Ce protocole décrit l’isolement des progéniteurs fibro-adipogéniques (FAP) du muscle squelettique et cardiaque de la souris épineuse (Acomys) par dissociation enzymatique et tri cellulaire activé par fluorescence. Les FAP obtenues à partir de ce protocole peuvent être efficacement étendues et différenciées en myofibroblastes et adipocytes.
En raison de son programme de réparation exceptionnel, la souris épineuse est un modèle de recherche émergent pour la médecine régénérative. Les progéniteurs fibro-adipogènes sont des cellules tissulaires capables de se différencier en adipocytes, fibroblastes et chondrocytes. Les progéniteurs fibro-adipogènes sont fondamentaux pour orchestrer la régénération tissulaire car ils sont responsables du remodelage de la matrice extracellulaire après une blessure. Cette étude se concentre sur l’étude du rôle spécifique des progéniteurs fibro-adipogènes dans la réparation cardiaque et la régénération des muscles squelettiques de souris épineuses. À cette fin, un protocole a été optimisé pour la purification des progéniteurs fibro-adipogènes de souris épineuses par cytométrie en flux à partir de muscles squelettiques et cardiaques dissociés enzymatiquement. La population obtenue à partir de ce protocole est capable de s’étendre in vitro, et peut être différenciée en myofibroblastes et adipocytes. Ce protocole offre aux chercheurs un outil précieux pour examiner les propriétés distinctives de la souris épineuse et les comparer à la musculus musculus. Cela fournira des informations qui pourraient faire progresser la compréhension des mécanismes de régénération dans ce modèle intrigant.
Initialement reconnue pour sa peau exceptionnellement fragile et sa remarquable capacité à réparer les lésions cutanées, la souris épineuse a démontré une capacité de régénération supérieure dans divers systèmes organiques, tels que l’appareil locomoteur, le rein, le système nerveux central et cardiovasculaire, par rapport au Mus musculus 1,2.
Les progéniteurs fibro-adipogènes (PAF) sont un sous-ensemble de cellules stromales qui résident dans divers tissus, y compris le muscle squelettique et cardiaque. Ces cellules possèdent une capacité unique à s’engager dans des lignées fibrogènes et adipogéniques in vivo et in vitro 3,4. Les FAP jouent un rôle crucial dans la régénération tissulaire en modulant la matrice extracellulaire et en soutenant les fonctions d’autres types de cellules impliquées dans le processus de réparation. Dans les muscles squelettiques, les PAF s’activent en réponse à une blessure et facilitent la différenciation des cellules souches musculaires et la myogenèse 5,6. Dans les lésions ischémiques du cœur, les FAP déposent du tissu cicatriciel pour maintenir l’intégrité du myocarde. Contrairement au muscle, les PAF cardiaques s’activent de manière chronique et contribuent au remodelage pathologique 7,8.
Des études antérieures ont démontré que la matrice extracellulaire de la souris épineuse a une composition, une structure et des propriétés différentes qui favorisent la régénération par rapport à Mus musculus 9,10. Dans les lésions musculaires et cardiaques, il a été noté que les PAF contribuent à une guérison supérieure chez la souris épineuse 11,12,13. Comprendre le comportement et le contrôle réglementaire des FAP et du stroma de souris épineuses pourrait faire la lumière sur le mécanisme à l’origine de leurs capacités de régénération. Bien que les PAF soient largement étudiés dans d’autres modèles animaux, comme chez le mus musculus14,15, il n’existe actuellement aucun protocole publié pour isoler les PAF de souris épineuses. Le développement d’un tel protocole comblerait une lacune importante dans le domaine et permettrait aux chercheurs d’examiner les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents au potentiel de régénération de la souris épineuse.
Ce protocole décrit un protocole robuste et reproductible pour isoler, étendre et différencier les PAF des muscles squelettiques et cardiaques de la souris épineuse. Le protocole décrit ici permet d’obtenir des suspensions unicellulaires de haute qualité qui conviennent au tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). En utilisant rh-TGFβ1 ou un milieu compatible disponible dans le commerce, deux méthodes largement utilisées pour différencier les FAP mus musculus 16, les FAP épineux triés conservent leur capacité à se différencier le long de la lignée fibrogène et de la lignée adipogénique, respectivement (Figure 1).
Les tissus épineux de la souris sont plus sensibles aux stress de la dissociation des tissus, et plusieurs aspects de ce protocole visent à minimiser le stress pour améliorer la viabilité cellulaire. La technique de dissociation enzymatique en série est utilisée pour la préparation des échantillons afin d’abaisser la concentration de l’enzyme requise. Au fur et à mesure que la digestion enzymatique se poursuit, l’activité enzymatique diminue. En le remplaçant par des enz…
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier Andy Johnson et Justin Wong, de l’équipe de base de l’UBC, pour leur expertise et leur aide à l’optimisation du protocole FACS, ainsi que le personnel de l’animalerie du Centre de recherche biomédicale de l’UBC pour les soins aux souris épineuses. La figure 1 a été réalisée à l’aide de Biorender. La figure 2 a été réalisée à l’aide du logiciel FlowJo.
0.5M EDTA | Invitrogen | 15575–038 | |
1.7 mL Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
20 mL syringe | BD | 309661 | |
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
48 well flat-bottom tissue culture plate | Falcon | 53078 | |
5 mL polypropylene | Falcon | 352063 | |
5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
5 mL syringe | BD | 309646 | |
50 mL centrifuge tube | Falcon | 352070 | |
60 mm Petri dish | Falcon | 353002 | |
96 well V-bottom tissue culture plate | Corning | 3894 | |
Acomys dimidiatus mice (spiny mice) | kindly gifted by Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky). | ||
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
Anti-perilipin (1:100) | Sigma | P1873 | |
Anti-SMA (1:100) | Invitrogen | 14-9760-82 | |
APC PDGFRa (1:800) | Abcam | ab270085 | |
BD PrecisionGlide Needle 18 G | BD | 305195 | |
BD PrecisionGlide Needle 23 G | BD | 305145 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A7906-100g | |
BV605 CD31 (1:500) | BD biosciences | 744359 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
Donkey anti-mouse Alexa 555 (1:1000) | Invitrogen | A31570 | |
Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1:1000) | Invitrogen | A31573 | |
Donkey serum | Sigma | S30-100ML | |
FACS sorter – MoFlo Astrios 5 lasers | Beckman coulter | B52102 | |
Fetal bovine serum | Gemini | 100-500 | |
Fine scissors | FST | 14058-11 | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
Forceps | FST | 11051-10 | |
Hemostat | FST | 91308-12 | |
human FGF-basic recombinant protein (bFGF) | Gibco | 13256029 | |
Human TGF beta 1 recombinant protein (TGFb1) | eBiosciences | 14-8348-62 | |
Incubator – Heracell 160i CO2 | ThermoFisher | 51033557 | |
Inverted microscope – Revolve | ECHO | n/a | |
Liberase | Roche | 5401127001 | |
Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x Supplement | STEMCELL technologies | 5507 | |
Mouse on mouse (MOM) blocking reagent | Vector Laboratories | MKB-2213 | |
Paraformaldehyde | Sigma | P1648-500g | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140–122 | |
PicoLab Mouse Diet 20 | LabDiet | 3005750-220 | |
Propidium iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
Transport vial 5mL tube | Caplugs Evergreen | 222-3005-080 | |
Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 |