Ce protocole décrit une méthodologie pour transfecter les trophozoïtes de Naegleria gruberi avec une construction qui est maintenue tout au long du passage des trophozoïtes in vitro, ainsi que par l’enkystement et l’exkystement.
Tous les gènes ribosomiques de Naegleria trophozoites sont maintenus dans un élément contenant de l’ADN ribosomique extrachromosomique (ADNr) (CERE) circulaire et fermé. Bien que l’on sache peu de choses sur le CERE, une analyse complète de la séquence génomique de trois espèces de Naegleria démontre clairement qu’il n’y a pas de cistrons d’ADNr dans le génome nucléaire. De plus, une seule origine de réplication de l’ADN a été cartographiée chez N. gruberi CERE, soutenant l’hypothèse selon laquelle CERE se réplique indépendamment du génome nucléaire. Cette caractéristique de l’EREC suggère qu’il pourrait être possible d’utiliser l’ERE modifié pour introduire des protéines étrangères dans Naegleria trophozoites. Comme première étape dans l’exploration de l’utilisation d’un CERE comme vecteur chez Naegleria, nous avons développé un protocole pour transfecter N. gruberi avec un clone moléculaire du CERE de N. gruberi cloné en pGEM7zf+ (pGRUB). Après la transfection, pGRUB a été facilement détecté dans les trophozoïtes de N. gruberi pendant au moins sept passages, ainsi que par enkystement et exkystique. Comme contrôle, les trophozoïtes ont été transfectés avec le vecteur squelette, pGEM7zf+, sans les séquences de N. gruberi (pGEM). Le pGEM n’a pas été détecté après le premier passage suivant la transfection dans N. gruberi, ce qui indique son incapacité à se répliquer dans un organisme eucaryote. Ces études décrivent un protocole de transfection pour les trophozoïtes de Naegleria et démontrent que la séquence plasmidique bactérienne dans pGRUB n’inhibe pas la transfection et la réplication réussies du clone CERE transfecté. De plus, ce protocole de transfection sera essentiel pour comprendre la séquence minimale du CERE qui pilote sa réplication dans les trophozoïtes, ainsi que pour identifier les régions régulatrices dans la séquence non ribosomique (NRS).
Le genre Naegleria contient plus de 45 espèces, bien qu’il soit peu probable que tous les membres de l’espèce aient été identifiés1. Naegleria peut exister sous différentes formes : sous forme de trophozoïtes (amibes), de flagellés ou, lorsque les ressources sont sévèrement limitées, sous forme de kystes 1,2,3,4. Le genre Naegleria est reconnu pour sa seule espèce particulièrement dangereuse, Naegleria fowleri, connue sous le nom d’«amibe mangeuse de cerveau » (examinée dans 1,2,3,4,5,6,7), qui est la cause de la méningo-encéphalite amibienne primaire presque universellement mortelle.
Naegleria code leur ADNr sur le CERE situé dans le nucléole. Le séquençage complet des génomes de trois espèces de Naegleria confirme l’absence d’ADNr dans le génome nucléaire 8,9,10,11. D’après les séquences CERE complètes limitées, la CERE varie d’environ 10 kbp à 18 kbp de longueur. Les CERE de chaque espèce de Naegleria portent un seul cistron d’ADNr (contenant l’ADN ribosomique 5.8, 18 et 28S) sur chacune des 4 000 CERE par cellule 12,13,14. Outre l’ADNr, chaque CERE possède une grande séquence non ADNr (NRS). La taille des CERE varie d’une espèce à l’autre ; les différences sont principalement dues à la longueur variable du NRS, car les séquences d’ADNr sont hautement conservées dans le genre 1,15,16,17,18,19,20. La cartographie d’une origine unique de réplication de l’ADN au sein de N. gruberi CERE NRS21 fournit un soutien solide à l’hypothèse selon laquelle Naegleria CERE se réplique indépendamment du génome nucléaire.
N. gruberi est une amibe non pathogène souvent utilisée pour étudier la biologie de Naegleria . Nous avons développé une méthodologie pour transformer les trophozoïtes de N. gruberi avec un clone de CERE de la même espèce afin de tester l’hypothèse selon laquelle les amibes Naegleria tolèrent et répliquent indépendamment les CERE au sein des trophozoites. Cela a été accompli en transformant N. gruberi avec un clone complet de N. gruberi CERE en trophozoïtes et en suivant le destin du clone CERE donneur par réaction en chaîne par polymérase (PCR). La figure 1 donne un aperçu général du protocole. Les données présentées ici démontrent que le clone donneur peut être détecté par au moins sept passages en culture tissulaire, ainsi que par l’enkystement et l’exkystement. Ces études constituent la base d’un moyen de disséquer la réplication de CERE, ainsi que d’explorer son utilisation comme vecteur de transfection de Naegleria.
Le protocole décrit ici est très simple, bien que chaque construction nécessitera probablement un certain degré d’optimisation, en particulier du rapport ADN-réactif de transfection, en fonction de la nature de la construction et de l’espèce de Naegleria utilisée. Nous n’avons testé qu’un seul réactif de transfection disponible dans le commerce en utilisant ce protocole, mais il est probable que plusieurs autres puissent être efficaces. Étant donné qu’un clone complet de la CERE est utilis?…
The authors have nothing to disclose.
Ces études ont été partiellement financées par une subvention du Fonds George F. Haddix de l’Université Creighton (KMD). La figure 1 est générée dans biorender.com et la figure 3 est générée dans benchling.com.
Agarose | Bio Rad | 161-3102 | |
Ammonium Acetate | Sigma Aldrich | A-7330 | |
Calcium Chloride | Sigma Aldrich | C-4901 | |
Crushed ice | |||
Culture Flasks, T-75 | Thermo Scientific | 130190 | |
Culture Plate, 6-well | Corning | 3506 | |
DNAse | Sigma Aldrich | D-4527 | |
EDTA, 0.5 M | Affymetrix | 15694 | |
Electropheresis Gel Apparatus | Amersham Biosciences | 80-6052-45 | |
Eppendorf Tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Eppendorf Tubes, 2 mL | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
Ethanol, 100% | Decon Laboratories | 2716 | |
Ethidium Bromide | Sigma Aldrich | E-8751 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140 | |
Folic Acid | Sigma Aldrich | F7876-25G | |
GeneRuler 1 kb Plus Ladder | Thermo Scientific | SM1331 | |
Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific | UN2789 | |
GoTaq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
Heating Block | Thermo Scientific | 88871001 | |
Hemacytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
Hemin | Sigma Aldrich | 51280 | |
Iron Chloride | Sigma Aldrich | 372870-256 | |
Ligase | NEB | M2200S | |
Magneisum Chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
Microfuge | Thermo Scientific | MySpin 12 | |
Microscope | Nikon | TMS | |
N. gruberi | ATCC | 30224 | |
Nucleic Acid | Chem Impex Int’l | #01625 | |
Peptone | Gibco | 211677 | |
pGEM | Promega | P2251 | |
Potassium Phosphate | Sigma Aldrich | P0662-500G | |
PowerPac HC Electropharesis Power Supply Unit | Bio Rad | 1645052 | |
Sodium Chloride | MCB Reagents | SX0420 | |
Sodium Phosphate, dibasic | Sigma Aldrich | S2554 | |
Tabletop Centrifuge | eppendorf | 5415R | |
Tris, base | Sigma Aldrich | T1503-1KG | |
Trypan Blue, 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
ViaFect Reagent | Promega | E4981 | |
Weigh Scale | Denver Instruments | APX-60 | |
Yeast Extract | Gibco | 212750 |