Exploration de solutions de perfusion alternatives à l’aide de transporteurs d’oxygène polymérisés à base d’hémoglobine de nouvelle génération dans un modèle de perfusion pulmonaire ex vivo chez le rat

Des rats Sprague-Dawley (300 g de poids corporel) ont été obtenus commercialement et hébergés dans des conditions exemptes d’agents pathogènes à l’établissement vétérinaire du Wexner Medical Center de l’Université d’État de l’Ohio. Toutes les procédures ont été effectuées sans cruauté conformément au Guide for the Humane Care and Use of Laboratory Animals du NIH et au National Research Council et avec l’approbation du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université d’État de l’Ohio (protocole IACUC 2023A00000071). 1. Synthèse et purification de polyhHb REMARQUE : La production et la synthèse du matériel PolyhHb qui a été utilisé pour les expériences EVLP suivantes ont été initialement publiées par Cuddington et al. en 202022. Veuillez vous référer à ce travail pour des schémas approfondis et une analyse de la synthèse de PolyhHb. Ce qui suit est un résumé de la synthèse et de la purification de PolyhHb à l’échelle pilote et de sa préparation ultérieure en tant que perfusat. Lavage, lyse et purification de l’Hb par RBCProcurez-vous 18 unités de PRBC humains périmés et versez-les dans un récipient de filtration de 20 L, diluez avec une solution saline à 0,9 % en poids jusqu’à obtenir un hématocrite final de 22 % (figures 1B et C). Effectuez six échanges de volume du système (diacycles) sur un module de filtration à flux tangentiel (TFF) en polyéthylène-sulfone modifié (mPES) de 0,65 μm avec 0,9 % en poids de solution saline sur la solution de globules rouges. REMARQUE : Le but de cette étape de lavage est d’éliminer les globules rouges endommagés, les fragments de membrane et autres matériaux extracellulaires avant l’hémolyse (Figure 1B, C). Lyser la solution de globules rouges avec 10 L de tampon phosphate (PB, 3,75 mM, pH 7,4) pendant 1 h à 4 °C en agitant constamment. Éliminer les fragments de membrane lysée et les autres agrégats en filtrant la solution sur un module TFF de 500 kDa et en recueillant le perméat dans la cuve du réacteur discontinu de 30 L (figure 1A-C). Une fois que 480 g de Hb sont dans le réacteur, ajoutez une charge de sel pour convertir le PB en solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Faire recirculer l’Hb à travers un contacteur de gaz alimenté en azote, ainsi que maintenir un espace de tête azoté dans le réacteur, pour désoxygéner la protéine pendant la nuit. Réfrigérer à 14 °C pour limiter la formation de méthémoglobine (metHb). Polymérisation de l’HbChauffer la solution d’Hb à température physiologique (37 °C) tout en faisant recirculer la solution sur une boucle de contacteur de gaz.REMARQUE : L’objectif est de désoxygéner la protéine à un pO2 entre 0 et 10 mmHg pour s’assurer que la majeure partie de l’Hb est à l’état quaternaire tendu (Figure 1A). Ajoutez 1 g de dithionite de sodium, au besoin, pour assurer une désoxygénation efficace. Tout en maintenant la boucle de recirculation et en dégazant la solution d’Hb, ajoutez un rapport molaire de 30:1 de glutaraldéhyde (GA) à Hb dilué dans 3 L de PBS désoxygéné (pH 7,4). Ajouter la solution à la cuve du réacteur pendant 3 h avec une heure supplémentaire de temps de réaction. Éteindre la réaction de réticulation avec un rapport molaire de 7:1 de cyanoborohydrure de sodium à GA, dilué dans 3 L de PBS (pH 7,4). Ajouter au réacteur pendant plus de 10 min. Réfrigérer le réacteur à 14 °C pendant la nuit. Purification polyhHbPompez le contenu du réacteur dans une cuve de filtration de 10 L et commencez à circuler à travers un module TFF en polyéthylène-sulfone (PES) de 0,2 μm (étape 1). Cette étape permettra d’éliminer les gros agrégats et les contaminants indésirables. Introduisez le perméat dans un récipient de filtration secondaire de 10 L qui circulera sur un module TFF en polysulfone (PS) de 500 kDa (étape 2) une fois plein. Continuez jusqu’à ce que le réacteur soit vidé (Figure 1B,D). Une fois le réacteur vidé dans le circuit de purification, commencer l’échange d’excipient à l’étape 1 avec une solution de Ringer lactée modifiée (pH 7,4). Après chaque échange de volume complet, mesurer la concentration en protéines dans le perméat de l’étape 1 à l’aide de la spectroscopie UV-visible. Lorsque le perméat de l’étape 1 a une concentration inférieure à 1 mg Hb/mL, transférez la solution de Ringer modifiée à l’étape 2. Tout retard à l’étape 1 est un déchet et doit être éliminé de manière appropriée. Au total, assurez-vous que 12 échanges de volumes complets de la solution Ringer’s modifiée sont effectués au cours des deux étapes. Une fois les diacycles terminés, concentrer le contenu de l’étape 2 à au moins 10 g/dL sur le module TFF de 500 kDa. Emballer la solution concentrée dans des tubes coniques de 50 mL et conserver à -80 °C jusqu’à utilisation. 2. Formulation de perfusat Préparez le perfusat jusqu’à ce qu’il consomme 165 ml. Diluer PolyhHb à une concentration finale de 3,7 g/dL avec le E Medium de William. Ajouter de l’albumine sérique humaine (HSA) à une concentration finale de 3 % de HSA en poids. Ajouter 1 mL d’héparine à la solution finale. 3. Configuration du circuit de perfusion pulmonaire ex vivo Placez le perfusate de PolyhHb dans le réservoir du circuit EVLP et allumez le bain d’eau chaude à 37 °C. Assurez-vous que le perfusat circule dans le circuit en allumant les pompes à rouleaux. Connectez le gaz de désoxygénation (c’est-à-dire 6 % O2, 8 % CO2, 84 % N2) à l’oxygénateur à fibres creuses pour désoxygéner le perfusat. Ceci est fait pour évaluer la capacité du poumon à oxygéner le perfusat. Ouvrez le logiciel d’acquisition de données sur un ordinateur à proximité. Assurez-vous que la pression artérielle pulmonaire, la pression différentielle trachéale, la pression différentielle du débit respiratoire, le poids pulmonaire et les transducteurs de vitesse de la pompe sont connectés à la fois au circuit et au boîtier du convertisseur de données. Assurez-vous qu’il n’y a pas de fuites dans tout le système en examinant attentivement tous les raccords des tubes et que de l’eau chaude circule dans tout le système (figure 2). Appuyez sur Exécuter sur le logiciel d’acquisition de données pour vous assurer que tous les transducteurs de pression fonctionnent. Une fois que le système fonctionne correctement, éteignez les pompes à rouleaux. 4. Obtention d’un bloc pulmonaire de rat donneur Installez la table d’opération et disposez les instruments (Figure 3). Autoclave tous les instruments à 121 °C pendant 30 min. Préparez 1200 U/kg d’héparine, un mélange de kétamine/xylazine pour l’anesthésique (60 mg/kg de kétamine et 5 mg/kg), ainsi que des sutures en soie de 5 à 10 cm de long (3-0 ou 4-0). Injecter une solution de kétamine/xylazine par voie intrapéritonéale chez le rat. Attendez 5 à 10 minutes pour que l’avion anesthésique se développe. Pour assurer un niveau d’anesthésie approprié, pincez le rat du pied pour provoquer une réaction. S’il n’y a pas de réaction, le niveau d’anesthésie approprié a été atteint. Rasez l’abdomen du rat et placez le rat en position couchée sur la planche chirurgicale. Nettoyez l’abdomen avec de la povidone iodée et de l’éthanol à 70 %. Placez une pommade ophtalmique sous les yeux du rat pour éviter la sécheresse. Déplacez le rat sur la planche chirurgicale et fixez-le en place (Figure 4A). Allumez le logiciel d’acquisition de données et commencez l’enregistrement. Allumez le ventilateur à 4 mL/kg et assurez-vous que la pression expiratoire positive (PEP) est d’environ 2 cm/H2O.REMARQUE : Ces paramètres initiaux sont spécifiques à l’expérience. Il appartient à tous les chercheurs de déterminer les meilleures stratégies ventilatoires pour des expériences individuelles. Une fois que la profondeur anesthésique appropriée est atteinte, effectuez une laparotomie médiane du processus xiphoïde à la symphyse pubienne à l’aide d’une paire de ciseaux. Ensuite, effectuez une rotation viscérale médiale-latérale et visualisez la veine cave inférieure infra-hépatique à l’aide d’un instrument contondant (IVC)36,37,38 (Figure 4B). Injectez de l’héparine dans la VCI à l’aide d’une aiguille de 20 G (Figure 4C). Portez votre attention sur le cou et coupez la peau de l’encoche sternale jusqu’à juste en dessous de l’angle de la mandibule avec une paire de ciseaux. Ensuite, commencez à disséquer vers la trachée (Figure 5A). Dans le cou, disséquez brusquement les muscles de la sangle nécessaires pour exposer la trachée (Figure 5B). Faites une incision transversale avec une paire de ciseaux sur la trachée antérieure entre les anneaux cartilagineux assez grands pour le tube endotrachéal (TE) (plusieurs millimètres), mais ne coupez pas la partie postérieure de la trachée. Placez une suture en soie 5-0 autour de la trachée (Figure 5C). Insérez le tube endotrachéal et fixez-le en place avec la suture en soie 5-0 susmentionnée (Figure 5D). Connectez le tube ET au ventilateur et assurez-vous d’une bonne élévation de la poitrine. Effectuez une sternotomie médiane et pénétrez à nouveau dans la cavité thoracique à l’aide de ciseaux. Placez les écarteurs de la paroi thoracique pour exposer le cœur et les poumons (figure 6A). Évitez toute manipulation par inadvertance des poumons, car ils sont incroyablement friables. Retirez le thymus du médiastin antérieur par une combinaison de dissection tranchante (ciseaux) et émoussée. Veillez à ne pas endommager les gros vaisseaux ou les poumons. Identifier l’artère pulmonaire (AP ; Graphique 6B) et placez une suture en soie 5-0 autour de celle-ci pour préparer la canulation (Figure 6C). En raison de l’anatomie microscopique des gros vaisseaux du rat, il est souvent plus facile de placer la suture autour de l’AP et de l’aorte en même temps. Faites une incision de 2 à 3 mm dans la voie d’écoulement ventriculaire droite (RVOT) à l’aide d’une paire de ciseaux (Figure 6D-E) pour placer la canule artérielle à l’intérieur de l’AP et fixez-la en place avec la suture 5-0 décrite une étape plus tôt (Figure 6F). Faites une incision de 5 mm dans le ventricule gauche (VG) ainsi qu’une VCI infra-hépatique à l’aide d’une paire de ciseaux pour euthanasier le rat. Connectez rapidement le liquide de préservation pulmonaire à la canule artérielle pour rincer les poumons par gravité avec environ 20 ml (Figure 7A-B). Assurez-vous que le liquide de préservation pulmonaire est désaéré avant de le connecter à la canule artérielle, car les embolies gazeuses sont très dommageables pour les poumons. Connectez la canule artérielle au circuit EVLP. Allumez la pompe à rouleau et laissez une petite quantité de perfusat s’écouler dans le poumon et sortir du ventricule gauche dans la cavité thoracique. Une fois que le perfusat commence à s’écouler de l’oreillette gauche, éteignez la pompe à rouleaux (Figure 7C). Tout en laissant le perfusat s’écouler, assurez-vous que la pression du PA n’augmente pas, ce qui indiquerait un blocage ou un placement incorrect. Placez de petites pinces dans le VG et étirez doucement l’anneau de la valve mitrale, ce qui permettra l’introduction de la canule de l’oreillette gauche (LA) (Figure 8A). Placez une cravate de soie 5-0 autour du cœur et attachez-la sans serrer (Figure 8B). Insérez la canule LA dans le VG et avancez la canule LA jusqu’à ce qu’elle soit visible dans l’oreillette. Terminez de fixer le LA avec la suture 5-0 pré-nouée (Figure 8C). Identifiez l’œsophage et clampez-le avec un hémostat le plus près possible du diaphragme. Coupez l’œsophage sous l’hémostat pour vous assurer qu’il n’y a pas de débordement dans la cavité thoracique (figure 9A). En utilisant la colonne vertébrale comme guide, coupez toutes les attaches ligamentaires reliant le bloc cœur-poumon aux structures environnantes à l’aide d’une paire de ciseaux (Figure 9B). Une fois que le bloc cœur-poumon est librement mobile, disséquez la trachée à partir du cou et enfin coupez la trachée au-dessus du tube ET à l’aide d’une paire de ciseaux pour libérer le bloc cœur-poumon (Figure 9C). Déplacez le bloc cœur-poumon vers la gaine thoracique à l’intérieur du circuit EVLP et fixez la canule LA au circuit EVLP (Figure 9D). Allumez la pompe à rouleaux et connectez le moniteur de ventilation. Vérifiez le piège à bulles pour vous assurer qu’aucune embolie gazeuse n’est introduite dans le système. Modifiez lentement les paramètres de ventilation et de perfusion aux niveaux expérimentaux souhaités pendant les 15 premières minutes 36,37,38. De plus, pendant cette phase initiale de montée en puissance, augmentez le débit de perfusion au débit et/ou à la pression souhaités. Aux moments désignés par l’expérience, vérifiez les niveaux de gaz perfusats ainsi que les tests de la fonction respiratoire.