Summary

Co-culture de systèmes in vitro pour reproduire le cycle cancer-immunité

Published: June 07, 2024
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Summary

Ici, nous détaillons un protocole simple, rapide et fiable assisté par cytométrie en flux multiparamétrique et tumeur sur puce pour surveiller et caractériser les étapes constituant le cycle cancer-immunité. En effet, une compréhension approfondie des interactions entre le cancer et les cellules immunitaires fournit des informations essentielles pour déjouer les tumeurs et guider les soins cliniques.

Abstract

La recherche fondamentale sur le cancer et le développement de thérapies efficaces contre les attaques reposent toutes deux sur des études expérimentales détaillant les interactions entre le cancer et les cellules immunitaires, ce que l’on appelle le cycle cancer-immunité. Des systèmes de co-culture in vitro combinés à la cytométrie en flux multiparamétrique (mFC) et aux dispositifs microfluidiques (ToC) de tumeur sur puce permettent une surveillance et une caractérisation simples, rapides et fiables de chaque étape du cycle cancer-immunité et permettent d’identifier les mécanismes responsables de faire pencher la balance entre l’immunosurveillance du cancer et l’immunoévasion. Une compréhension approfondie des interactions dynamiques entre le cancer et les cellules immunitaires fournit des informations essentielles pour déjouer les tumeurs et accélérera le rythme de la personnalisation et de l’optimisation thérapeutiques chez les patients. Plus précisément, nous détaillons ici un protocole simple assisté par mFC et ToC pour démêler les complexités dynamiques de chaque étape du cycle cancer-immunité dans les lignées cellulaires cancéreuses murines et les cellules immunitaires dérivées de souris, et nous nous concentrons sur l’immunosurveillance. Compte tenu des caractéristiques liées au temps et à l’argent de ce protocole, il est certainement réalisable à grande échelle. De plus, avec des variations mineures, ce protocole peut être à la fois adapté aux lignées cellulaires cancéreuses humaines et aux cellules immunitaires dérivées du sang périphérique humain et combiné à une inhibition génétique et/ou pharmacologique de voies spécifiques afin d’identifier des biomarqueurs de la réponse immunitaire.

Introduction

Au cours des dernières décennies, l’immunothérapie a été à l’avant-garde des options de pointe pour le traitement du cancer. L’exploitation du système immunitaire à des fins antitumorales a fourni une puissante preuve de concept au profit des patients pour diverses hémopathies malignes et solides avec des pronostics historiquement mauvais. Comme l’immunothérapie offre une opportunité pour des cancers autrement difficiles à traiter, elle connaît un rythme de progrès étonnamment rapide. De tels progrès peuvent être, au moins en partie, attribués à la compréhension affinée de l’interaction entre les cellules cancéreuses et les cellules immunitaires. Cette interaction ressemble à un « moteur » que le système immunitaire déclenche pour détruire les cellules cancéreuses, ce qu’on appelle le cycle cancer-immunité. Cette réponse immunitaire anticancéreuse progresse à trois niveaux principaux : la reconnaissance, le traitement et la réaction. Tout d’abord, dans la phase de reconnaissance, les antigènes tumoraux (Ag) produits lors de la formation de la tumeur sont libérés par les cellules cancéreuses mourantes dans le microenvironnement tumoral (TME, étape 1) et englouties par les cellules dendritiques infiltrant la tumeur (DC, étape 2). Ensuite, dans la phase de traitement, les DC présentent les épitopes des Ags tumoraux capturés à travers les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH), expriment à leur surface des niveaux plus élevés de molécules costimulatrices (étape 3) et se déplacent vers les ganglions lymphatiques draineurs de tumeurs (dLN) pour présenter leur cargaison aux lymphocytes T CD8 naïfs (CD8N, étape 4). Toutes ces étapes convergent dans le processus final de réaction au cours duquel les lymphocytes T CD8 (CD8C-P) spécifiques de l’Ag tumoral sont activés, deviennent des lymphocytes T CD8 effecteurs (CD8E) et subissent une expansion clonale (étape 5). Les cellulesE CD8 quittent ensuite les dLN et se dirigent vers le TME par le sang (étape 6) où elles reconnaissent et se lient spécifiquement aux cellules cancéreuses par l’interaction entre leur récepteur des cellules T (TCR) et leurs Ags tumoraux apparentés, libèrent des molécules cytotoxiques [c’est-à-dire l’interféron (IFN)-γ, les perforines et les granzymes (Grzs)] et tuent les cellules cancéreuses (étape 7)1, 2. Aéroport La destruction des cellules cancéreuses conduit à la libération d’autres Ags tumoraux pour alimenter le cycle cancer-immunité. En fait, à travers toutes ces étapes, le système immunitaire détruit et rejette les cellules cancéreuses beaucoup plus souvent qu’on ne le suppose. Cependant, chez les patients atteints de cancer, au moins une de ces étapes ne fonctionne pas correctement. Nous et d’autres avons montré que les cellules cancéreuses cherchent à bloquer la réponse immunitaire en évoluant vers des variantes plus agressives et immunitairement privilégiées 3,4,5 ou en entravant l’efficacité des cellules T 6,7.

La recherche sur le cancer et le développement de médicaments anticancéreux reposent tous deux sur des modèles expérimentaux qui permettent d’étudier la relation entre le cancer et les cellules immunitaires, ce que l’on appelle l’onco-immunologie. Voici des modèles in vitro rapides, fiables, reproductibles et peu coûteux qui reproduisent de manière exhaustive chaque étape du cycle d’onco-immunologie et offrent une vue rapide et claire des ensembles de caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles de l’immunosurveillance et éventuellement de l’immunoédition.

La cytométrie en flux multiparamétrique (mFC) est l’un des outils d’analyse unicellulaire les plus performants dans la recherche fondamentale sur le cancer, le diagnostic et la recherche translationnelle dans les essais cliniques sur le cancer. Comme il permet de capturer simultanément plus de caractéristiques dans chaque cellule, mFC a gagné sa place de plate-forme d’analyse de référence en onco-immunologie. Il associe une sensibilité et une spécificité élevées à la possibilité de mesurer rapidement et de manière reproductible plusieurs modèles d’expression protéique et propriétés fonctionnelles à partir d’une seule cellule à partir de suspensions cellulaires hétérogènes et même hétérotypiques, comme celles du TME 8,9,10. Étant donné que les profils d’expression phénotypiques et fonctionnels sont sensibles au facteur temps, il est essentiel d’accorder une attention particulière à la conception de l’expérience, à la sélection de panels, de témoins et d’anticorps titrés appropriés, ainsi qu’à l’utilisation appropriée du traitement des échantillons et de l’instrumentation pour assurer la fiabilité, la comparabilité et la reproductibilité des résultats et pour interpréter avec confiance le résultat de l’expérience11.

Les dispositifs microfluidiques de tumeur sur puce (ToCs) modélisent le TME en permettant des biomimétiques à l’échelle microscopique in vitro de la dynamique et des interactions des cellules cancéreuses et immunitaires 12,13,14,15. Plus précisément, les ToC sont des dispositifs de culture cellulaire microfluidique multicanaux capables d’héberger divers types de cellules organisés en cultures bidimensionnelles (2D) ou tridimensionnelles (3D) et capables de modéliser avec une grande fidélité et de contrôler avec une grande précision, des unités structurelles et fonctionnelles clés telles que les interactions cellulaires hétérotypiques et les flux de gradients chimiques qui se produisent physiologiquement dans le TME12, 13, 14 et 15. En particulier, la chimioattraction et les trajectoires immunitaires, ainsi que l’interaction des cellules immunitaires avec les cellules cancéreuses, peuvent être surveillées en temps réel et quantifiées par microscopie time-lapse et analyse de suivi automatisée 5,12,13,14,15,16. De plus, les ToC offrent la possibilité d’analyser et de manipuler les processus cruciaux régulant l’apparition et la progression du cancer et la réponse au traitement17.

Dans cet article, les mFC et les ToC sont combinés pour étudier tous les niveaux de la réponse immunitaire anticancéreuse passant par la phagocytose médiée par DC des Ags cancéreux (étapes 1-3), l’amorçage croisé des lymphocytes T (étape 4), l’activation et l’expansion clonale (la dernière au moyen de la technologie de cycloaddition catalysée par la 5-éthynyl-2′-désoxyuridine (EdU) et Cu(I), une méthodologie très sensible et précise, étape 5), la désignation des cellules CD8E vers l’EUT (étape 6) et, enfin, la destruction des cellules cancéreuses médiée par les cellules CD8E (étape 7, figure 1).

Ce travail contribue à l’effort visant à établir des protocoles standard simples, rapides et fiables pour étudier le cycle cancer-immunité. L’amélioration et l’intégration des modèles mFC et ToC dans la recherche sur le cancer, la dynamique des EUT et la réponse au traitement présentent un grand potentiel, car ces modèles offrent une fidélité biologique ainsi qu’un contrôle expérimental. Par conséquent, ce protocole aide à recréer, de manière progressive, le cycle cancer-immunité en permettant de caractériser, de surveiller et de manœuvrer en temps opportun les rôles des acteurs cellulaires individuels et leurs interactions réciproques sur l’immunosurveillance naturelle et acquise. En fin de compte, cela permettra d’affiner, de réduire et de remplacer les études sur les animaux tout en fournissant des informations essentielles pour déjouer les tumeurs et guider les soins cliniques. Enfin, les avantages et les limites de la mFC et de la ToC sont discutés de manière critique et comparés aux technologies de pointe (par exemple, les analyses spatiales à haute résolution cellulaire et même subcellulaire) pour faire avancer la recherche et la thérapie en onco-immunologie.

Protocol

Toutes les étapes du protocole nécessitant l’utilisation d’animaux sont conformes à la directive européenne 63/2010 et incluses dans un protocole expérimental approuvé par le Comité institutionnel d’expérimentation animale et le ministère italien de la Santé (numéro d’approbation 858/2015/PR). 1. Préparation des cellules cancéreuses Routine de culture de cellules cancéreuses (jour -7 ; durée : 2 h)Cultivez des cellules murines de fibrosarcome MCA205 dans un milieu de croissance 1640 du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) complété par 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin (FBS), 2 mM de L-glutamine, 100 UI/mL de sel de sodium de pénicilline G, 100 μg/mL de sulfate de streptomycine et 50 μg/mL d’hygromycine (milieu de croissance complet), dans un incubateur de culture cellulaire humidifié dans des conditions de culture standard (37 °C, 5 % de CO2).REMARQUE : Adaptez les conditions de culture en fonction de la lignée cellulaire choisie. En cas de décongélation, les cellules ont besoin de ~1 semaine de temps de récupération pour s’adapter à des conditions de culture optimales et rétablir des cycles cellulaires normaux. Pour optimiser la croissance de la culture cellulaire, mettre en plaque les cellules dans des flaconsde 2 de 75 cm à une densité de 1 x 106 cellules/mL dans 12-15 mL de milieu de croissance complet.REMARQUE : Le nombre de cellules ensemencées peut varier d’une lignée cellulaire à l’autre, généralement en fonction de la taille spécifique des cellules et du temps de doublage. La confluence cellulaire influence considérablement l’état des cellules. Si les cellules sont peu ou trop confluentes, des perturbations métaboliques peuvent se produire et favoriser l’arrêt prolifératif, la sélection clonale ou le stress cellulaire. Pour les cellules MCA205, le passage doit être effectué deux fois par semaine selon un rapport de répartition de 1:10-1:20. Lorsque les cultures cellulaires atteignent une confluence maximale de 75 % à 80 %, jetez le milieu de croissance complet de la monocouche cellulaire, lavez les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) préchauffée pour éliminer le FBS, puis ajoutez 1,5 ml de trypsine/acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) préchauffé à 0,25 % pendant 1 à 2 min à 37 °C pour détacher les cellules.REMARQUE : FBS contient des inhibiteurs de protéase qui peuvent inactiver l’activité enzymatique de la trypsine, donc son élimination complète est une étape cruciale. Le temps d’incubation de la trypsine diffère selon le type de cellule. En règle générale, il faut éviter l’incubation à long terme de cellules à forte concentration de trypsine, car elle peut rayer les protéines de surface cellulaire et déclencher la mort cellulaire. À cette étape, vérifiez l’état de détachement des cellules à l’aide d’un microscope optique. Prélever les cellules détachées dans 10 mL de milieu de croissance complet préchauffé pour inactiver l’activité enzymatique de la trypsine et les centrifuger pendant 5 min à 1100 × g à température ambiante (RT). Compter les cellules d’une lame de comptage cellulaire à l’aide de l’essai d’exclusion du colorant Trypan Blue, puis les réensemencer après dilution dans des supports appropriés pour la culture d’entretien (pas plus de 8 passages avant la décongélation) ou pour les procédures expérimentales en aval, comme détaillé ci-dessous. Mort des cellules cancéreuses – libération d’Ags de cellules cancéreuses (jour 0 ; durée : 30 min)Pour les expériences fonctionnelles en aval, plaquez 3 × 106 cellules MCA205 dans une boîte de Pétri de 100 mm traitée par culture tissulaire dans 10 mL de milieu de croissance complet.REMARQUE : Pour des applications expérimentales spécifiques (par exemple, l’analyse de l’absorption d’Ag tumorale médiée par DC ), avant d’induire la mort cellulaire, les cellules cancéreuses ont été marquées à l’aide d’un linker cellulaire fluorescent (Table des matériaux), conformément aux instructions du fabricant. Irradiez des cellules avec une lumière ultraviolette (UV)18 (ƛ = 254 nm) à une distance de 9 cm pendant 3 min, puis incubez-les à 37 °C, 5 % de CO2 pendant au moins 6 h pour les laisser mourir.REMARQUE : La mort des cellules cancéreuses peut également être induite par un traitement chimiothérapeutique (par exemple, des médicaments immunogènes ou non immunogènes5). 2. Co-culture de cellules cancéreuses et immunitaires Absorption et présentation de l’Ag du cancer médié par les DC (jour 0 ; Durée : 1 h de paillasse, 24 h d’incubation)Après 4 à 6 h, prélever les CD différenciés in vitro des cellules de la moelle osseuse (BM) de souris immunocompétentes comme décrit précédemment8, et les laver deux fois pendant 5 min à 1100 x g à RT dans un milieu de croissance complet.REMARQUE : Les DC peuvent également être isolés des splénocytes de souris par centrifugation sur un gradient basé sur Histodenz, comme indiqué précédemment19. En cas d’utilisation de CD cryoconservés, assurez-vous de préchauffer le milieu de croissance complet et de le compléter avec de la benzonase 1:1000 pour éviter l’agglutination des cellules et ainsi assurer une bonne récupération lors de la décongélation. Prélever les cellules cancéreuses irradiées aux UV à partir de l’étape 1.2.2 et les centrifuger pendant 5 min à 1100 x g à RT. Compter les DC « vides » dérivées de BM (DCN) comme ci-dessus (voir étape 1.1.4) puis régler la co-culture avec des cellules apoptotiques irradiées aux UV à un rapport de 2:1 (5 × 105 cellules MCA205 apoptotiques pour 2,5 × 105 DC, comme précédemment optimisé8) dans des plaques de 12 puits dans 1 mL de milieu de croissance complet frais pendant 24 h à 37 °C, 5 % de CO2. En tant que témoins expérimentaux, incubez des cellules à 4 °C, une condition dans laquelle la phagocytose est entravée.REMARQUE : N’augmentez pas la surface et le volume de co-culture car cela pourrait entraver les interactions cellules cancéreuses apoptotiques-DC et ainsi entraver une phagocytose optimale et efficace. De plus, des études visant à optimiser le rapport cellules cancéreuses :DC doivent être réalisées si d’autres modèles de cellules cancéreuses sont utilisés. Évaluation de l’absorption de l’Ag cancéreux par mFC (jour 1 ; durée : 2 h)Après 24 h d’incubation, prélever les cellules dans des tubes de 15 mL et les laver deux fois pendant 5 min à 1100 x g à RT dans 10 mL de milieu de croissance complet.REMARQUE : Pour réduire le bruit de fond des cellules apoptotiques collées à la membrane DC et pas encore complètement englouties, les pastilles cellulaires sont incubées pendant 5 min à RT avec 0,1 M EDTA. Les suspensions cellulaires (contenant environ 2 x 106 cellules) sont ensuite centrifugées deux fois avec 10 mL de milieu de croissance, comme à l’étape 2.2.1. Pour la coloration de la surface cellulaire, remettre en suspension les DC dérivés de la BM dans 20 μL de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence froide (FACS) (1 % FBS, 0,1 M EDTA dans le PBS) contenant 0,5 μg de contrôle d’isotype IgG ou de CD11c conjugué à la phycoérythrine (PE) anti-souris dans une microplaque de culture tissulaire inférieure en forme de U de 96 puits traitée par culture tissulaire et les incuber pendant 20 min à 4 °C dans l’obscurité pour préserver le signal fluorochrome et éviter le photoblanchiment.REMARQUE : Une fois que l’absorption de l’antigène cancéreux se produit, l’activation « complète » de la DC (DCPHAGO) peut également être vérifiée en vérifiant les niveaux d’expression des molécules de costimulation (c’est-à-dire CD80 ou CD86 et le CMH-II et de l’antigène du ligand du point de contrôle immunitaire CD274 [mieux connu sous le nom de PDL1]). En règle générale, pour une performance optimale du cytomètre en flux, la concentration d’anticorps doit être soigneusement titrée et le nombre de cellules doit varier de 1 x 105 à 1 x 108 cellules/test. Ensuite, laver les cellules deux fois dans un tampon FACS et ajouter 100 μL d’une solution PBS contenant un colorant proche infrarouge (IR) fixable à la vitalité à une concentration finale de 1 μM pendant 30 min à RT.REMARQUE : Comme alternative, d’autres colorants fixables à la vitalité (par exemple, violet, bleu, orange, chaux, aqua) ne chevauchant pas les émissions de fluorescence utilisées peuvent être utilisés. Laver les cellules une fois dans le PBS et les remettre en suspension dans le tampon FACS avant l’analyse cytométrique en flux des niveaux de CD11c et PKH67 au moyen de mFC. Lors de l’acquisition du mFC, puis de l’analyse des données, procédez à la stratégie de contrôle suivante :Identifiez les cellules d’intérêt en fonction de leurs propriétés de zone de diffusion vers l’avant (FSC-A, axe x) et de zone de diffusion latérale (SSC-A, axe y) (porte 1). Excluez les doublets et les amas de cellules de l’analyse en traçant la hauteur de diffusion FSC-A (axe x) et la hauteur de diffusion vers l’avant (FSC-H, axe y, porte 2). Éliminez les cellules mortes en traçant la zone de filtre passe-bande (bp) d’émission de 780/60 nm (axe x) et SSC-A (axe y, porte 3). Enfin, sur la base de la porte 3, détecter la positivité cellulaire pour le marqueur CD11c et le linker cellulaire fluorescent PKH67 dans des graphiques de densité à deux paramètres en utilisant des filtres d’émission bp 575/26 nm et 530/30 nm, respectivement. Effectuer l’analyse des données.REMARQUE : Assurez-vous de combiner les anticorps afin de garantir un marquage facile et efficace avec des longueurs d’onde d’émission bien séparées. Cela simplifie le réglage de la compensation des fluorophores utilisés et permet une quantification facile, rapide et fiable des paramètres d’intérêt. Amorçage et activation des lymphocytes T CD8 (jour 1 ; Durée : 1 h de paillasse, 72-96 h d’incubation)Purifier les lymphocytes T CD8 spléniques murins (CD8N) comme décrit précédemment8. Compter et remettre en suspension les lymphocytes T CD8 isolés dans 500 μL de milieu de croissance complet frais et les cultiver avec des CD dérivés de BM qui avaient précédemment absorbé des cellules MCA205 apoptotiques dans un rapport de 2,5:1 (2,5 × 105 DC pour 1 × 105 cellules T, comme précédemment optimisé8) pendant 72 h dans des plaques à 12 puits dans un volume final de 1,5 mL à 37 °C, 5% de CO2.REMARQUE : Pour mettre l’accent sur les résultats expérimentaux, différents ratios de culture cellulaire ont été testés et le meilleur a été choisi. Analyse de la prolifération des lymphocytes T CD8 par test EdU mFC (jour 4 ; Durée : 15 min de paillasse, 16-20 h d’incubation)Ajouter l’analogue nucléosidique à la thymidine EdU dans le milieu de co-culture à une concentration finale de 10 μM et bien mélanger.REMARQUE : Étant donné que les conditions de culture, les variations du type cellulaire et la densité cellulaire peuvent affecter l’incorporation de l’EdU dans l’ADN, testez une gamme de concentrations d’EdU et de temps d’incubation dans des expériences pilotes. Les incubations plus longues ou plus courtes peuvent nécessiter des concentrations plus faibles ou plus élevées, respectivement. Incluez des cellules de la même population qui n’ont pas été traitées avec EdU comme contrôle de coloration négatif. Après 16-20 h, récupérer et centrifuger CD8C-P deux fois pendant 5 min à 1100 x g à RT. Colorez les cellules pour les marqueurs de surface dans 20 μL de tampon FACS froid complété par 0,5 μg de CD8a conjugué à l’isothiocyanate de fluorescéine de souris (FITC) et 0,25 μg de CD3 conjugué à l’isotype PE anti-souris ou avec les témoins d’isotypes IgG respectifs dans une microplaque de fond en forme de U traitée TC à 96 puits et incubez-les pendant 20 min à 4 °C dans l’obscurité.REMARQUE : Pour éviter toute interférence, il est recommandé de ne pas utiliser de conjugués d’anticorps Qdot avant d’effectuer la réaction de clic. Laver les cellules deux fois dans le tampon FACS (comme à l’étape 2.2.3) et remettre en suspension les pastilles cellulaires dans 100 μL d’une solution PBS contenant le colorant Aqua fixable pour la vitalité à une concentration finale de 1 μM pendant 30 min à RT.Transférez les suspensions cellulaires dans des tubes d’écoulement, lavez-les une fois avec 3 mL d’albumine sérique bovine (BSA) à 1 % dans du PBS, et procédez à la fixation cellulaire dans 100 μL d’un fixateur (c’est-à-dire du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS) pendant 15 min à l’heure actuelle, à l’abri de la lumière. Immédiatement après, laver les cellules une fois avec 3 mL de BSA à 1 % dans du PBS, les incuber dans 100 μL d’une solution contenant 1x réactif de perméabilisation à base de saponine et de lavage pendant 15 min à RT, puis passer directement à la réaction de marquage.REMARQUE : 1x réactif de perméabilisation et de lavage à base de saponine est préparé en diluant un volume de 10x solution 1:10 avec 1% BSA dans PBS. Ce réactif peut également être utilisé avec des suspensions cellulaires contenant du sang total ou des globules rouges, car il préserve les caractéristiques morphologiques de diffusion de la lumière des leucocytes tout en lysant les globules rouges. En fonction du nombre d’échantillons à analyser, préparez le cocktail réactionnel en mélangeant doucement et séquentiellement les volumes indiqués de PBS, de catalyseur protecteur de cuivre, d’azoture de picolyle conjugué à Alexa Fluor (AF) 647 et d’1x additif tampon EdU.Utilisez le cocktail réactionnel dans les 15 minutes suivant la préparation. Ajouter 500 μL du mélange réactionnel dans chaque tube, bien mélanger et incuber pendant 30 min à RT dans l’obscurité. Laver les cellules une fois avec 3 mL de réactif de perméabilisation et de lavage à base de saponine 1x, et les remettre en suspension dans 100 μL de la même solution avant de procéder avec les méthodes mFC standard pour déterminer le pourcentage de CD8C-P proliférant en phase S dans la population cellulaire au moyen de mFC. Lors de l’acquisition du mFC puis de l’analyse des données, procédez à la stratégie de contrôle suivante :Identifiez les cellules d’intérêt en fonction de leurs propriétés FSC-A (axe x) et SSC-A (axe y) (porte 1). Excluez les doublets et les amas de cellules de l’analyse en traçant FSC-A (axe des x) et FSC-H (axe des y, porte 2). Éliminez les cellules mortes en traçant la zone du filtre bp d’émission 525/50 nm (axe x) et SSC-A (axe y, porte 3). Détectez la positivité cellulaire pour CD8a et CD3 dans des diagrammes de densité à deux paramètres en utilisant des filtres d’émission bp 530/30 nm et 575/26 nm, respectivement (porte 4). Enfin, sur la base de la porte 4, analysez davantage les cellules pour l’incorporation de l’AF647-EdU en tant qu’intensité fluorescente moyenne dans un histogramme à paramètre unique à l’aide d’un filtre d’émission de 660/620 nm bp.REMARQUE : Le signal fluorescent généré par le marquage EdU est mieux détecté en utilisant un faible débit lors de l’acquisition. Effectuer l’analyse des données. 3. Restimulation de CD8C-P avec des cellules cancéreuses CD8C-P reconnaît les cellules cancéreuses vivantes (jour 4 ; Durée : 1 h de paillasse, 48-72 h d’incubation)Récupérer lesCD8 C-P issus de la co-culture (voir l’étape 2.3.2) et les centrifuger pendant 10 min à 1100 x g à RT dans 10 mL de milieu de croissance complet.REMARQUE : À cette étape, vérifiez la différenciation des lymphocytes T CD8 en vérifiant les niveaux d’expression du marqueur d’activation CD95. Mettre en suspension des pastilles de cellules, contenant environ 2,5 × 106 cellules, dans 100 μL de microbilles d’élimination des cellules mortes par 1 x 107 cellules au total.REMARQUE : Pour un nombre de cellules plus élevé, augmentez les volumes de réactif et les volumes totaux en conséquence. Bien mélanger et incuber 15 min à RT.REMARQUE : Si nécessaire, le volume de l’échantillon est ajusté en ajoutant 1 tampon de liaison, conformément aux instructions du fabricant, pour atteindre un minimum de 500 μL requis pour la séparation magnétique. Immédiatement après, procédez à la séparation magnétique des cellules. Placez les colonnes de séparation dans le champ magnétique d’un séparateur approprié et rincez-les avec la quantité appropriée de 1x tampon de liaison. Transférez les suspensions cellulaires dans des colonnes de séparation et collectez le flux contenant la fraction de cellule vivante non marquée. Lavez à nouveau les colonnes avec la quantité appropriée de 1x tampon de liaison. Prélever les cellules non marquées qui passent à travers et les combiner avec l’effluent à partir de l’étape 3.1.4.REMARQUE : Pour augmenter l’efficacité de l’élimination magnétique des cellules mortes, la fraction de cellules vivantes peut être enrichie au cours d’une deuxième procédure de séparation comme décrit aux étapes 3.1.1 à 3.1.5 à l’aide d’une nouvelle colonne. Centrifuger des CD8C-P vivants enrichis par centrifugation pendant 5 min à 1100 x g à RT dans un milieu de croissance complet avant le comptage des cellules, puis les cultiver avec des cellules MCA205 fraîches dans un rapport de 2:1 (1 x 105 cellules T CD8 pour 5 x 104 cellules MCA205, comme précédemment optimisé8) dans 12 plaques à puits dans un volume final de 1 mL. Après l’ensemencement cellulaire, placer les plaques de coculture dans un incubateur de culture cellulaire humidifié ou dans un système d’analyse de cellules vivantes pendant 72 h à 37 °C, 5 % de CO2, avant de procéder aux essais en aval. Trafic des lymphocytes T CD8 vers les cellules cancéreuses dans des modèles microfluidiques de TdC (jour 5 ; Durée : 2 h de paillasse, 72 h d’incubation)Stériliser les dispositifs microfluidiques ToC13,20 fabriqués ad hoc sous une armoire UV pendant 20 min, laver deux fois avec du PBS, puis incuber avec un milieu de culture complet pendant au moins 1 h.REMARQUE : Les cellules MCA205 et CD8C-P ne sont pas colorées dans ce protocole ; Cependant, les deux peuvent être marqués avec des trackers de cellules fluorescents compatibles avec Live. Remettre doucement en suspension 1 × 105 cellules MCA205 dans 15 μL de milieu de croissance complet, en prenant soin d’obtenir une distribution cellulaire homogène, et les injecter lentement dans les chambres de puce du côté gauche (chambre tumorale) comme décrit précédemment. Attendez 5 à 10 minutes pour laisser les cellules cancéreuses adhérer au sous-sol de la puce.Vérifiez au microscope la répartition correcte et homogène des cellules cancéreuses dans la puce microfluidique. Les résultats expérimentaux peuvent être affectés par la présence de bulles. Mettre en suspension 1 x 106 CD8C-P dans 50 μL de milieu de culture complet. Pipeter doucement la suspension des cellules immunitaires dans les chambres à puce du côté droit (chambre immunitaire).REMARQUE : À cette étape, utilisez un microscope pour confirmer que les cellules immunitaires sont réparties dans la chambre intermédiaire, créant ainsi un « front », qui représente le point de départ de l’expérience. Pour éviter les fluctuations de pression et microfluidiques, remplissez soigneusement tous les réservoirs de puces comme indiqué précédemment13 avec jusqu’à 150 μL de milieu de croissance complet et placez les puces assemblées sur une surface plane dans un incubateur de culture cellulaire humifié à 37 °C, 5% CO2 pendant au moins 1 h pour stabiliser le système avant les enregistrements en accéléré.REMARQUE : Vérifiez soigneusement les pertes potentielles par évaporation des volumes dans les deux réservoirs de chaque chambre à copeaux et compensez-les en ajoutant du milieu frais tous les 2 à 3 jours. Si nécessaire, jusqu’à 100 μL de surnageants peuvent être aspirés à partir de chaque compartiment cellulaire pour effectuer le profilage des cytokines. Utiliser une installation de microscopie vidéo équipée d’un système d’incubation pour enregistrer des séries d’images en fond clair du réseau de microcanaux entre les régions droite et gauche du dispositif contenant respectivement MCA205 et les cellules immunitaires, et pour visualiser la dynamique de l’infiltration des cellules immunitaires et de l’interaction entre les cellules immunitaires et les cellules cancéreuses.REMARQUE : Dans le cadre expérimental utilisé ici, des enregistrements en accéléré des cellules ont été recueillis dans l’incubateur pendant 72 heures à l’aide d’un microscope qui a acquis une microphotographie toutes les 2 minutes. Optimisez les conditions d’imagerie pour éviter une photo-exposition excessive et avoir une fréquence d’images d’acquisition élevée afin d’effectuer facilement des analyses de suivi des cellules immunitaires en aval. À la fin du time-lapse, effectuez une analyse de suivi semi-automatique13,20. Activation de CD8E et évaluation cytométrique en flux de réactivité tumorale (jours 7 et 8 ; Durée : 2 h)Après 48 et 72 h d’incubation (voir étape 3.1.6), récupérer le CD8E et centrifuger deux fois pendant 5 min à 1100 x g à RT.REMARQUE : Pour évaluer les niveaux intracellulaires de molécules cytotoxiques produites par CD8 E (c.-à-d. IFN-γ et Grz-B), des cocultures de cellules cancéreuses et immunitaires ont été préalablement incubées pendant au moins 6 h avec 1:1000 de brefeldine A et 1:1500 de monensin. Pour la coloration de la surface cellulaire, remettre en suspension les cellules dans 20 μL de trois mélanges d’anticorps primaires différents préparés dans un tampon FACS froid, comme dans le tableau supplémentaire 1.REMARQUE : Pour garantir la spécificité de la liaison des anticorps, effectuer des expériences mFC en présence de contrôles appropriés des isotypes IgG, comme à l’étape 2.2.2. Incuber des cellules dans une microplaque de culture tissulaire inférieure en forme de U de 96 puits traitée pendant 20 min à 4 °C, à l’abri de la lumière. Pour les pastilles alvéolaires des mélanges A et B (tableau supplémentaire 1), passer directement à l’étape 3.3.5. Après un lavage rapide, ajouter 100 μL de solution de fixation/perméabilisation aux pastilles cellulaires du mélange C (tableau supplémentaire 1). Après une incubation de 20 min à 4 °C dans l’obscurité, laver les cellules deux fois dans 200 μL de tampon de perméabilisation/lavage à froid et les remettre en suspension dans 20 μL de tampon de perméabilisation/lavage à froid contenant 0,25 μg d’IFN-γ conjugué à FITC anti-souris et 0,125 μg de Grz-B conjugué à PE anti-souris ou avec les isotypes IgG respectifs. Incuber les cellules pendant 30 min à 4°C, à l’abri de la lumière. Ensuite, laver les cellules deux fois dans un tampon FACS et ajouter aux pastilles de cellules 100 μL d’une solution PBS contenant le colorant Aqua fixable pour la vitalité à une concentration finale de 1 μM pendant 30 min à RT (comme à l’étape 2.2.4). Laver les cellules une fois dans le PBS et les remettre en suspension dans le tampon FACS avant l’analyse cytométrique en flux de l’activation des lymphocytes T CD8 contre les cellules cancéreuses au moyen d’un mFC. Lors de l’acquisition du mFC puis de l’analyse des données, procédez à la stratégie de contrôle suivante :Identifiez les cellules d’intérêt en fonction de leurs propriétés FSC-A (axe x) et SSC-A (axe y) (porte 1). Excluez les doublets et les amas de cellules de l’analyse en traçant FSC-A (axe des x) et FSC-H (axe des y, porte 2). Éliminez les cellules mortes en traçant la zone du filtre bp d’émission 525/50 nm (axe x) et SSC-A (axe y, porte 3). Détectez la positivité cellulaire pour CD8a et CD3 dans des graphiques de densité à deux paramètres à l’aide de filtres d’émission bp 660/20 nm et 780/60 nm ou 530/30 nm et 575/26 nm (porte 4). Enfin, sur la base de la porte 4, analysez davantage les cellules dans des diagrammes de densité à deux paramètres pour les marqueurs CD44 (filtre bp d’émission 530/30 nm), CD25 (filtre bp d’émission 575/26 nm) et CD69 (filtre bp d’émission 450/50 nm) pour le marqueur CD137 (filtre bp d’émission 660/20 nm), et pour IFN-γ (filtre bp d’émission 530/30 nm) et Grz-B (filtre bp d’émission 575/26 nm) pour le mélange A, B et C (tableau supplémentaire 1), respectivement.REMARQUE : La réactivité tumorale des cellules CD8E peut être testée davantage en évaluant l’expression de surface de la protéine associée lysosomale CD107a au moyen d’un test de dégranulation ad hoc . Effectuer l’analyse des données. Étude de la destruction tumorale médiée par les cellules CD8E par système d’analyse de cellules vivantes et mFC (jour 8 ; Durée : 1 h de paillasse, 72 h d’incubation)Pour un test de destruction de tumeurs au moyen d’un système d’analyse de cellules vivantes, complétez le milieu de co-culture (voir étape 3.1.6) avec un colorant de quantification de la mort cellulaire en temps réel à une concentration finale de 250 nM. Après avoir placé les plaques de coculture dans le système d’analyse de cellules vivantes, laissez la plaque se réchauffer à 37 °C pendant 30 minutes avant de la balayer. Effectuez un balayage des données toutes les 2 h jusqu’à 72 h pour collecter des enregistrements en accéléré, qui seront analysés par des logiciels appropriés. Pour un test de destruction de tumeurs à l’aide de mFC, 72 h plus tard (voir étape 3.1.6), prélever et centrifuger les cellules deux fois pendant 5 min à 1100 x g à RT. Colorer des cellules pour marqueurs de surface dans 20 μL de tampon FACS froid contenant 0,125 μg de contrôle d’isotype IgG ou de CD45 conjugué anti-bleu du Pacifique (PB) anti-souris dans une microplaque inférieure en forme de U de 96 puits traitée TC et les incuber pendant 20 min à 4 °C dans l’obscurité. Immédiatement après, laver les cellules deux fois dans le tampon FACS et ajouter le colorant de vitalité iodure de propidium (PI) à une concentration finale de 1 μM avant l’analyse cytométrique en flux. Lors de l’acquisition du mFC puis de l’analyse des données, procédez à la stratégie de contrôle suivante :Identifiez les cellules d’intérêt en fonction de leurs propriétés FSC-A (axe x) et SSC-A (axe y) (porte 1). Excluez les doublets et les amas de cellules de l’analyse en traçant FSC-A (axe des x) et FSC-H (axe des y, porte 2). Détectez les cellules cancéreuses pour la négativité CD45 à l’aide d’un filtre bp d’émission 450/50 nm (porte 3). Enfin, analysez les cellules pour l’incorporation de PI en tant qu’intensité fluorescente moyenne dans un histogramme à paramètre unique à l’aide d’un filtre d’émission de 610/620 nm bp.REMARQUE : La mort cellulaire cancéreuse peut également être analysée en effectuant un test d’apoptose Annexin V-PI ou en évaluant les niveaux d’expression des caspases-3 et -7 clivées. Effectuer l’analyse des données.REMARQUE : Les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide du logiciel Prism GraphPad v.8.4.0.

Representative Results

La capacité des CD CD11c+, le sous-ensemble de phagocytes largement connu spécialisé pour la présentation croisée21,22 et déclenché, comme le montre la figure 2A, à engloutir les corps apoptotiques à partir de cellules cancéreuses MCA205 irradiées par UV qui étaient précédemment marquées avec le lieur de cellules fluorescentes PKH67 a été évaluée par mFC. Comme prévu, les CD CD11c+ ont captur…

Discussion

Le suivi de la réponse immunitaire anticancéreuse est de la plus haute importance pour élucider et comprendre les interactions moléculaires et cellulaires complexes qui agissent dans le TME et soutiennent une lutte constante pour la suprématie23. Nous détaillons ici un protocole simple assisté par mFC et ToC pour le suivi et la caractérisation des étapes constituant le cycle cancer-immunité. Avec des variations mineures, ce protocole, basé sur des lignées cellulaires murines et des cel…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

A.S. est soutenu par AIRC (IG #28807) et par PRIN (#P2022YE2MX). M.M. est soutenu par la bourse AIRC-FIRC (#25558). A.D.N. est soutenu par l’écosystème d’innovation Rome Technopole ECS00000024 financé par l’UE – Next Generation EU, PNRR Mission 4 Component 2 Investment 1.5.

Materials

1.5 mL microtubes  Eppendorf 30120086
100 kV e-beam litography Vistec
100 mm Petri dishes  Greiner Bio One 664160
12-well plates Euroclone  ET3012
15 and 50 mL tubes Corning  352096; 352070
40 μm cell strainer  Corning  CLS431750
5 mL polystyrene tubes  Greiner Bio-One 120180
70 μm cell strainer  Corning  CLS431751
75 cm2 cell culture treated flask Euroclone  ET7076
Adsorbent wipes
Allumin foil
anti-mouse CD107a (LAMP-1) Antibody Miltenyi Biotec 130-111-319
anti-mouse CD25 (7D4) Antibody  Miltenyi Biotec 130-118-678
anti-mouse CD3 (17A2) Antibody BioLegend 100206
Aptes Sigma Aldrich 440140
BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug BD Biosciences 555028
BD GolgiPlug Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A) BD Biosciences 555029
BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) BD Biosciences 554724
Bovine serum albumin (BSA) US Biological, Salem A1312
CD11c Monoclonal Antibody (N418) eBioscience 12-0114-81
CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibody (17B5) eBioscience 17-1371-82
CD3 Monoclonal Antibody (17A2) eBioscience 25-0032-82
CD44 Monoclonal Antibody (IM7) eBioscience 11-0441-82
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) Invitrogen MCD4528
CD69 Monoclonal Antibody (H1.2F3) eBioscience 48-0691-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7) eBioscience 11-0081-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7) eBioscience 17-0081-82
CD95 (APO-1/Fas) Monoclonal Antibody (15A7) eBioscience 53-0951-82
Cell counting slides Kova International 87144E
Chromium quartz masks MB W&A, Germany
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit Invitrogen C10635
CytoFLEX Flow Cytometer Beckman Coulter
Dead Cell Removal Kit Miltenyi Biotec 130-090-101
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) EuroClone ECB4053L
EDTA Invitrogen AM9260G
Fetal bovine serum (FBS) EuroClone ECS0180L
Flowjo v10.0.7 Flowjo, LLC
Granzyme B Monoclonal Antibody (NGZB) eBioscience 12-8898-82
H2O2 Sigma Aldrich
H2SO4 Sigma Aldrich
hotplate
Humified cell culture incubator (37°, 5% CO2) Thermo Scientific
Ice machine Brema Ice Makers
IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2) eBioscience 11-7311-82
Illustrator CC 2015 Adobe Systems Inc.
ImageJ National Institute of Health
Incucyte 2022A Software Sartorius
Incucyte Cytotox Dye for Counting Dead Cells Sartorius 4632
Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System  Sartorius
JuLi Smart Fluorescent Live Cell Imaging Microscope Bulldog Bio
Laboratory bench
Laboratory refrigerator (4°C)
Laboratory Safety Cabinet (Class II) Angelantoni
L-glutamine 200 mM EuroClone ECB3004D
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit Invitrogen L34957
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Invitrogen L10119
MACS columns Miltenyi Biotec 130-042-201; 130-042-401 
MACS separators Miltenyi Biotec 130-042-10; 130-042-302
MCA205 mouse fibrosarcoma cell line Sigma-Aldrich SCC173
Microbiologically controlled animal facility equipped with Class II safety cabine
MicroCL 21R Microcentrifuge Thermo Scientific 75002552
Microsoft Excel  Microsoft, Redmond 
Mouse: C57BL/6J The Jackson Laboratory 000664
Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyi Biotec 130-096-543
Nikon ECLIPSE Ts2 Nikon Instruments Inc.
NIS-Elements BR 5.30.0064-BIT Nikon Instruments Inc.
Optical litography EVG
Penicillin G sodium salt and streptomycin sulfate EuroClone ECB3001D/1
Pipet aid Drummond Scientific Co., Broomall, PA  4-000-201
Pipettes Eppendorf
PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits Sigma-Aldrich PKH67GL-1KT fluorescent cell linker  kit
plastic coverslip IBIDI 10812
Propidium Iodide Thermo Scientific P1304MP
Reactive Ion Etching system Oxford plasmalab
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) EuroClone ECB9006L
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) Corning- Millipore-Sigma; St. Louis,
MO
CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489
SL 16 Centrifuge Series Thermo Scientific 75004031
Sterile scalpels, surgical forceps, scissors and pliers
Sterile tips (1–10 μL, 20–200 μL, 1000 μL) EuroClone Spa, Milan, Italy ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005
SU-8 3000 series MicroChem corp, Newton, (MA)
Suite of dermal biopsy punches Kai Medical, Tedpella
Sylgard 184 Dowsil, Dow Corning 101697
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597) eBioscience 12-5961-82
Thermostatic bath
Timer
TMCS  Sigma Aldrich 92360
Trypan Blue Stain (0.4%) Thermo Scientific 15250061
Trypsin-EDTA w/ Phenol Red EuroClone ECM0920
Vacuum dessicator

References

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Citer Cet Article
Manduca, N., Maccafeo, E., De Ninno, A., Sistigu, A., Musella, M. Co-Culture In Vitro Systems to Reproduce the Cancer-Immunity Cycle. J. Vis. Exp. (208), e66729, doi:10.3791/66729 (2024).

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