles permettant de produire des condensats C-star à partir de leurs oligonucléotides constitutifs.
Le protocole résume la préparation des condensats unaires (à un composant) et binaires (à deux composants), en utilisant trois conceptions différentes en étoile C (Figure 1) : « Non réactif », « TMSD-réactif » et « ARN-templating ». L’étoile C « non réactive » (panneau A) se compose de quatre « brins centraux » avec des séquences distinctes formant la jonction à quatre voies. Quatre oligonucléotides identiques modifiés par le cholestérol sont connectés à la jonction, ce qui garantit la présence d’une molécule de cholestérol à l’extrémité de chaque bras. Les étoiles C non réactives constituent des échafaudages simples et inertes pour les condensats unaires et binaires. Dans l’étoile C « sensible au TMSD » (panneau B), la connexion entre les brins cholestérolisés et la jonction est assurée par un brin « pont de maintien des orteils », qui comporte un domaine « toehold » d’ADN simple brin (ss) pendant. En présence d’un brin d’ADN envahisseur avec un domaine d’ancrage complémentaire, une réaction de déplacement de brin médiée par l’ancrage peut être déclenchée34, par laquelle l’envahisseur déplace le pont d’ancêtre, brisant la connexion entre la jonction et les fractions hydrophobes et déclenchant le désassemblage du réseau d’ADN32. Enfin, l’étoile C « modèle d’ARN » (panneau C) comprend une modification « Base » complémentaire à un brin « Bridge », ce dernier reliant le modèle ssDNA retranscriptionnable de l’aptamère du brocoli29. Les détails de la séquence des oligonucléotides constitutifs des trois types de conceptions d’étoiles C mentionnés ici peuvent être trouvés dans le tableau supplémentaire 1 et dans les travaux précédents 29,30,32.
Graphique 1. Schémas de trois modèles différents de nanoétoiles d’ADN amphiphiles (étoiles C). Les séquences d’oligonucléotides pour divers exemples des étoiles C décrites ici peuvent être trouvées dans le tableau supplémentaire 1. (A) Schéma d’une étoile C conçue pour former des condensats non réactifs, avec les brins d’oligonucléotides constitutifs « Core 1 », « Core 2 », « Core 3 », « Core 4 » (colorés en rose) et « Terminal cholesterol » (colorés en bleu). Chaque couleur unique représente un brin d’oligonucléotide de séquence unique. Le « tronc commun 1 » et le « tronc commun 3 » sont chacun partiellement complémentaires du « tronc commun 2 » et du « tronc commun 4 », mais ne sont pas complémentaires l’un de l’autre. (B) Schéma d’une étoile C conçue pour se démonter lors de l’ajout d’un brin envahisseur par déplacement de brin médié par la prise de pied, comme décrit dans les travaux précédents32. Cette étoile C est composée des brins « Cœur » et « Cholestérol terminal » (colorés en gris) ainsi que d’un « Complément terminal » (illustré en orange) et d’un brin « Pont de maintien des orteils » (illustré en sarcelle foncée). Ce dernier contient un surplomb de six nucléotides auquel un brin envahisseur conçu de manière appropriée peut se lier et par la suite déplacer entièrement le brin « pont de maintien des orteils », ce qui provoque la dissociation de la jonction centrale des nanoétoiles (composée des « noyaux 1, 2, 3 et 4 ») des duplex composés des brins du « complément terminal » et du « cholestérol terminal ». (C) Schéma d’une étoile C fonctionnalisée avec une matrice d’ADN pour un aptamère d’ARN. Celui-ci est également composé du brin « Cholestérol terminal » et des « Cœurs 2, 3 et 4 » (tous indiqués en gris), ainsi que d’une version étendue du brin « Cœur 1 » (en rose), d’un brin « Base » (marron), d’un brin « Pont » (jaune) et du « Modèle d’aptamère » (vert). Le duplex d’ADN composé des deux derniers brins forme la région promotrice de la polymérase T7, qui marque le site de début de la transcription. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Les condensats en étoile C se forment lors du recuit thermique des oligonucléotides constitutifs, qui, dans le protocole présenté ici, est effectué dans des capillaires en verre scellés avec une section transversale rectangulaire à rapport d’aspect élevé. Ces conteneurs offrent de multiples avantages clés : i) L’étanchéité garantit que l’évaporation est complètement évitée au cours des étapes de recuit (parfois lentes) ; ii) Le fond plat des capillaires, de qualité optique, permet d’imager le transitoire d’auto-assemblage (ou de désassemblage) ; iii) le rapport d’aspect élevé des capillaires garantit que les condensats lourds se déposent sur une zone large et plate, réduisant ainsi les risques de coalescence et d’agrégation aux stades ultérieurs du transitoire d’auto-assemblage qui se produirait dans des récipients en forme de coin (par exemple, les tubes de microcentrifugation), et produisant des populations de condensats relativement monodispersés ; iv) La réalisation du recuit dans un capillaire en verre allongé minimise l’exposition de l’échantillon aux interfaces hydrophobes (air, plastique ou huile), dont on a observé qu’elles perturbent l’auto-assemblage en recrutant les oligonucléotides glycolésophiles et cholestérolisés. Une fois le protocole d’assemblage terminé, les condensats peuvent être extraits des capillaires en verre pour d’autres expériences impliquant des réactifs supplémentaires.
Le protocole décrit ici fournit une approche pour la préparation de condensats à un ou deux composants à partir de nanoétoiles d’ADN amphiphiles, avec des variations de conception pour introduire différentes réponses dans les condensats. Le protocole donné produit des condensats dans une solution tampon de 0,3 M de NaCl dans l’TE, mais les conditions tampons peuvent être modifiées en modifiant de manière appropriée les volumes énumérés ci-dessus. Des travaux antérieurs ont étudié la formation de con…
The authors have nothing to disclose.
LM, LDM et DT saluent le soutien du Conseil européen de la recherche (ERC) dans le cadre du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 (ERC-STG n° 851667 – NANOCELL). LDM reconnaît le soutien d’une subvention de recherche de la Royal Society pour les boursiers de recherche (RGF/R1/180043) et le soutien d’une bourse de recherche de l’Université de la Royal Society (UF160152, URF/R/221009).
0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | SLGVR33RB | |
24 x 60 mm #1.5 Rectangular cover glasses, Menzel Gläser | VWR | 631-0853 | |
2-Propanol | Sigma-Aldrich | 34683 | |
6 L Ultrasonic Cleaner with Digital Timer and Heat, 230 VAC | Cole-Parmer | WZ-08895-11 | |
Araldite Rapid Adhesive 2 Part Epoxy Glue | RS | ARA-400005 | |
Bio-Rad C1000 thermal cycler | Bio-Rad | 1851197 | |
Brand Microcentrifuge Tube 2 mL with Locking Lid | Fisher Scientific | 15338665 | 2 mL microcentrifuge tubes for the extraction of C-star condensates |
Diamond Scribing Pen | RS | 394-217 | |
Difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolidinone (DFHBI) | Sigma-Aldrich | SML1627 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
Eppendorf PCR Clean Colorless Safe-Lock Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 0030123301 | 0.5 mL microcentrifuge tubes for the preparation of C-star mixtures |
Ethanol Absolute 99.8+% | Fisher Scientific | 10437341 | 70% ethanol is sufficient for cleaning purposes |
Fisherbrand ZX4 IR Vortex Mixer | Fisherbrand | 13284769 | |
Hellmanex III | Hellma | 9-307-011-4-507 | |
Hollow Rectangle Capillaries ID 0.40 x 4.00 mm, 50 mm in length | CM Scientific | 2540-50 | |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | 69794 | |
Mini Centrifuge, 230 V | PRISM(TM) | Z763128 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
NanoDrop One Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | Used to measure absorbance of oligonucleotides for concentration calculations |
Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | Custom | Oligonucleotide sequences are unique to the C-star design required. |
ScriptGuard RNase inhibitor | CELLSCRIPT | C-SRI6310K | RNase inhibitor |
T7-FlashScribe Transcription Kit | Cambio | C-ASF3507 | |
Tris-EDTA buffer, 100x stock solution | Sigma-Aldrich | 574793 | |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen | 10977035 | |
VWR Spec-Wipe 3 Wipers | VWR | 21914-758 |