Nous présentons ici un protocole pour la génération et la vérification fonctionnelle de cellules T à récepteur antigénique chimérique (CAR)-T sensibles à l’hypoxie. Ce protocole présente la génération de cellules CAR-T sensibles à l’hypoxie à l’hypoxie et leur caractérisation, y compris la validation de l’expression des CAR dépendants de l’hypoxie et de la cytotoxicité sélective.
Des études approfondies ont prouvé le potentiel de la thérapie cellulaire à récepteur T antigénique chimérique (CAR-T) dans le traitement des hémopathies malignes. Cependant, le traitement des tumeurs solides reste difficile, comme en témoignent les problèmes de sécurité qui se posent lorsque les cellules CAR-T attaquent les cellules normales exprimant les antigènes cibles. Les chercheurs ont exploré diverses approches pour améliorer la sélectivité tumorale de la thérapie cellulaire CAR-T. Une stratégie représentative dans ce sens est la construction de cellules CAR-T sensibles à l’hypoxie, qui sont conçues en fusionnant un domaine de dégradation dépendant de l’oxygène avec la fraction CAR et sont conçues pour atteindre une expression élevée de CAR uniquement dans un environnement hypoxique – le microenvironnement tumoral (TME). Cet article présente un protocole pour la génération de ces cellules CAR-T et leur caractérisation fonctionnelle, y compris des méthodes pour analyser les changements dans l’expression des CAR et la capacité de destruction en réponse à différents niveaux d’oxygène établis par une chambre d’incubation mobile. On s’attend à ce que les cellules CAR-T construites démontrent l’expression des CAR et la cytotoxicité d’une manière sensible à l’oxygène, soutenant ainsi leur capacité à distinguer les TME hypoxiques des tissus normaux normoxiques pour une activation sélective.
La thérapie par lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR-T) a représenté une percée significative dans le traitement du cancer. Depuis que la Food and Drug Administration (FDA) a approuvé la première thérapie CAR-T pour le traitement du lymphome avancé/résistant et de la leucémie lymphoblastique aiguë en 2017, 1, 2, 3 et 10 thérapies CAR-T ciblant CD19 ou l’antigène de maturation des cellules B (BCMA) ont été approuvées à l’échellemondiale4. Cependant, malgré des recherches approfondies, la reproduction de l’efficacité remarquable de la thérapie CAR-T dans le traitement des hémopathies malignes reste difficile pour son application aux tumeurs solides 5,6,7,8.
Le microenvironnement tumoral immunosuppresseur (TME) est l’un des principaux contributeurs à la faible efficacité du CAR-T dans le cadre de la tumeur solide. L’EUT entrave l’activité et la survie des cellules CAR-T en raison d’un manque de nutriments, d’une hypoxie, d’un pH acide et de l’accumulation de déchets métaboliques 9,10,11,12. Une autre hostilité provient de l’infiltration de cellules immunosuppressives telles que les lymphocytes T régulateurs (Tregs), les cellules suppressives dérivées de myéloïdes (MDSC) et les macrophages associés à la tumeur (TAM), qui, parallèlement aux cellules tumorales, sécrètent des cytokines immunosuppressives qui provoquent une inhibition supplémentaire des cellules CAR-T une fois qu’elles pénètrent dans la tumeur13,14.
Outre l’efficacité thérapeutique insatisfaisante, les problèmes de sécurité sont un autre talon d’Achille des cellules CAR-T lorsqu’il s’agit de tumeurs solides15,16. Le problème de sécurité provient du fait qu’aucun des antigènes spécifiques de la tumeur (TSA) identifiés jusqu’à présent n’est strictement limité aux cellules tumorales. En d’autres termes, les antigènes associés à la tumeur (TAA) choisis comme cible de la CAR, bien que montrant une expression plus élevée dans les cellules tumorales, sont souvent également exprimés par les tissus normaux17. Des effets non tumoraux ciblés pourraient donc se produire à partir de l’activation inattendue des cellules CAR-T lorsque les cellules CAR-T reconnaissent efficacement les tissus normaux, conduisant au syndrome de libération de cytokines (CRS), au syndrome d’encéphalopathie liée aux CAR-T (CRES)18 et à d’autres résultats indésirables19.
De nombreuses stratégies ont été explorées pour éviter de tels effets, notamment la diminution de l’affinité des CAR pour permettre aux cellules CAR-T de distinguer les cellules tumorales des cellules normales en fonction des niveaux d’expression du TAA ciblé ; équiper les cellules CAR-T d’un interrupteur d’arrêt, tel qu’un gène de suicide ou un marqueur d’élimination, afin de favoriser leur élimination lors d’une activation inattendue ; partitionner les signaux CD3ζ et de co-stimulation en deux fractions CAR, dont l’engagement simultané est par conséquent nécessaire pour une activation efficace des cellules CAR-T ; l’utilisation d’un circuit synthétique basé sur Notch (synNotch) qui limite l’activité des cellules CAR-T aux cellules ciblées co-exprimant deux TAA différents ; et l’ingénierie des cellules CAR-T pour atteindre la sensibilité de l’ETM en mettant en œuvre un mécanisme permettant d’ajuster l’expression des CAR aux signaux environnementaux changeants 20,21,22,23,24,25,26.
L’une des principales considérations dans l’option de sensibilité aux EUT décrite ci-dessus est le faible niveau d’oxygène dans l’EUT en raison de la prolifération rapide des cellules tumorales. L’adaptation des cellules tumorales à l’hypoxie dépend de l’activation du facteur 1 inductible par l’hypoxie (HIF-1), un facteur transcriptionnel hétérodimérique composé d’une sous-unité inductible, HIF-1α, et d’une sous-unité exprimée de manière constitutive, HIF-1β27. Dans des conditions normoxiques, la protéine HIF-1α subit une ubiquitination et une dégradation protéasomale rapide, en fonction de son domaine de dégradation dépendant de l’oxygène (ODD)28. Lorsque l’apport cellulaire en oxygène devient limité, HIF-1 est stabilisé et active la transcription de ses gènes cibles en aval en se liant aux éléments de réponse à l’hypoxie (HRE)29. Étant donné la nature de l’ODD et de l’HRE en tant qu’éléments sensibles à l’oxygène, ils ont été explorés pour réaliser l’expression conditionnelle des CAR dans l’EUThypoxique 30. Ici, nous présentons un protocole axé sur des méthodes de caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules CAR-T sensibles à l’hypoxie, précédé d’une brève description de la conception des CAR et des procédures de préparation de ces cellules. Ce protocole vise à fournir une ligne directrice utile pour l’exploitation des cellules CAR-T sensibles à l’hypoxie afin de générer des cellules CAR-T avec une toxicité hors tumeur limitée.
Les problèmes de sécurité sont des problèmes importants qui doivent être résolus pour que toute thérapie cellulaire CAR-T passe à l’utilisation clinique. L’utilisation des propriétés uniques des cellules tumorales ou du TME est devenue une orientation de recherche principale, axée sur le développement de cellules CAR-T qui ciblent les tissus tumoraux de manière sélective. La conception d’un CAR-T sensible à l’hypoxie est une stratégie attrayante dans cette directi…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par des subventions du Programme national de recherche et de développement clés de la Chine (2016YFC1303402), du Mégaprojet national sur les principales maladies infectieuses (2017ZX10202102, 2017ZX10304402-002-007) et du Programme général de la Commission municipale de la santé de Shanghai (201740194).
1.5 mL Centrifuge tube | QSP | 509-GRD-Q | Supernatants and cells cellection Protocol Step 2,3,4 |
10% ExpressCast PAGE | NCM biotech | P2012 | Immunoblotting Protocol Step 3 |
10x PBS | NCM biotech | 20220812 | Cell culture Protocol Step 4 |
10 mL pipette | Yueyibio | YB-25H | Pipetting Protocol Step 1 |
10xTRIS-Glycine-SDS electrophoresis buffer | Epizyme | 3673020 | Immunoblotting Protocol Step 3 |
15 mL Centrifuge tube | Thermo Scientific | 339650 | Supernatants and cells cellection Protocol Step 1 |
25 cm2 EasYFlask | Thermo Scientific | 156367 | Cell culture Protocol Step 3,4 |
4x Protein SDS PAGE Loading Buffer | Takara | 9173 | Immunoblotting Protocol Step 3 |
6-well flat-bottom tissue culture plates | Thermo Scientific | 140675 | T Cells culture Protocol Step 1 |
96-well black flat-bottom tissue culture plates | Greiner | 655090 | Cytotoxicity assay Protocol Step 4 |
96-well ELISA plates | Corning | 3590 | ELISA Protocol Step 5 |
96-well plate shaker | QILINBEIER | MH-2 | Shake Protocol Step 4 |
96-well U-bottom tissue culture plates | Thermo Scientific | 268200 | Supernatants cellection Protocol Step 4,5 |
anti-FLAG antibody | Sigma | F1804-50UG | Immunoblotting Protocol Step 3 |
Carbinol | Sinopharm | 10010061 | Immunoblotting Protocol Step 3 |
Carbon dioxide incubator | Thermo Scientific | 360 | Cell culture Protocol Step 1,2,3,4 |
Cell counting plate | Hausser scientific | 1492 | Cell counting Protocol Step 1,3,4 |
CELLection Pan Mouse IgG Kit | Thermo Scientific | 11531D | Mouse IgG magnetic beads Protocol Step 1 |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75002432 | Cell culture Protocol Step 1,3,4 |
Chemiluminescence gel imaging system | BIO-RAD | 12003154 | Immunoblotting Protocol Step 3 |
Cobalt chloride solution (0.5 M) | bioleaper | BR4000203 | Hypoxic condition Protocol Step 2,3,4 |
DMEM | Corning | 10-103-CV | Cell culture Protocol Step 4 |
Electronic balance | Sartorius | PRACTUM612-1CN | weigh Protocol Step 5 |
FBS | BI | 04-001-1ACS | Cell culture Protocol Step 3,4 |
GAPDH Mouse mAb | ABclonal | AC002 | Immunoblotting Protocol Step 3 |
Gel electrophoresis apparatus | BIO-RAD | 1645070 | Immunoblotting Protocol Step 3 |
GloMax Microplate Readers | Promega | GM3000 | luciferase activity measurement Protocol Step 4 |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) | Yeasen | P1126151 | Immunoblotting Protocol Step 3 |
High speed microfreezing centrifuge | eppendorf | 5810 R | Cell culture Protocol Step 1 |
Human IFN-γ ELISA Set | BD | 555142 | ELISA Protocol Step 5 Items: Recombinant Human IFN-γ Lyophilized Standard, Detection Antibody Biotin Anti-Human IFN-γ , Capture Antibody Purified Anti-Human IFN-γ, Enzyme Reagent Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (SAv-HRP) |
Human IL-2 ELISA Set | BD | 555190 | ELISA Protocol Step 5 Items: Recombinant Human IL-2 Lyophilized Standard, Detection Antibody Biotin Anti-Human IL-2 , Capture Antibody Purified Anti-Human IL-2, Enzyme Reagent Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (SAv-HRP) |
IL-15 | R&D systems | P40933 | T Cells culture Protocol Step 1 |
IL-21 | Novoprotein | GMP-CC45 | T Cells culture Protocol Step 1 |
IL-7 | R&D systems | P13232 | T Cells culture Protocol Step 1 |
Inverted microscope | Olympus | CKX41 | Cell culture Protocol Step 1,3,4 |
Jurkat | ATCC | TIB-152 | CAR-Jurkat construction Protocol Step 3 |
LSRFortessa | BD | LSRFortessa | Flow cytometry Protocol Step 2 |
Luciferase Assay System | Promega | E1501 | luciferase reporter assay Protocol Step 4 Items: Passive lysis buffer, firefly luciferase substrate |
Microplate reader | BioTek | HTX | ELISA Protocol Step 5 |
mobile CO2/O2/N2 Incubator Chamber | China Innovation Instrument Co., Ltd. | Smartor118 | Hypoxic condition Protocol Step 2, 3, 4 |
Mouse Anti-Hexa Histidine tag | Sigma | SAB2702218 | Immunoblotting Protocol Step 3 |
NcmBlot Rapid Transfer Buffer | NCM biotech | WB4600 | Immunoblotting |
NcmECL Ultra | NCM biotech | P10300 | Immunoblotting Protocol Step 3 Items: NcmECL Ultra Luminol/Enhancer Reagent (A) ,NcmECL Ultra Stabilized Peroxide Reagent (B) |
NovoNectin -coated 48-well flat plates | Novoprotein | GMP-CH38 | CAR-T cells construction Protocol Step 1 |
OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride) tablet set | Sigma | P9187 | Substrate Reagent Protocol Step 5 Items: OPD tablet (silver foil),urea hydrogen peroxide tablet (gold foil) |
PE-conjugated anti-DYKDDDDK | Biolegend | 637310 | Flow cytometry Protocol Step 2 |
Protamine sulfate | Sigma | P3369-1OG | Lentivirus infection Protocol Step 1 |
Protein Marker 10 Kda-250 KDa | Epizyme | WJ102 | Immunoblotting Protocol Step 3 |
Purifed NA/LE Mouse Anti-Human CD3 | BD | 566685 | T Cells culture Protocol Step 1 |
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28 | BD | 555725 | T Cells culture Protocol Step 1 |
PVDF membrane | Millipore | 168627 | Immunoblotting Protocol Step 3 |
RPMI 1640 | Corning | 10-040-CVRC | Cell culture Protocol Step 3 |
Skim milk powder | Yeasen | S9129060 | Immunoblotting Protocol Step 3 |
SKOV3-Luc | ATCC | HTB-77 | Cytotoxicity assay Protocol Step 4 |
Trypsin-EDTA | NCM biotech | C125C1 | Cell culture Protocol Step 4 |
Tween 20 | Sinopharm | 30189328 | Immunoblotting Protocol Step 3 |
Water bath | keelrein | NB014467 | Heating Protocol Step 1 |
X-VIVO 15 | LONZA | 04-418Q | Serum-free lymphocyte culture medium Protocol Step 1 |