Ici, nous détaillons un protocole simple, rapide et fiable assisté par cytométrie en flux multiparamétrique et tumeur sur puce pour surveiller et caractériser les étapes constituant le cycle cancer-immunité. En effet, une compréhension approfondie des interactions entre le cancer et les cellules immunitaires fournit des informations essentielles pour déjouer les tumeurs et guider les soins cliniques.
La recherche fondamentale sur le cancer et le développement de thérapies efficaces contre les attaques reposent toutes deux sur des études expérimentales détaillant les interactions entre le cancer et les cellules immunitaires, ce que l’on appelle le cycle cancer-immunité. Des systèmes de co-culture in vitro combinés à la cytométrie en flux multiparamétrique (mFC) et aux dispositifs microfluidiques (ToC) de tumeur sur puce permettent une surveillance et une caractérisation simples, rapides et fiables de chaque étape du cycle cancer-immunité et permettent d’identifier les mécanismes responsables de faire pencher la balance entre l’immunosurveillance du cancer et l’immunoévasion. Une compréhension approfondie des interactions dynamiques entre le cancer et les cellules immunitaires fournit des informations essentielles pour déjouer les tumeurs et accélérera le rythme de la personnalisation et de l’optimisation thérapeutiques chez les patients. Plus précisément, nous détaillons ici un protocole simple assisté par mFC et ToC pour démêler les complexités dynamiques de chaque étape du cycle cancer-immunité dans les lignées cellulaires cancéreuses murines et les cellules immunitaires dérivées de souris, et nous nous concentrons sur l’immunosurveillance. Compte tenu des caractéristiques liées au temps et à l’argent de ce protocole, il est certainement réalisable à grande échelle. De plus, avec des variations mineures, ce protocole peut être à la fois adapté aux lignées cellulaires cancéreuses humaines et aux cellules immunitaires dérivées du sang périphérique humain et combiné à une inhibition génétique et/ou pharmacologique de voies spécifiques afin d’identifier des biomarqueurs de la réponse immunitaire.
Au cours des dernières décennies, l’immunothérapie a été à l’avant-garde des options de pointe pour le traitement du cancer. L’exploitation du système immunitaire à des fins antitumorales a fourni une puissante preuve de concept au profit des patients pour diverses hémopathies malignes et solides avec des pronostics historiquement mauvais. Comme l’immunothérapie offre une opportunité pour des cancers autrement difficiles à traiter, elle connaît un rythme de progrès étonnamment rapide. De tels progrès peuvent être, au moins en partie, attribués à la compréhension affinée de l’interaction entre les cellules cancéreuses et les cellules immunitaires. Cette interaction ressemble à un « moteur » que le système immunitaire déclenche pour détruire les cellules cancéreuses, ce qu’on appelle le cycle cancer-immunité. Cette réponse immunitaire anticancéreuse progresse à trois niveaux principaux : la reconnaissance, le traitement et la réaction. Tout d’abord, dans la phase de reconnaissance, les antigènes tumoraux (Ag) produits lors de la formation de la tumeur sont libérés par les cellules cancéreuses mourantes dans le microenvironnement tumoral (TME, étape 1) et englouties par les cellules dendritiques infiltrant la tumeur (DC, étape 2). Ensuite, dans la phase de traitement, les DC présentent les épitopes des Ags tumoraux capturés à travers les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH), expriment à leur surface des niveaux plus élevés de molécules costimulatrices (étape 3) et se déplacent vers les ganglions lymphatiques draineurs de tumeurs (dLN) pour présenter leur cargaison aux lymphocytes T CD8 naïfs (CD8N, étape 4). Toutes ces étapes convergent dans le processus final de réaction au cours duquel les lymphocytes T CD8 (CD8C-P) spécifiques de l’Ag tumoral sont activés, deviennent des lymphocytes T CD8 effecteurs (CD8E) et subissent une expansion clonale (étape 5). Les cellulesE CD8 quittent ensuite les dLN et se dirigent vers le TME par le sang (étape 6) où elles reconnaissent et se lient spécifiquement aux cellules cancéreuses par l’interaction entre leur récepteur des cellules T (TCR) et leurs Ags tumoraux apparentés, libèrent des molécules cytotoxiques [c’est-à-dire l’interféron (IFN)-γ, les perforines et les granzymes (Grzs)] et tuent les cellules cancéreuses (étape 7)1, 2. Aéroport La destruction des cellules cancéreuses conduit à la libération d’autres Ags tumoraux pour alimenter le cycle cancer-immunité. En fait, à travers toutes ces étapes, le système immunitaire détruit et rejette les cellules cancéreuses beaucoup plus souvent qu’on ne le suppose. Cependant, chez les patients atteints de cancer, au moins une de ces étapes ne fonctionne pas correctement. Nous et d’autres avons montré que les cellules cancéreuses cherchent à bloquer la réponse immunitaire en évoluant vers des variantes plus agressives et immunitairement privilégiées 3,4,5 ou en entravant l’efficacité des cellules T 6,7.
La recherche sur le cancer et le développement de médicaments anticancéreux reposent tous deux sur des modèles expérimentaux qui permettent d’étudier la relation entre le cancer et les cellules immunitaires, ce que l’on appelle l’onco-immunologie. Voici des modèles in vitro rapides, fiables, reproductibles et peu coûteux qui reproduisent de manière exhaustive chaque étape du cycle d’onco-immunologie et offrent une vue rapide et claire des ensembles de caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles de l’immunosurveillance et éventuellement de l’immunoédition.
La cytométrie en flux multiparamétrique (mFC) est l’un des outils d’analyse unicellulaire les plus performants dans la recherche fondamentale sur le cancer, le diagnostic et la recherche translationnelle dans les essais cliniques sur le cancer. Comme il permet de capturer simultanément plus de caractéristiques dans chaque cellule, mFC a gagné sa place de plate-forme d’analyse de référence en onco-immunologie. Il associe une sensibilité et une spécificité élevées à la possibilité de mesurer rapidement et de manière reproductible plusieurs modèles d’expression protéique et propriétés fonctionnelles à partir d’une seule cellule à partir de suspensions cellulaires hétérogènes et même hétérotypiques, comme celles du TME 8,9,10. Étant donné que les profils d’expression phénotypiques et fonctionnels sont sensibles au facteur temps, il est essentiel d’accorder une attention particulière à la conception de l’expérience, à la sélection de panels, de témoins et d’anticorps titrés appropriés, ainsi qu’à l’utilisation appropriée du traitement des échantillons et de l’instrumentation pour assurer la fiabilité, la comparabilité et la reproductibilité des résultats et pour interpréter avec confiance le résultat de l’expérience11.
Les dispositifs microfluidiques de tumeur sur puce (ToCs) modélisent le TME en permettant des biomimétiques à l’échelle microscopique in vitro de la dynamique et des interactions des cellules cancéreuses et immunitaires 12,13,14,15. Plus précisément, les ToC sont des dispositifs de culture cellulaire microfluidique multicanaux capables d’héberger divers types de cellules organisés en cultures bidimensionnelles (2D) ou tridimensionnelles (3D) et capables de modéliser avec une grande fidélité et de contrôler avec une grande précision, des unités structurelles et fonctionnelles clés telles que les interactions cellulaires hétérotypiques et les flux de gradients chimiques qui se produisent physiologiquement dans le TME12, 13, 14 et 15. En particulier, la chimioattraction et les trajectoires immunitaires, ainsi que l’interaction des cellules immunitaires avec les cellules cancéreuses, peuvent être surveillées en temps réel et quantifiées par microscopie time-lapse et analyse de suivi automatisée 5,12,13,14,15,16. De plus, les ToC offrent la possibilité d’analyser et de manipuler les processus cruciaux régulant l’apparition et la progression du cancer et la réponse au traitement17.
Dans cet article, les mFC et les ToC sont combinés pour étudier tous les niveaux de la réponse immunitaire anticancéreuse passant par la phagocytose médiée par DC des Ags cancéreux (étapes 1-3), l’amorçage croisé des lymphocytes T (étape 4), l’activation et l’expansion clonale (la dernière au moyen de la technologie de cycloaddition catalysée par la 5-éthynyl-2′-désoxyuridine (EdU) et Cu(I), une méthodologie très sensible et précise, étape 5), la désignation des cellules CD8E vers l’EUT (étape 6) et, enfin, la destruction des cellules cancéreuses médiée par les cellules CD8E (étape 7, figure 1).
Ce travail contribue à l’effort visant à établir des protocoles standard simples, rapides et fiables pour étudier le cycle cancer-immunité. L’amélioration et l’intégration des modèles mFC et ToC dans la recherche sur le cancer, la dynamique des EUT et la réponse au traitement présentent un grand potentiel, car ces modèles offrent une fidélité biologique ainsi qu’un contrôle expérimental. Par conséquent, ce protocole aide à recréer, de manière progressive, le cycle cancer-immunité en permettant de caractériser, de surveiller et de manœuvrer en temps opportun les rôles des acteurs cellulaires individuels et leurs interactions réciproques sur l’immunosurveillance naturelle et acquise. En fin de compte, cela permettra d’affiner, de réduire et de remplacer les études sur les animaux tout en fournissant des informations essentielles pour déjouer les tumeurs et guider les soins cliniques. Enfin, les avantages et les limites de la mFC et de la ToC sont discutés de manière critique et comparés aux technologies de pointe (par exemple, les analyses spatiales à haute résolution cellulaire et même subcellulaire) pour faire avancer la recherche et la thérapie en onco-immunologie.
Le suivi de la réponse immunitaire anticancéreuse est de la plus haute importance pour élucider et comprendre les interactions moléculaires et cellulaires complexes qui agissent dans le TME et soutiennent une lutte constante pour la suprématie23. Nous détaillons ici un protocole simple assisté par mFC et ToC pour le suivi et la caractérisation des étapes constituant le cycle cancer-immunité. Avec des variations mineures, ce protocole, basé sur des lignées cellulaires murines et des cel…
The authors have nothing to disclose.
A.S. est soutenu par AIRC (IG #28807) et par PRIN (#P2022YE2MX). M.M. est soutenu par la bourse AIRC-FIRC (#25558). A.D.N. est soutenu par l’écosystème d’innovation Rome Technopole ECS00000024 financé par l’UE – Next Generation EU, PNRR Mission 4 Component 2 Investment 1.5.
1.5 mL microtubes | Eppendorf | 30120086 | |
100 kV e-beam litography | Vistec | ||
100 mm Petri dishes | Greiner Bio One | 664160 | |
12-well plates | Euroclone | ET3012 | |
15 and 50 mL tubes | Corning | 352096; 352070 | |
40 μm cell strainer | Corning | CLS431750 | |
5 mL polystyrene tubes | Greiner Bio-One | 120180 | |
70 μm cell strainer | Corning | CLS431751 | |
75 cm2 cell culture treated flask | Euroclone | ET7076 | |
Adsorbent wipes | |||
Allumin foil | |||
anti-mouse CD107a (LAMP-1) Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-319 | |
anti-mouse CD25 (7D4) Antibody | Miltenyi Biotec | 130-118-678 | |
anti-mouse CD3 (17A2) Antibody | BioLegend | 100206 | |
Aptes | Sigma Aldrich | 440140 | |
BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug | BD Biosciences | 555028 | |
BD GolgiPlug Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A) | BD Biosciences | 555029 | |
BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | |
Bovine serum albumin (BSA) | US Biological, Salem | A1312 | |
CD11c Monoclonal Antibody (N418) | eBioscience | 12-0114-81 | |
CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibody (17B5) | eBioscience | 17-1371-82 | |
CD3 Monoclonal Antibody (17A2) | eBioscience | 25-0032-82 | |
CD44 Monoclonal Antibody (IM7) | eBioscience | 11-0441-82 | |
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) | Invitrogen | MCD4528 | |
CD69 Monoclonal Antibody (H1.2F3) | eBioscience | 48-0691-82 | |
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7) | eBioscience | 11-0081-82 | |
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7) | eBioscience | 17-0081-82 | |
CD95 (APO-1/Fas) Monoclonal Antibody (15A7) | eBioscience | 53-0951-82 | |
Cell counting slides | Kova International | 87144E | |
Chromium quartz masks | MB W&A, Germany | ||
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit | Invitrogen | C10635 | |
CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) | EuroClone | ECB4053L | |
EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
Fetal bovine serum (FBS) | EuroClone | ECS0180L | |
Flowjo v10.0.7 | Flowjo, LLC | ||
Granzyme B Monoclonal Antibody (NGZB) | eBioscience | 12-8898-82 | |
H2O2 | Sigma Aldrich | ||
H2SO4 | Sigma Aldrich | ||
hotplate | |||
Humified cell culture incubator (37°, 5% CO2) | Thermo Scientific | ||
Ice machine | Brema Ice Makers | ||
IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2) | eBioscience | 11-7311-82 | |
Illustrator CC 2015 | Adobe Systems Inc. | ||
ImageJ | National Institute of Health | ||
Incucyte 2022A Software | Sartorius | ||
Incucyte Cytotox Dye for Counting Dead Cells | Sartorius | 4632 | |
Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System | Sartorius | ||
JuLi Smart Fluorescent Live Cell Imaging Microscope | Bulldog Bio | ||
Laboratory bench | |||
Laboratory refrigerator (4°C) | |||
Laboratory Safety Cabinet (Class II) | Angelantoni | ||
L-glutamine 200 mM | EuroClone | ECB3004D | |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34957 | |
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L10119 | |
MACS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201; 130-042-401 | |
MACS separators | Miltenyi Biotec | 130-042-10; 130-042-302 | |
MCA205 mouse fibrosarcoma cell line | Sigma-Aldrich | SCC173 | |
Microbiologically controlled animal facility equipped with Class II safety cabine | |||
MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002552 | |
Microsoft Excel | Microsoft, Redmond | ||
Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | |
Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-096-543 | |
Nikon ECLIPSE Ts2 | Nikon Instruments Inc. | ||
NIS-Elements BR 5.30.0064-BIT | Nikon Instruments Inc. | ||
Optical litography | EVG | ||
Penicillin G sodium salt and streptomycin sulfate | EuroClone | ECB3001D/1 | |
Pipet aid | Drummond Scientific Co., Broomall, PA | 4-000-201 | |
Pipettes | Eppendorf | ||
PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | PKH67GL-1KT | fluorescent cell linker kit |
plastic coverslip | IBIDI | 10812 | |
Propidium Iodide | Thermo Scientific | P1304MP | |
Reactive Ion Etching system | Oxford plasmalab | ||
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) | EuroClone | ECB9006L | |
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO |
CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489 | |
SL 16 Centrifuge Series | Thermo Scientific | 75004031 | |
Sterile scalpels, surgical forceps, scissors and pliers | |||
Sterile tips (1–10 μL, 20–200 μL, 1000 μL) | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005 | |
SU-8 3000 series | MicroChem corp, Newton, (MA) | ||
Suite of dermal biopsy punches | Kai Medical, Tedpella | ||
Sylgard 184 | Dowsil, Dow Corning | 101697 | |
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597) | eBioscience | 12-5961-82 | |
Thermostatic bath | |||
Timer | |||
TMCS | Sigma Aldrich | 92360 | |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Scientific | 15250061 | |
Trypsin-EDTA w/ Phenol Red | EuroClone | ECM0920 | |
Vacuum dessicator |