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Neurosciences

脊髄損傷における細胞移植を検証するためのプラットフォームとしての長期マウス脊髄器官型スライス培養

Published: April 12, 2024
doi:
10.3791/66704
, , ,
1Department of Biology,University of Pisa

Summary

この論文では、神経幹細胞を移植した脊髄器官型スライスを長期間生成および維持するための再現性のある方法を提供し、細胞置換療法をテストするための ex vivo モデルとして提供します。

Abstract

脊髄損傷(SCI)の解決策は、複雑な病態生理学のためにまだ不足しています。最も有望な再生アプローチの1つは、失われた組織を置き換え、機能回復を促進するための幹細胞移植に基づいています。このアプローチは、より高価で時間のかかる動物試験を進める前に、安全性と有効性のために in vitro および ex vivo でさらに検討する必要があります。この研究では、マウス脊髄(SC)器官型スライスにヒト神経幹細胞を移植して、SCIの細胞補充療法をテストするための長期プラットフォームの確立を示します。

標準的なSC器官型培養物は、 in vitroで約2〜3週間維持されます。ここでは、最大90日間の長期メンテナンス(≥30日間)に最適化されたプロトコルについて説明します。SCスライスの長期培養に用いた培地は、神経幹細胞を器官型モデルに移植するためにも最適化されました。緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーターを有するヒトSC由来神経上皮幹(h-SC-NES)細胞をマウスSCスライスに移植した。移植から30日経っても、細胞は依然としてGFP発現を示し、アポトーシス率は低いことから、最適化された環境が細胞の生存と組織内での統合を維持していたことが示唆されています。このプロトコールは、SC組織における細胞補充療法を効率的に試験するための堅牢なリファレンスです。このプラットフォームにより、研究者はさまざまな細胞移植療法の ex vivo 事前スクリーニングを行うことができ、 in vivo 実験を進める前に最も適切な戦略を選択するのに役立ちます。

Introduction

外傷性脊髄損傷 (SCI) は、患者と介護者に壊滅的な身体的、心理的、経済的影響を及ぼします1.SCIにおける軸索再生を促進するために、さまざまなアプローチで多くの試みが行われてきました2,3,4そして、細胞補充療法を通じて損傷部位の近位ニューロンと遠位ニューロンの間にニューロンリレーが形成されることによって、いくつかの有益な効果が実証されました。移植された細胞は、栄養サポート、免疫調節、可塑性の誘導による失われた神経回路の再生、細胞置換、軸索再髄鞘形成6など、多くの役割を果たすことができるため、細胞治療への関心は依然として高まっています5。

最近、この分野での主な取り組みは、ヒト神経幹細胞/前駆細胞(NSC/NPC)に焦点を当てています7。いくつかの研究は、NSC/NPCがアストロサイトの応答を調節し8、再生促進因子9,10の分泌を促進し、SCI11,12で欠落しているニューロン細胞を置き換えることを示唆しています。しかし、移植された細胞が機能的なニューロンに分化することを裏付ける研究はまだ不十分です。さらに、損傷した脊髄(SC)での移植細胞の生存率と分化率は低く、おそらく移植された細胞が生体内で分化するのに数週間、場合によっては数か月かかるためである。さらに、現在の研究では、細胞補充療法の多くの生化学的、分子的、細胞的、および機能的側面が完全に解明されていません。このような状況では、細胞生着のメカニズム、つまり生着した細胞が増殖し、特定のタイプまたは細胞の亜集団に分化し、常在ニューロンとシナプスを形成する能力を研究するために、シンプルで高速かつ費用対効果の高いモデルが必要です。

組織学的研究を電気生理学的記録とトランスクリプトームおよびプロテオームプロファイリングに統合することは、細胞移植後に発生する分子カスケードを完全に理解するために必要です。これにより、前臨床モデルや臨床研究における新しい細胞置換療法の設計と検証が確実にスピードアップします。実際、今日まで、げっ歯類、大型動物、およびヒト以外の霊長類の使用は、移植後の多くの細胞プロセスを解明する上で価値があった14。しかし、高コスト、高い倫理的影響、および生物の複雑さのために、それらの使用はしばしば一筋縄ではいかず、生化学的および分子的プロセスを解明するのに適切ではありません。さらに、それらは、種間(代謝)と種内変動(性別、年齢)の両方である生物学的差異と相関する多くの欠点を提示する可能性があります。 これらの要因は、ストレスの多い状況などの外的要因とともに、実験の結果と、ヒトへの治療的翻訳の観点からのそれらの予測可能性を変える可能性がある15,16,17。

そのため、多くのグループでは、動物モデルに加えて、2D in vitro細胞培養やex vivo器官型スライス(ex vivo培養)を採用しています。2D細胞培養は、単一細胞および/または細胞集団レベルで特定の生物学的プロセスを研究するために最も一般的に使用されるシステムです。それにもかかわらず、単層細胞培養は、生物全体に見られる複雑さを反映していません。組織構造および生理学的環境の欠如は、2D培養システムが調査対象の組織18,19,20の主要な構造的、形態学的、および機能的側面を完全にエミュレートすることを可能にしない。器官型培養は、これらの問題のいくつかを克服することができます。器官型モデルは、組織または器官の断片を移植し、それを限られた期間21,22 ex vivoで維持することに基づいています。特に、外植された組織のスライスは、栄養素がスライス内のほぼすべての細胞に容易に到達できるように、正確な厚さで生成されます。それらは、海馬、視床下部、小脳、視床、大脳皮質、黒質および線条体、ならびに脊髄23のような中枢神経系の様々な領域から生成することができる。器官型培養は、起源の器官の組織構造、細胞の空間分布、細胞の多様性、および環境(すなわち、細胞外マトリックス組成)を保持します。さらに、それらは元の神経活動、細胞間の接続、特に外植片後の短距離回路を保持します。

これらの側面は、単層培養と動物モデルの両方に関して、ex vivo培養にいくつかの利点を提供します。それらは、生体内で見られる主要な組織の特徴を保持していますが、コストを削減し、培養環境パラメータ24,25,26,27,28,29の正確な制御により、さまざまな種類の分子、細胞、および機能実験を実行する可能性があります.器官型スライスは、特定の疾患の主要な組織病理学的特徴に類似させることにより、さまざまな神経障害のモデルを開発するためにも利用することができる30。さらに、元の多細胞組織環境が保持されているため、薬物スクリーニングや神経保護分子および神経再生分子および材料の試験に適したプラットフォームになります。

この研究では、NSC移植を最適化するためのモデルとして、SC器官型培養の使用を提案します。宿主(SC組織)と移植(NSC)の両方の生存を数週間保証するには、最適な培養条件が必要であるため、これは簡単なことではありません。器官型培養、脳由来およびSC由来の様々な種類の細胞に移植された異なる研究グループ。ほとんどの研究は、間葉系幹細胞31,32,33、嗅覚被覆細胞34、またはNSCs35,36,37,38,39,40の移植を示し、生着細胞と宿主細胞との相互作用、システム全体の生存、および移植された細胞がニューロンまたはニューロン様細胞に分化するかどうかを評価しましたex vivo組織環境32,33,41の内部。彼らの一部は、移植後の細胞の再生能を評価し、組織37,40,41内の軸索成長を観察し、オリゴデンドロサイトの生着前駆体の髄鞘形成能力42、生着した細胞の宿主組織43への移動、および移植された細胞が再生促進環境31に向けて推進する因子を放出したかどうかを観察した.現在の研究の1つの制限は、彼らが長期間にわたって生着を調査していないことです。

NSCがin vivoで分化するのに数週間かかると思われることを考慮する 44,45、この研究では、マウスSCスライスを最大90日間、長期間(≥30日間)生成および維持する方法に焦点を当てています。スライスは、元の解剖学的構造を保持し、長期にわたって低く安定したアポトーシス率と高い細胞生存率を維持することがわかった。神経細胞マーカーであるRNA binding fox-1 homolog 3(RBFOX3)とニューロフィラメント軽鎖(NFL)のびまん性発現が観察され、後者は時間の経過とともにスライスの周囲に軸索の発芽が増加する傾向を示し、それらの健康状態を証明しています。さらに、神経細胞の分化初期段階において、GFP発現ヒトSC由来神経上皮幹細胞(h-SC-NES)をSCスライスに移植することに成功しました。NSC移植片は移植後30日間維持され、細胞は培養中の全期間にわたってGFP発現を示しました。移植後日(DPT)30における細胞のアポトーシス速度も、同じ細胞40のDPT7で観察されたアポトーシス速度値に関して一致していることがわかった。 細胞は組織環境に生着したようで、数週間まで生存しました。

要約すると、私たちのデータは、SC器官型スライスを元の細胞構造と組織環境を損なうことなく、培養中に3か月間維持することが可能であることを示しています。最も重要なことは、 in vivo 実験を進める前に細胞治療の試験に活用できるため、コストと実験時間を短縮できることです。ここでは、マウスSC器官型スライスを生成するためのすべてのパッセージと、それらを長期間(≥30日間)維持する方法を詳細に説明します。また、スライスへのNPC移植の方法や、ダウンストリーム解析のための維持方法についても深く解説します。

Protocol

動物の処置は、指令2010/63/EU(プロジェクトライセンス番号39E1C)に準拠して、イタリア公衆衛生省とピサ大学の地元の倫理委員会によって承認されたプロトコルに厳密に準拠して行われました。N.5Q7 2021年10月30日発売)。C57BL/6Jマウスは、調節された環境(23±1°C、湿度50±5%)に保たれ、餌 と水を自由に摂取して12時間の明暗サイクルを行いました。 h-SC-NES細胞に関連するすべての研究は、生物医学研究目的でのヒト組織の取得と配布に関するNIHガイドラインに従って、サンプルが得られた各研究所のヒト調査委員会および機関倫理委員会の承認を得て行われました。ピサ大学の生命倫理委員会から最終承認を得ました(レビューNo.29/2020)。匿名化されたヒト標本は、Joint MRC/Wellcome Trust助成金(099175/Z/12/Z)、Human Developmental Biology Resource(www.hdbr.org)によって提供されました。適切なインフォームドコンセントが得られ、利用可能なすべての非識別情報が各検体について記録されました。組織は、NIH(http://bioethics.od.nih.gov/humantissue.html)およびWMAヘルシンキ宣言(http://www.wma.net/en/30publications/10policies/b3/index.html)で定められたヒト脳組織の研究使用に関する倫理ガイドラインおよび規制に従って取り扱われました。 1. 脊髄(SC)の分離と培養のための溶液と装置の準備 メンブレンインサート用コーティング液コーティング液(表1)を調製します:0.1 mg mL-1コラーゲン、0.01 mg mL-1ポリ-L-リジン、および0.01 mg mL-1ラミニンを含む水溶液。 各メンブレンインサートを35 mmディッシュまたは6ウェルプレートに入れます。 メンブレンの上部に1mLのコーティング溶液を加えます:溶液を室温(RT)で4時間インキュベートします。次に、それを取り外し、メンブレンインサートを一晩乾かします(ON)。メンブレンインサートは、使用するまで4°Cで保管してください。注:すべての通路は無菌状態で行う必要があります。メンブレンコーティングは、タンパク質の分解やメンブレンへの最適でないスライス接着を避けるために、使用前に4°Cで最大1週間保存する必要があります。 培地調製:器官型培地、解剖培地、グラフト培地器官型培地を調製します(OM、 表1)。 表1の説明に従って解剖培地を準備します。 グラフト培地(GM、Onorati et al.46、 Table 1から最適化)を調製します。注:溶液は、滅菌状態で、使用直前(実験の1日前または同日)に調製する必要があります。 手術のための材料準備バイオセーフティキャビネットには、解剖実体顕微鏡と手術器具(マイクロハサミ2組、ストレートピンセット2組、湾曲ピンセット2組)が備わっています。 バイオセーフティキャビネットには、SCをスライスするためのブレードを装備してチョッパー機器を準備します。チョッパーのネジを回転させて、ブレードを配置する必要がある金属アームを持ち上げます。ブレードを所定の場所に置き、金属製のアームをブレードでカッティングデッキに接触するまで下げ、ブレードがしっかりと固定されるまで六角レンチで固定ネジを締めて固定します。マイクロメトリックスクリューを希望のスライス厚さ(通常は350μm)まで回転させます。ブレードがカッティングデッキに対して正確に垂直に配置されているかどうかを確認します。注意: 正しく切断を行うには、切断甲板に対してブレードを正確に垂直に配置する必要があります。 バイオセーフティキャビネットで準備します:プラスチック製パスツールピペット2本(分離されたSCとスライスを移動するために必要)、少なくとも4つの35mmと2つの60mm皿、および新鮮な氷の箱。 すべての装置を使用直前に70%エタノールとUV(20分×1サイクル)で滅菌し、培養の無菌性を維持します。 2. マウスSCの分離とスライス生成 マウスSCの分離プロジェクトライセンスに従って、出生後3日目(P3)のマウスの子を犠牲にします。 マイクロハサミによる正中線開腹術により、背骨の腰部をマウス本体の残りの部分から分離し、35mmの皿の中の冷解剖培地に入れます。 解剖実体顕微鏡とマイクロハサミを使用して、矢状軸に沿って背骨を切断し、ストレートピンセットを使用してSCを背骨腔から静かに除去します。 ストレートピンセットを使用して、SCの孤立した腰部から髄膜を慎重に剥がします。 単離されたSC腰部を冷たく新鮮な解剖培地に移し、10〜15分間インキュベートしてから、次のステップに進みます。 スライスの生成プラスチック製パスツールピペットを1本使用して、解剖媒体から分離されたSC腰部を取り出し、チョッパー機器のカッティングデッキにブレードに対して垂直に置きます。注意: SCスライスを適切に生成するには、ブレード(垂直)に対するSCの正しい配置が不可欠です。 パスツールピペットと滅菌吸収紙の助けを借りて、SCの周りのデッキに残っている解剖媒体を取り除きます。SC自動切片化に進みます。 スライスが生成されたら、パスツールピペットで新鮮な解剖液をスライスのあるカッティングデッキに置きます。次に、スライスを新鮮な解剖培地で35mmの皿に集め、15分間インキュベートします。 スライスインキュベーション中に、プラスチック製のパスツールピペットを使用して、メンブレンインサートの表面をOMで3回洗浄します。次に、各メンブレンインサートの底に1 mLのOMを残します。 解剖実体顕微鏡でスライスを確認します。コンディショニングされたメンブレンインサートに必要な数のスライスを、プラスチック製のパスツールピペットで移し替えて播種します。 ストレートピンセットを使用して、スライスをメンブレンインサート上の好ましい方向と目的の位置に移動します。パスツールピペットで余分な培地を取り除き、スライスがメンブレン表面に密着するようにします。注意: ストレートピンセットでスライスを動かして向きを変えることは、組織やメンブレンインサートの損傷を避けるために穏やかに行う必要があります。 37°Cで30分間インキュベートした後、インサートを新しいシャーレに移します。注意: 媒体交換中は、プラスチックリングには触れますが、メンブレンには触れないでください。 グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)100 ug mL-1を添加した新鮮なOM1 mLをメンブレンインサートの底部に加えます。 スライスを37°Cでインキュベートします。 培養の最初の日を ex vivo (DEV) 0 の日と呼んでください。 3. 器官型スライスの長期培養 スライスを37°Cで培養し、希望の時点まで維持します。 手順 2.2.7 から 2.2.8 の説明に従って、DEV 1 でメディアを新しい OM と交換します。 DEV 3では、培地をGMに切り替えて、翌日の幹細胞移植に適した環境を作り出します。48時間ごとに培地を新しいGMと交換します(例:DEV 5、DEV 7…)。 新鮮なGDNF(最終濃度100 μg mL-1)をDEV 7まで毎日培地に加えます。DEV 7以降は、メディアを変更した場合にのみ追加します(ステップ3.3)。 4. h-SC-NES細胞培養 注:h-SC-NES細胞は、成長因子の存在下で培養中に維持されます(NES培地、ステップ4.1.1)。移植前に、培地から成長因子を除去し、細胞を分化前状態で7日間播種します(分化前培地:線維芽細胞増殖因子2(FGF-2)および上皮成長因子(EGF)を含まないNES培地、ステップ4.1.2)。その後、細胞を分化状態(分化培地、ステップ4.1.3)で移植前の2日間プレーティングします。分化は、分化培地に神経栄養補助食品(脳由来神経栄養因子、BDNF)を追加することでサポートされます。h−SC−NES細胞12,46の維持、分裂、前分化、および分化については、以下で詳細に説明される。 培地調製:NES、分化前および分化培地h-SC-NES細胞維持培地(NES培地、 表1)を調製します。 h-SC-NES細胞分化前培地を調製する(Pre-differentiation medium, Table 1)。 h-SC-NES細胞分化培地(分化培地、 表1)を調製します。培地を交換したとき、または分化状態で初めて細胞をプレーティングするときに、BDNFを新たに添加してください。注:すべての培地は無菌状態で調製し、0.22 μmフィルターでろ過する必要があります。 h-SC-NES細胞用コーティング液注:h-SC-NES細胞は、POLFNコーティングされた培養支持体(POLFN = Poly-L-Ornithine、Laminin、Fibronectin)で維持されます。コーティング溶液をチューブで調製します:ラミニン(5 μg mL-1)およびフィブロネクチン(1 μg mL-1)を含むポリ-L-オルニチン溶液。 調製したコーティング溶液を細胞培養支持体に移し、細胞培養支持体の表面全体を覆うのに十分な量を添加するように注意します。コーティングを37°Cで1時間、または4°Cで一晩インキュベートします。 細胞培養サポートからコーティング溶液を取り出します。注:POLFN溶液はさらに2回リサイクルできますが、ラミニンとフィブロネクチンは毎回新たに追加する必要があります。 コーティングを細胞培養グレードの滅菌水で3回洗浄します。コーティングは4°Cで保管するか、使用してください。注:コーティングは1週間以内に使用する必要があります。その後、コーティングは、追加されたタンパク質の分解プロセスのために期限切れと見なされます。 h-SC-NESセルのメンテナンスh-SC-NES細胞をNES培地で培養します。細胞を顕微鏡で毎日チェックし、細胞が合流点に到達するタイミングを監視します。 2日ごとに半分の培地を交換します:調整された培地の半分を取り出し、新しいものを追加します(蒸発率20%を考慮してください)。 細胞がコンフルエンスに達した場合は、ステップ4.4で説明したように分割を続行します。 h-SC-NES細胞継代注:セルは次のように分割されます12。馴化培地を取り出し、Ca2+/Mg2+を含まないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で細胞を一度洗浄します。 DPBSを取り外し、トリプシン/ EDTA溶液を細胞に添加して酵素剥離を行います。細胞を37°Cで30秒から1分間インキュベートします。 インキュベーション後、顕微鏡下で細胞を確認します:細胞が剥離していない場合は、細胞培養支持体をわずかにたたいて機械的剥離を行い、さらに37°Cで30秒間インキュベートします。 インキュベーション後、細胞とトリプシン/EDTAを用いた細胞培養支持体に4容量のDPBS/ウシ胎児血清(FBS)(10%vol/vol)溶液を加えて、トリプシン/EDTAを不活性化します。細胞培養支持体表面上の溶液を上下に静かにピペットで動かし、すべての細胞が剥離するのを助けます。細胞懸濁液をチューブに集めます。 細胞懸濁液を200 × g で3分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを新しいNES培地に再懸濁します。 細胞をカウントし、新しいPOLFNコーティングされた各培養支持体に、0.5-1 × 105 細胞/cm2の密度でプレートします。 Y-27632(10μM)を添加し、細胞を37°Cに置きます。 合流するまで毎日チェックし、その後、メンテナンス/拡張またはセルバンキングのために再度分割します。 h-SC-NES細胞の分化前ステップ 4.4 の説明に従ってセルを分割します。 POLFNコーティングされた細胞培養物上の細胞を、分化前培地で0.5-1 × 105 細胞/ cm2の密度でプレート化します。 分割後にY-27632(10μM)を添加します。分化前日の最初の日を in vitro (DIV)0と呼びます。 2〜3日ごとに媒体の半分を交換します(ステップ4.3.2を参照)。 DIV 7まで細胞を分化前状態に保ち、その後ステップ4.6に進みます。 h-SC-NES細胞分化分化前のDIV 7で、ステップ4.4で説明したように細胞を分割します。 POLFNコーティングされた細胞培養サポートに細胞を1-1.5×105細胞/cm2の密度で分化培地でプレート化します。 分割後、Y-27632(10 μM)とBDNF(30 ng mL-1)を添加します。 2日間の分化(DIV 10)後、移植用の細胞をスライスに分割します。 5. GFP担持レンチウイルスベクターによるh-SC-NES細胞形質導入 注:細胞形質導入は、h-SC-NES細胞の維持期に行われます。細胞が正しく形質導入されると、これらを拡大でき、前述の分化前および分化プロトコルが適用されます(ステップ4.5および4.6)。 細胞形質導入培地の調製注:細胞形質導入培地は、特定の容量のNES培地と正確な量のレンチウイルスベクターストック(LVS)調製物を、異なるパラメータに従って混合することによって調製されます:所望のMOI(感染の多重度=特定の感染培地中の宿主細胞の数に対するウイルス粒子の数の比)。めっきされたセルの数。LVS調製物(= LVS PFU、プラーク形成ユニット)の初期濃度。使用した培養容器の表面積。NES培地に添加するLVS調製物の正しい量を、選択したMOIに従って、式(1)および(2)を使用して計算します。(n 個の細胞をプレートへ/cm2) × cm2 の細胞培養サポート × MOI = LVS PFU を選択した MOI (1)LVS PFU : 初期LVSボリューム(μL) = MOI用LVS PFU : 中程度に追加するLVSボリューム(μL)(2)注:LVS PFU(LVSの初期PFU)と初期LVSの合計容量は、メーカーによって提供されます。選択した MOI の LVS PFU は、式 (1) で説明したように計算されます。したがって、式(2)に示すように、選択したMOIについて、NES培地の総量(細胞培養サポートに基づく)に添加する必要があるLVS調製物の量を得ることができます。例:以前のラボ経験に基づいて、MOI 3を使用しました(MOIは、使用する細胞株とウイルス調製物によって異なる場合があります)。所望のMOIが3、プレーティングする細胞数が0.5 ×10 5/cm2、培養担体が1ウェルMW24(2 cm2)の場合、初期LVS PFU/TU(プラーク形成ユニット/形質導入ユニット)が1 mL(1,000 μL = 初期LVSボリューム)中の25 × 106 PFUであると仮定すると、計算は次のようになります。1ウェルに播種した細胞-MW24(2cm2)=0.5×10個5個×2cm2=1個×10個5個1 × 105 セル × 3 (MOI) = 3 × 105 PFU = MOI 3 の LVS PFU25 × 106 PFU:1,000 μL = 3 × 105 PFU:x μLx μL = 12 μL = 培地に追加するLVS容量したがって、MOI 3 in 1ウェル-MW24の 細胞形質導入培地 で細胞を形質導入するには、MW24の1ウェル用に調製した NES培地 (238μL)に12μLの初期LVS調製物を加えます。最終的な総容量は250μLです。注:培地は通常、形質導入の日に無菌条件下で新たに調製されます。 h-SC-NES形質導入プロトコールNES培地で0.5 × 105/cm2 の密度で、POLFNコーティングされた24-マルチウェルプレート(または他の培養支持体)上の低通路でh-SC-NES細胞をプレート化します。 翌日、細胞を播種したウェルからコンディショニングされたNES培地を回収します。選択した培養担体に応じて、播種表面を均一に覆うために必要な最小量の新鮮細胞形質導入培地を細胞に加えます(例:24マルチウェルプレートの250 μL/ウェル)。 次に、h-SC-NES細胞を37°Cで6時間インキュベートします。 その後、以前に収集した馴染培地(24マルチウェルプレートの200 μL/ウェル)を細胞に加え、細胞を37°CでONにインキュベートします。 翌日、h-SC-NES細胞をDPBSで一度洗浄し、全培地交換(NES培地)を行います。 翌日、蛍光顕微鏡で細胞を観察し、GFPの発現を観察します。 h-SC-NES細胞をセルバンキングおよび移植用に拡張します。 6. SCスライスへの細胞移植と共培養 ガラスマイクロニードルの調製プーラーを使用して、ホウケイ酸ガラスキャピラリーから細い針を取得します。プーラーを次のように設定します: HEAT 990、PULL350。注:1つのキャピラリーから、2本の細い針を得ることができます。 移植のための細胞調製ステップ 4.4 の説明に従ってセルを分割します。注:細胞が蛍光レポーターを発現しない場合は、細胞追跡色素で標識し、移植後および長期培養中に蛍光顕微鏡を使用して細胞をモニターします。選択したメーカーのプロトコルに従って、ラベリング手順を実行します。 分割後の細胞をカウントし、200 × g で3分間遠心分離します。得られたペレットを新鮮な培地+ Y-27632(10μM)で懸濁して、所望の細胞濃度(通常、30,000〜50,000細胞μL-1の範囲)にします。 細胞懸濁液を500 μLまたは1.5 mLのチューブに移し、氷上に置きます。細胞は移植の準備ができています。 器官型スライスへの細胞移植注:h-SC-NES細胞をマウスSC器官型スライスに移植するには、エアマイクロインジェクターとガラスマイクロニードルを使用します。マイクロピペットとマイクロローダーチップを使用して、ガラス製マイクロニードルに4 μLの細胞懸濁液をロードします。注:針に気泡が形成されると、マイクロインジェクションプロセスが妨げられる可能性があるため、避けてください。気泡が発生した場合は、マイクロピペットで気泡を取り除いてください。 針をマイクロインジェクターの割り当てられたサポートに置き、ストレートピンセットを使用して針の先端を壊します。注意: 大きな穴の形成を避けるために、ガラス針を先端に近づけて折ってください。 スライスに移植する前に、マイクロインジェクションパラメータを設定します。 圧力 を 10psiに設定します。注:圧力値は、マイクロインジェクターとオペレーターの観察に基づいて変更することができます:圧力は細胞懸濁液をマイクロインジェクションするのに十分であり、組織の損傷を避ける必要があります。 較正されたスライドガラス上に、パスツールピペットで鉱油を一滴入れ、細胞懸濁液を液滴にマイクロインジェクションします。油滴中で得られた細胞懸濁液の球の直径は、特定のマイクロインジェクションボリュームと相関しています。必要に応じてマイクロインジェクションパラメータを変更して、4nLを注入するための細胞懸濁球の直径を0.2mmにします。 正しい容量を設定した後、細胞懸濁液をスライスに迅速にマイクロインジェクションします。蛍光実体顕微鏡でスライス中の細胞の存在を確認し、マイクロインジェクション/移植が成功したことを確認します。注:細胞懸濁液が針を詰まらせることがあります:この場合は、注入パラメータを変更して細胞懸濁液の詰まりを取り除くか、新しい針に新鮮な細胞懸濁液をロードしてみてください。 移植後、スライスを37°Cおよび5%CO2に所望の時点まで置き、ステップ2.2.7-2.2.8で説明されているように、隔日で培地交換を行います。 7. 免疫蛍光染色 1日目インサートメンブレンの底から培地を取り出し、予熱したDPBSでスライスを3回洗浄します。 予熱した4%ホルムアルデヒド(FA)でスライスを固定します:DPBSを取り外し、スライスと一緒にメンブレンインサートの底に1.5mLの4を追加します。室温で15分間インキュベートした後、メンブレンインサートの上面にさらに1 mLの4% FAを添加し、室温で15分間インキュベートします。 4を取り出し、DPBSで10分×3回洗浄します。 インサートの膜をサージカルナイフで円周方向に切断し、インサートのプラスチック成分からスライスで膜を分離し、免疫蛍光ステップに進みます。注:このステップの後、スライスされたメンブレンは皿のDPBSに浮かんでいます。 0.7% Triton 含有溶液 1 mL/メンブレンを DPBS 中で 10 分間 RT で透過処理します。 透過処理溶液を取り出し、0.5% Triton、10% FBS溶液のDPBSからなるブロッキング溶液1 mL/メンブレンを用いて、サンプルを4°Cで4時間インキュベートします。 ブロッキング溶液を除去し、スライスに一次抗体をその使用希釈率で追加します。例:マウス抗ニューロフィラメント(NFL)抗体、1:500;ウサギの反NFL、1:500;ウサギ抗RBFOX3(NeuN)抗体、1:400;ウサギ抗活性カスパーゼ-3(aCASP3)、1:400;マウス反ヒト核、(Hu-Nu)、1:400;ウサギの抗Hu-Nu、1:400;マウス抗GFP、0.5%トリトン、DPBS中の1Sからなる抗体溶液1mLに1:400(表1で報告)。4°CでONインキュベートします。 2日目メンブレンを1〜2mLのDPBSで10分×3回洗浄します。 メンブレンを二次抗体(例:ヤギ抗マウスIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor 488、1:500;ヤギ抗ウサギIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor 568、1:500;ヤギ抗マウスIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor 647、1:500;ヤギ抗ウサギIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor 647、1:500、報告された表1)および核のHoechst/DAPIを1 mL/メンブレンの抗体溶液(Triton 0.5% + FBS 1% in DPBS)でRTで3時間希釈しました。注:インキュベーション中および次のステップで二次抗体が漂白しないように、サンプルを光から慎重に保護してください。 抗体溶液を取り出し、DPBS(1〜2mL)で3×10分間洗浄します。 DPBSを新しいDPBSと交換し、光保護条件下で4°Cで保存します。 免疫蛍光プロトコルの最後に、スライドガラスにメンブレンを取り付けます。スライドガラスに200μLの埋込液を一滴垂らします。ストレートピンセットを使用して、フローティングメンブレンを35mmディッシュからカバースリップに移し、次に、メンブレンを取り付けソリューションでスライドガラスに移します。 新しいカバースリップに100μLの封入液を一滴垂らし、メンブレンを覆ってスライドガラスに固定します。光から保護された状態で、化学薬品フードの下で一晩乾燥させます。 サンプルは4°Cの暗所で保存するか、イメージング分析を行います。 8. Live/Deadアッセイ 新鮮な培地の皿あたり700 μLを分注して作業溶液を調製し、Sytox(例:成分B、1:2,000)とCalcein AM(例:成分A、1:2,000)を正しい使用希釈液で添加します。注:試薬は光に敏感であるため、作業溶液を光から保護します。 メンブレンの底部にある培地容量を評価し、ステップ8.1で説明したのと同じ希釈液でSytoxとCalcein AMを加えます。 ステップ8.1で調製した作業溶液の各スライスの上部に、それぞれ30μLを2滴加えます。注意: 暗い状態に置いて、皿を光から保護してください。 スライスをRTで30分間インキュベートします。 インキュベーション後、外科用ナイフでインサートからメンブレンを円周方向に切り取ります:その後、スライスを含むメンブレンは作業溶液中に浮かびます。 埋込用溶液を含まず、ストレートピンセットを使用してカバースリップに逆さまにメンブレンを置き、メンブレンの上に100μLのDPBSを加えて水和を保ちます。 共焦点顕微鏡を使用して、できるだけ早くライブ画像を取得します。注:画像取得中は、メンブレンの乾燥を防ぐために、30分ごとにメンブレンの上部に各40μLのDPBSを2滴追加します。 9. イメージング 固定サンプルの共焦点イメージング定性分析を行うには、共焦点顕微鏡を使用して、大きな画像オプション(4 x 4を選択)を設定し、10 x 対物レンズを使用し、スタックなし、3,634 x 3,634ピクセルの解像度で画像を取得します。 定量分析(スライスの場合はaCASP3、Calcein、Sytox、細胞の場合はaCASP3)では、共焦点顕微鏡を使用して、20 x 対物レンズ、解像度1,024 x 1,024ピクセル、Zステップ3 μmで画像を取得します。 実体顕微鏡を用いた移植切片のライブイメージング注:実体顕微鏡を使用して、明視野モードと落射蛍光モードで画像を撮影します。明視野設定を使用して、スライスの画像を取得します(ここでは3倍ズームで1 x対物レンズを使用します)。注意: 使用する顕微鏡に応じて光を変更し、必要に応じて光ファイバーを使用してください。 蛍光設定を使用して、スライスに使用したのと同じ対物レンズとズームで移植細胞の画像を取得します(ステップ9.2.1を参照)。取得には、ゲイン1、露出200-500ミリ秒、オフセット-10のパラメータを使用します。 共焦点顕微鏡を使用したLive/Deadアッセイ後のライブイメージング共焦点顕微鏡を使用して、20倍対物レンズ、解像度1,024 x 1,024ピクセル、Zステップ3μmで画像を取得します。 10. ImageJによる画像解析 NFL、RBFOX3、DAPIエリア分析ImageJソフトウェア(https://imagej.net/software/imagej/)を開きます。 [ ファイル] | [開く] | [ファイルの選択] | [開く] をクリックして、ファイル イメージを開きます。 ポップアップウィンドウで、スタック表示 |ハイパースタックとカラーモード |既定値 (自動スケールあり)。 ツールバーで、[ 画像] |カラー |チャンネルを分割します。 分析する目的のチャンネルを選択します:NFL(軸索マーカー)の緑チャンネル、RBFOX 3(ニューロンマーカー)の赤チャンネル、DAPI(核染色)の青チャンネル。 NFL分析の場合は、次の手順に進みます:ツールバーで[画像]を選択します|調整 |しきい値 |パラメータ(暗い背景、アルゴリズム、デフォルトなど)を選択し、カーソルを値バー(下/上)に移動して、すべての神経突起領域を覆い、外接します(神経突起は暗い背景で白く強調表示されます) |セット |適用します。 ツールバーからトレースツールWandを選択し、それを使用してNFLがカバーする白い領域を自動的に定義します。プレス分析 |メジャー |μm2 単位の面積値。 DAPIおよびRBFOX3解析の場合は、次の手順に進みます:ツールバーで、画像|調整 |しきい値 |パラメータ(白い背景、アルゴリズム、デフォルトなど)を選択し、カーソルを値バー(下/上)に移動して、すべてのRBFOX3またはDAPI領域を覆い、囲みます。セット |適用します。 ツールバーで、[プロセス] |FFTの|バンドパスフィルター。しきい値バーを使用して、RBFOX3またはDAPIがカバーする白い領域を、それらの蛍光信号に対応して調整します。 ツールバーからトレースツールWandを選択し、それを使用してRBFOX3またはDAPIがカバーする領域を自動的に定義します。プレス分析 |メジャー |μm2 単位の面積値。 ImageJによるアポトーシスの解析ImageJソフトウェア(https://imagej.net/software/imagej/)を開きます。 [ ファイル] | [開く] | [ファイルの選択] | [開く] をクリックして、Z-stack ファイル イメージを開きます。 ポップアップウィンドウで、スタック表示 |ハイパースタックとカラーモード |既定値 (自動スケールあり)。 ツールバーで、[ 画像] |カラー |チャンネルを分割します。 aCASP3(分析するアポトーシスマーカー)の場合は赤チャネル、DAPIの場合は青またはシアン、核の場合はHu-Nuのチャネルを選択します。次に、ツールバーの画像 |カラー |チャンネルの統合 |コンポジットを作成します。 画像の下部にある Z バーをドラッグして、画像の Z スタックを参照し、スライスの中央領域で aCASP3 陽性のスタックを特定します。 ツールバーで、[ プラグイン] |アナライズ |セルカウンター。 開いたポップアップウィンドウで、[初期化]を選択して、カウント用の画像を準備します。次に、カウンターの種類 (Type 1 など) を選択し、カウントするオブジェクト (aCASP3+ セルなど) として名前を変更します。上記のように他のカウンタータイプの名前を変更して、他のオブジェクトをカウントします(たとえば、セルの総数のDAPI+またはHu-Nu+セル)。 ポップアップウィンドウで、カウントするオブジェクトに対応するカウンタータイプ(aCASP3+ セルなど)を選択し、ツールバーの ポイントツール を選択して、開いている画像内の各ポジティブな1つをクリックして、aCASP3に陽性のアポトーシス細胞の数を手動でカウントし始めます。 セルカウンターウィンドウで別のカウンタータイプを選択し、セルの総数のカウントを開始します(DAPI+ セル、スライスの場合。Hu-Nu+ 細胞、移植細胞用)。 ImageJによるLive/Deadアッセイの解析ImageJソフトウェア(https://imagej.net/software/imagej/)を開きます。 [ ファイル] | [開く] | [ファイルの選択] | [開く] をクリックして、Z-stack ファイル イメージを開きます。 ポップアップウィンドウで、スタック表示 |ハイパースタックとカラーモード |既定値 (自動スケールあり)。 ツールバーで、[ 画像] |カラー |チャンネルを分割します。 目的のチャンネルを選択します:Calcein(分析する活力マーカー)のグリーンチャンネルとSytox(デッドマーカー)のシアンチャンネル。次に、ツールバーの画像 |カラー |チャンネルの統合 |[複合データの作成] を選択します。 画像の下部にあるZバーをドラッグして、画像のZスタックを参照し、スライスの中央領域にカルセイン陽性とシトックス陽性のスタックを特定します。 ツールバーで、[ プラグイン] |アナライズ |セルカウンター。 開いたポップアップウィンドウで、[初期化]を選択して、カウント用の画像を準備します。次に、カウンタータイプ(例:タイプ1)を選択し、カウントするオブジェクト(例:Calcein+セル)として名前を変更します。別のオブジェクト(Sytox+セルなど)をカウントする必要がある場合は、上記のように他のカウンタータイプの名前を変更します。 ポップアップウィンドウで、カウントするオブジェクトに対応するカウンタータイプを選択します。次に、ツールバーの ポイントツール を選択し、開いた画像内の各正のセルをクリックして、Calcein+ セルの数を手動でカウントし始めます。 セルカウンターウィンドウで別のカウンタータイプを選択し、Calceinの説明に従ってSytox+ セルをカウントします。 11. グラフと統計分析 選択したソフトウェアを使用して、すべての統計分析とグラフのプロットを実行します。

Representative Results

記載された方法は、ステージP3のマウスからのSC器官型スライスの確立、および健康な条件で長期間培養中のそれらの維持を可能にする。さらに、スライスに細胞を移植し、最大30日間共培養するためのプロトコルを示します(図1)。まず、培養条件の最適化と、移植細胞を用いたSCスライスの長期培養に適したプロトコールを示します(図2A)。スライスは、OM内のDEV0からDEV2まで生成され、維持されるが、これはもともとSCスライス47の保守のための最適な媒体として提案されていた。しかし、血清タンパク質が存在するため、この培地は、移植された神経前駆細胞のニューロンの分化と成熟を維持するには最適ではない可能性がある。実際、DEV 3では、OMからGMへの切り替えをテストしました。これは、神経生存をサポートするNeurobasalとB27を含み、正しいニューロンの分化を阻害する血清を含まない製剤であり、代わりにグリア運命を促進します48,49。 図2Bは、DEV 3の培地をOMからGMに切り替えた場合の結果と、切り替えを受け取らなかったSCスライス(コントロールスライスをOMで培養した)と比較した結果を示しています。スライス内のNFL信号の分布をニューロンの完全性のマーカーとして使用しました(図2B、C)。DEV 7のスライスは、両方の培養条件で健康であり、その内部にニューロフィラメント(NFL、緑色)の拡散分布が示されました。DEV 10では、GMで培養されたスライスは、OMで培養されたコントロールスライスと比較して、NFL染色分布によって実証されているように、より健康的であるように思われました。また、図 2B の代表的な画像に示されているスライスの NFL+ 面積 (% NFL+ Area/DAPI+ Area) も推定しました。推定されたNFL+面積は図2Cのヒストグラムに表されており、NFL信号が両方の条件下でDEV 7のスライスに拡散的に分布していることが確認されています。しかし、DEV10では、OM培養条件ではNFL染色の推定面積が減少します。 これらのデータは、DEV 3 での GM への切り替えが、SC スライス (DEV 10) の長期培養に対して忍容性が高いことを示唆しています。次のステップとして、GMをより長い時間(DEV 30、DEV 60、DEV 90)でテストしました。図3A,Bに示すように、スライスはDEV90まで培養中において健康に保たれていた。NFL染色は、各時点でスライスに広く存在し、中央領域から出発する神経突起のスライスの周りに拡散発芽が見られました。実際、図 3A に示されているスライスの NFL+ 領域を推定し、図 3B のヒストグラムに示すように、時間の経過とともに増加しました。また、ニューロンマーカーRBFOX3に対する陽性性も観察され、スライスのニューロン分化の別の証拠を提供しました。各時点で、aCASP3に陽性の細胞の数を異なるスライスで評価することにより、アポトーシス率も確認しました(図4A、B)。解析は、プロトコルセクション10.2に記載されているように行いました。アポトーシス率(ASP3+細胞数/DAPI+細胞の総数)は、各時点(DEV 30、±60、90でそれぞれ0.85 0.52%、0.71 ± 0.27%、0.66 ± 0.45%)で非常に低く、考慮した3つの時点(p値>0.05、図4B)の間に有意差はありませんでした。これらのデータは、aCASP3に関連するアポトーシス率が時間中安定していることを示唆しており、スライス中のNFLの広範な分布(図4A)とともに、各時点でのスライスの生存を確認します。 以前のデータを裏付けるために、3つの異なる時点でのスライスの生存率を評価するために、生死アッセイも実施しました。生細胞で代謝活性のある細胞を標識するためにカルセイン(緑色染色)を使用し、細胞死を評価するためにSytox(シアン染色)を使用しました。 図4Cのヒストグラムに示されているように、代謝活性細胞の割合は、DEV 30からDEV 90±わずかに増加し(DEV 30、60、90でそれぞれ93.17 5.21%、96.43 ± 3.02%、96.33 ± 3.10%)、最後の2つの時点(DEV 30とDEV 60 p値 = 0.018;DEV 30 vs DEV 90 p値 = 0.027;DEV 60 対 DEV 90 p 値 = 0.99) です。細胞死は時間とともに減少する低水準(DEV 30±6090でそれぞれ5.21%、3.57 ± 3.02%、3.66 ± 3.10%)、DEV 30とそれ以降の時点であるDEV 60とDEV 90との間に有意差が認められました(DEV 30 vs DEV 60 p値 = 0.018;DEV 30 vs DEV 90 p値 = 0.027;DEV 60 vs DEV 90 p値 = 0.99)。これらのデータは、アポトーシス率と関連して、時間の経過に伴うスライスの生存を確認し、実施された長期培養プロトコルの有効性を裏付けています。 SCスライスの長期培養の可能性が確立されると、ニューロン分化の初期段階にh-SC-NES細胞を移植することでシステムに挑戦しました。h-SC-NES細胞は、SCI治療12に対して有望な結果を示しているため、h-SC-NES細胞を試験しました。h-SC-NES細胞のマウスSCスライスへの移植手順は、プロトコルセクション6に記載されています。SCスライスおよび移植されたh-SC-NES細胞は、DPT 30まで維持された。細胞は、 図5Aのプロトコルスキームに示されているように、分化(神経前駆体段階)のDIV 10でDEV4器官型スライスに移植された。移植した細胞を、培養中のGFPの発現について最大30日間モニターしました。 図5B は、移植されたGFP+ 細胞を有するSCスライスの異なるDPTでの代表的なライブ画像を示しています。GFPの経時的な安定発現(図5B および 図6A)は、細胞が以前に最適化された培養条件でSC組織に生き残ったことを示唆しています。また、プロトコルセクション10.2に記載されているように、移植された細胞のアポトーシス速度も確認しました。アポトーシス率(ASP3+ 細胞/Hu-Nu+ 細胞の総数)は、30DPT後に非常に低い(0.44±0.34%)ことがわかりました(図6B)。さらに、DPT 30でのアポトーシス率は、以前に報告された40と同様に、DPT 7での同じ種類の細胞で見られたものと一致していることがわかり、培養物が時間の経過とともに安定することを実証している。 図1:プロトコルのワークフロー。 実行されるプロトコルの一般的なワークフローを示す代表的なスキーム。(A)左図は、P3でマウスの仔マウスの単離されたSCからのマウスSCスライスの生成とSC器官型スライスの長期培養をまとめた図。(B)右は、GFPを発現するh-SC-NES細胞をマウスSC-organotypic slicesに移植した図。移植された細胞は、移植後30日間維持されます。略語:h-SC-NES =ヒト脊髄由来神経上皮ステム;GFP = 緑色蛍光タンパク質;DEV = 生体内の日;DPT = 移植後日;NFL =ニューロフィラメント軽鎖;RBFOX3= RNA結合fox-1ホモログ3;aCASP3 = 活性型カスパーゼ-3;SC=脊髄。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図2:長期培養条件の最適化 (A)OMおよびGM試験のプロトコルの代表的なスキーム OMは、対照群のDEV 7-10まで維持される。媒体は、処理されたスライスのDEV 3でGMに切り替えられます。次に、コントロールと比較するためにDEV 7-10に固定されます。(B)異なる条件で培養したDEV 7とDEV 10のマウスSC器官型スライスを比較した代表的な画像。スライスは、細胞骨格マーカーのニューロフィラメント(NFL、緑)のために染色されます。GMで培養したスライスにおけるNFL染色の広範な分布は、全生存率と分化を示唆しています。核はDAPIで対比染色されます。スケールバー = 500 μm. (C) 図1Bに示すスライス内のNFLがカバーする面積の推定値の代表的なヒストグラム。DEV10では、OM培養条件でNFL表面積が減少します。略語:DEV = day ex vivo;DAPI=4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;NFL = ニューロフィラメント軽鎖;OM =器官型培地;GM =グラフト媒体;SC = 脊髄。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図3:長期培養マウスSC器官型スライス (A)スライスはDEV90まで培養で維持されます。免疫蛍光アッセイにより、細胞骨格マーカーのニューロフィラメント(NFL、緑)と核神経マーカーのRBFOX3(赤)が広く分布していることが明らかになり、長期培養後の健康状態とニューロンの同一性が証明されています。注目すべきは、NFL+ の軸索は、時間の経過とともにスライスの周囲に拡散して発芽することです。核はDAPIで対比染色されます。スケールバー=500μm. (B)パネルAに示されているスライスのNFL+ 面積と時間、およびRBFOX3+ 面積の推定値の代表的なヒストグラム 。 NFL+ 神経突起面積は時間とともに増加します。略語:DEV = day ex vivo;DAPI=4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;NFL =ニューロフィラメント軽鎖;SC =脊髄;RBFOX3= RNA結合fox-1ホモログ3。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図4:経時的なSCスライスの細胞生存率の評価(A)aCASP3(赤)およびNFL(緑)について染色されたDEV60での器官型スライスの代表的な画像。スケールバー = 100 μm. NFLは拡散パターンを示します。希少細胞は、アポトーシスマーカーaCASP3に対して陽性です(挿入図:1-2-3)。(B)異なる時点におけるスライスのアポトーシス速度の分析。平均±SD、N(反復)= 6スライス、n(合計セル)>各スライスで1,000、Kruskal-Wallis検定、多重比較、p値>0.05。アポトーシス速度は時間の経過とともに安定しています。パネルAの挿入図1-2-3では、aCASP3陽性の細胞の詳細を観察することができる(赤染色、白矢印)。小さな赤い点は、細胞の破片とピクノティック核をラベル付けします。スケールバー = 50 μm. (C) DEV 90 で SC スライスで実施された生/死アッセイの代表的な画像: 代謝活性細胞はカルセインで緑色で標識され、死細胞と損傷細胞はシトックスで水色 (シアン) で標識されます。2 つのヒストグラムは、セルの総数で Calcein (左側) と Sytox (右側) に陽性のセルの割合を示しています。両方の平均±SDについて、N(反復)= 6スライス、n(合計セル)>各スライスで1,000、Kruskal-Wallis検定、多重比較、DEV 30とDEV 60のp値= 0.018;DEV 30 vs DEV 90 p値 = 0.027;DEV 60 対 DEV 90 の p 値 > 0.99。略語:DEV = day ex vivo;DAPI=4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;NFL =ニューロフィラメント軽鎖;SC =脊髄;aCASP3 = 活性型カスパーゼ-3。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図5:マウス器官型スライスへのh-SC-NES細胞移植 (A)移植プロトコルの代表的なスキーム。細胞は、DIV 10で神経前駆体としてDEV 4器官型スライスに分化します。(B)GFP発現h-SC-NES細胞をDPT 30まで経時的に移植したマウス器官型スライスの代表画像。 細胞にGFP 遺伝子を運ぶレンチウイルスベクターを形質導入します。GFPの経時的な発現により、その生存率とスライス環境への適応が確認されています。スケールバー = 500 μm。略語:DIV =事前分化の最初の日。h-SC-NES = ヒト脊髄由来神経上皮ステム;GFP = 緑色蛍光タンパク質;DEV = 生体内の日;OM =器官型培地;GM =グラフト媒体;DPT = 移植後日数。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図6:移植後30日後の移植h-SC-NES細胞のアポトーシス率評価 (A)GFP発現h-SC-NES細胞を移植したマウス器官型切片の代表画像。移植後に細胞をモニターするために、 GFP 遺伝子を担持したレンチウイルスベクターを細胞に形質導入します。GFPの経時的な発現により、その生存率とスライス環境への適応が確認されています。表示されている時点は DPT 30 です。細胞はヒト核(シアン)およびaCASP3(赤)について染色されます。(B) 左はDPT 30(N(反復)=5スライス、N(細胞)=5,000)でスライスに移植した細胞のアポトーシス解析の代表的な円グラフ、右はHu-Nu+ 細胞の挿入図とaCASP3陽性の細胞の詳細(白矢印)。スケールバー = 75 μm。小さな赤い点は、細胞の破片とピクノティック核をラベル付けします。略語:h-SC-NES =ヒト脊髄由来神経上皮ステム;GFP = 緑色蛍光タンパク質;DPT = 移植後日;DAPI=4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;NFL =ニューロフィラメント軽鎖;aCASP3 = 活性型カスパーゼ-3;Hu-Nu = 人間の核。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 表1:このプロトコルで使用される溶液の組成。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

SCI患者に対する効果的な治療法はまだなく、さまざまなアプローチが検証されており、最も有望なアプローチの1つは、再生戦略である細胞置換に基づいています。現在、再生医療分野の進歩により、細胞移植の有効性と安全性を単独で、または他のアプローチと組み合わせて検証するための新しいプラットフォームが求められています。その前臨床検証は、さらなる臨床研究を追求するために不可欠です。SC器官型培養は、神経変性、神経再生、および神経発生のさまざまな側面を研究し、新しい治療アプローチの有効性を調査するための有用なプラットフォームである23。特に、器官型培養物の特有の特徴である、元の組織構造の維持や細胞・微小環境組成は、細胞の生着、統合、分化、成熟などの移植動態を解明するのに有利です。

公表されたプロトコルと一貫して、SC器官型スライスは、健康な状態で約2〜3週間培養中に保持することができ、細胞療法の試験スキームに必要な長期調査および機能スクリーニングのためのそれらの使用を制限する。SC組織内に移植された細胞の正しい運命に向けた分化や成熟などの重要なプロセスを探求するには、長期的なモニタリングが必要です。これらの細胞プロセスは、動物モデルでの一般的な移植において重要です。in vivoに存在する多くの特徴を模倣したex vivoシステムが利用可能であることは、前臨床スクリーニング段階で役立つでしょう。

このため、本研究では、生存可能なSCスライスを最大90日間維持し、通常の培養期間を3倍にすることができる最適な長期(≥30日)のSC器官型培養法を提案します。また、h-SC-NES細胞のSCスライス内への安定した生着と、最大30日間の移植培養の維持が認められました。GFPの発現を観察することで、細胞の生着を経時的にモニタリングし、DPT 30までの細胞生存を確認しました。30 DPT後、細胞のアポトーシス率を評価しました。文献では、7 DPTでのSCスライスにおける移植されたh-SC-NES細胞のアポトーシスの評価が報告されている40。ここでは、DPT 30で細胞アポトーシス解析を拡張し、以前の時点(DPT 7)に対するアポトーシス速度を比較しました。その結果、私たちのデータは文献と一致しており、移植されたh-SC-NES細胞は、私たちの研究で最適化された培養条件に維持されていれば、後の時点でも生存することが示唆されていることがわかりました。この改良された長期 ex vivo プラットフォームを単独で、または移植構成で使用することで、研究者はSCIの幹細胞ベースの移植の前臨床スクリーニングに役立ちます。これにより、移植の成功を促進するさらなる in vivo 研究に最適な細胞候補を特定することができます。さらに、最初のスクリーニング後、SC器官型スライスを in vivo 研究と並行して使用して、動物モデルで観察された長期的な細胞動態と挙動を確認および裏付けたり、メカニズム研究をサポートしたりすることもできます。

私たちのプロトコルでは、この長期的な器官型モデルを生成する方法を詳しく説明していますが、いくつかの重要なステップについても説明する必要があります。SC器官型培養物の作製に関しては、手術中および培養の初期段階ではいくつかの課題があります。元の組織構造を維持するスライスを生成するには、適切に実施された手術手順が不可欠です。分離中にSCが台無しになると、スライスは典型的な解剖学的構造を失い、組織の損傷は過度の炎症誘発性損傷を誘発し、不健康な状態や細胞死につながる可能性があります。手術中の最も困難な段階は、背骨からのSCの抽出と、分離されたSCからの髄膜の除去です。これらの手順が成功するかどうかは、オペレーターの経験にかかっています。したがって、実験を開始する前にトレーニング期間を設けることをお勧めします。

チョッパーによるSCの冠状切片化も困難な段階です。分離されたSCは、ブレードに対して正確に垂直なカッティングデッキに配置する必要があります。また、オペレーターはブレードをカッティングデッキに対して垂直に配置する必要があります。これらの予防措置は、同じ実験と異なる実験間で再現性のあるスライスを確実に生成するために必要です。もう一つの重要な問題は、手術の時間が限られていることです:スライス生成手順全体は~30分かかります。オペレーターが手術や切断により多くの時間を費やすと、SC組織が損傷し、培養の成功と実験の次のステップが損なわれる可能性があります。

スライスを培養膜に置いたら、正しく供給することが重要です。GDNFは、組織の回復と生存を維持するために必要です。チョッパーによる切断は組織にとって外傷性であり、このため、切断後すぐにスライスを氷冷解剖培地に入れて、過剰な炎症誘発性分子と死促進分子を洗い流します。次に、GDNFで修飾した新鮮な培地でスライスを培養メンブレン(細胞培養インサート)に置き、より迅速な回収とメンブレンへのスライス接着を促進します。GDNFは、半減期が短いため、培養の最初の1週間は毎日培地に追加する必要があります50,51。その結果、スライスは、組織の回復と生存率を促進するために、培養の最初の数日間はGDNFが継続的に存在する必要があることがわかりました。いずれにせよ、GDNFの存在は培養期間全体にとって重要であるため、それ以上の時点でGDNFの管理を中断することは強くお勧めしません。

培養の最初の1週間は、目視と顕微鏡でスライスを肉眼的にチェックすることも重要です。半透明の組織と境界の透明性は、スライスがメンブレンと生存組織に適切に接着していることを示しています。壊死組織は、最初は肉眼的には非常に白く見え、顕微鏡では壊死領域は濃い灰色に見えます。数週間培養すると、組織の形態が変化することがあります:細胞の動きと膜への組織の接着がこのプロセスに影響を与える可能性があります。例えば、細胞で満たされた一部のスライスでは中央内腔の喪失や、背側および腹側の角の形態の喪失が観察されました。これは主に小さなスライスで発生しますが、それらのほとんどは元のスライスに近い解剖学的構造を維持します。スライスは通常、腰部または胸部から生成されます。このようにして、元の組織構造を長期にわたって維持するための適切なサイズを持つことができるため、小さすぎるとアーキテクチャが失われ、大きすぎると中央領域が壊死する可能性があります。したがって、マウスの子犬の腰部を使用して、最適な長期培養に適したサイズのスライスを生成しましたが、原則として、他のセグメントも考慮できます。さらに、腹側と背側の領域が互いに区別しやすいため、腰部を使用することを選択しました。さらに、この領域は、SCIの細胞補充療法で関心のある部位である運動ニューロンと灰白質の割合が高い組織領域を示しています。細胞を通過させるための穴が大きすぎると、マイクロインジェクション中にSC組織に損傷を与える可能性があります。小さすぎると、細胞のスタッキングが針を詰まらせ、移植プロセスを妨げる可能性があります。移植手順は、細胞の苦痛と死を最小限に抑えるために1時間以内に完了する必要があります。

提案されたプロトコルは、さまざまなタイプの調査に最適で汎用性の高いツールを提供します。ここでは、長期プラットフォームを適用して、マウスSC組織内での分化の最初の段階でh-SC-NES細胞を30日間移植することを検証します。提案されたアプローチの主な新規性は、共培養プロトコルの最適化です。GMの成分は、SCスライスと移植されたh-SC-NES細胞の長期的なニューロン生存を維持します。実際、GMは、無血清培地であるため、以前に器官型スライス培養に使用された培地47に関して、移植された細胞のニューロン運命への分化を維持する。

SCIの提案モデルについては、通常、成体マウスで実験が行われます。これまでのところ、新生児と成体SCとの間の最も重要な違いは、成体マウス52に関して新生児に見出されるより高い再生能に関連している。しかし、このような違いは、私たちが提案しているプロトコルのタイプに影響を与えることはありません、なぜなら、ここでは、常在ニューロンの再生能力ではなく、宿主組織環境に対する移植細胞の応答に焦点を当てているからです。SCI後の新生児マウスと成体マウスの別の違いは、成体に発生するグリア瘢痕の形成に関連しています。この側面は、一次および二次損傷に起因する複雑な生理病理学的プロセスを考慮していない提案されたモデルでは考慮されていません。

アプリケーションに関しては、このプラットフォームは、移植された細胞とSC器官型モデルに存在する常在回路との間の統合を調査するためにも使用できます。遺伝子工学ツールは、シナプス結合性を評価するためにCNSですでに使用されており、この点で活用できる可能性があります53,54,55。特に、生着細胞とSC ex vivo組織との間のシナプスの形成を評価することにより、この統合を調査および検証できます。これらの長期的な器官型培養物は、神経保護剤や神経再生剤、新規の分子/材料の試験、またはSCが関与する神経変性疾患の研究にも利用できる可能性があります。特定の神経変性疾患を研究するためには、特定の病理関連変異を持つトランスジェニックマウスなどの関連モデルから生成されたSCスライスを、病理学の関連段階(すなわち、新生児、若年性、成人)で培養するために、プロトコルを適合させる必要があります。結論として、私たちのプロトコールおよび器官型培養は、特定の臓器の外植片であり、2D細胞培養とin vivoモデルとの間のギャップを埋める特徴を示しており、基礎研究と前臨床試験の両方にとって非常に貴重なツールであることが確認されています。

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、Wings for Life Foundation(WFL-IT-20/21)、欧州連合Next-Generation EU-National Recovery and Resilience Plan(NRRP)-mission 4 component 2、Investment n. 1.4-CUP N. B83C22003930001(Tuscany Health Ecosystem-THE, Spoke 8)、Marina Romoli Onlusの支援を受けました。この原稿は著者の見解や意見のみを反映しており、欧州連合(EU)も欧州委員会もそれらに対して責任があるとは考えられません。データとメタデータは、Zenodo 10.5281/zenodo で入手できます。10433147。 画像はBiorender https://www.biorender.com/ で生成しました。

Materials

anti-cleaved Caspase-3,  (Asp175) (5A1E) (Rabbit) Cell Signaling Technology 9661S 1:400
anti-GFP (Mouse) – monoclonal Sigma/Merck G6539 1:400
anti-Human Nuclei (Mouse) – monoclonal, clone 235-1  Sigma/Merck MAB1281 1:400
anti-Human Nuclei (Rabbit) NeoBiotechnologies RBM5-346-P1 1:400
anti-NeuN (RBFOX3) (Rabbit) – polyclonal Sigma/Merck ABN78 1:400
anti-NFL (Mouse) Sigma/Merck MAB1615 1:400
anti-NFL H-Phospho (Rabbit) -polyclonal Biologend 840801 1:500
Aqua Polymount Poly-sciences 18606-20
B-27 Gibco 17504-044
BDNF Gibco PHC7074
Blades Leica 118364227
Cell culture graded water Sigma/Merck W3500-500ML
Collagen from rat tail Sigma/Merck C7661
Confocal microscope – A1 Confocal Microscope (Eclipse Ti) Nikon 
D(+)-Glucose Sigma/Merck G7021
Dissecting Forceps World Precision Instruments 15915
DMEM/F12 Gibco 31330
DPBS Sigma/Merck D8537
EGF Sigma/Merck gf144
FBS Gibco 10270-106
FGF-2 Stemgent 03-0002
GDNF Sigma/Merck SRP3200
Glass capillaries, 3.5"  Drummond Scientific Company 3-000-203-G/X
Glutamax Gibco 35050-038
Goat-anti Mouse IgG Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11029
Goat-anti Mouse IgG Alexa Fluor 647 Thermo Fisher Scientific A21236 1:500
Goat-anti Rabbit IgG Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A11011 1:500
Goat-anti Rabbit IgG Alexa Fluor 647 Thermo Fisher Scientific A21244 1:500
Graph Pad-Prism Dotmatics Software for Statistical Analysis
HBSS Gibco 14025-050 1:500
HEPES Gibco 15630-056
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570
Horse Serum Gibco 16050-122
Insulin Sigma/Merck I9278
Laminin Sigma/Merck L2020
Lentiviral prep Addgene 17446-LV
L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030024
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity assay kit Thermo Fisher Scientific L32250
McIlwain Tissue Chopper World Precision Instruments
MEM Gibco 11090-081
Microloader tips Eppendorf 5242956003 to load cells in the needle for transplantation
Microscope slides VWR 631-0909
Millicell cell culture membrane Sigma/Merck PICM0RG50
Miscroscope cover glasses VWR  ECN 631-1572
N-2 Gibco 17502-048
Neurobasal Gibco 21103-049
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Petri dish (35mm) VWR 734-2317
PFA Sigma/Merck P6148-500G
Plastic pasteur pipette Sarstedt 86.1171.010
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments PV830 Microinjector for transplantation
Poly-L-lysine Sigma/Merck P4707
Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel VWR International SWAN3001
Scalpel handle #3 World Precision Instruments 500236
Spring Scissors World Precision Instruments 501235
Stereomicroscope for imaging and acquisition Nikon  SMZ18
Stereomicroscope for surgery VWR
Triton X-100 Merck T8787
Tweezers-Dumont #5-inox World Precision Instruments 501985
Vannas Scissors, 8.5 cm World Precision Instruments 500086
Vertical micropipette puller Shutter Instrument P-30
Y-27632 R&D Systems 1254/50
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References

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Merighi, F., De Vincentiis, S., Onorati, M., Raffa, V. Long-Term Mouse Spinal Cord Organotypic Slice Culture as a Platform for Validating Cell Transplantation in Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (206), e66704, doi:10.3791/66704 (2024).
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