Summary

Génération et vérification fonctionnelle de cellules T à récepteur antigénique chimérique sensible à l’hypoxie

Published: June 14, 2024
doi:

Summary

Nous présentons ici un protocole pour la génération et la vérification fonctionnelle de cellules T à récepteur antigénique chimérique (CAR)-T sensibles à l’hypoxie. Ce protocole présente la génération de cellules CAR-T sensibles à l’hypoxie à l’hypoxie et leur caractérisation, y compris la validation de l’expression des CAR dépendants de l’hypoxie et de la cytotoxicité sélective.

Abstract

Des études approfondies ont prouvé le potentiel de la thérapie cellulaire à récepteur T antigénique chimérique (CAR-T) dans le traitement des hémopathies malignes. Cependant, le traitement des tumeurs solides reste difficile, comme en témoignent les problèmes de sécurité qui se posent lorsque les cellules CAR-T attaquent les cellules normales exprimant les antigènes cibles. Les chercheurs ont exploré diverses approches pour améliorer la sélectivité tumorale de la thérapie cellulaire CAR-T. Une stratégie représentative dans ce sens est la construction de cellules CAR-T sensibles à l’hypoxie, qui sont conçues en fusionnant un domaine de dégradation dépendant de l’oxygène avec la fraction CAR et sont conçues pour atteindre une expression élevée de CAR uniquement dans un environnement hypoxique – le microenvironnement tumoral (TME). Cet article présente un protocole pour la génération de ces cellules CAR-T et leur caractérisation fonctionnelle, y compris des méthodes pour analyser les changements dans l’expression des CAR et la capacité de destruction en réponse à différents niveaux d’oxygène établis par une chambre d’incubation mobile. On s’attend à ce que les cellules CAR-T construites démontrent l’expression des CAR et la cytotoxicité d’une manière sensible à l’oxygène, soutenant ainsi leur capacité à distinguer les TME hypoxiques des tissus normaux normoxiques pour une activation sélective.

Introduction

La thérapie par lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR-T) a représenté une percée significative dans le traitement du cancer. Depuis que la Food and Drug Administration (FDA) a approuvé la première thérapie CAR-T pour le traitement du lymphome avancé/résistant et de la leucémie lymphoblastique aiguë en 2017, 1, 2, 3 et 10 thérapies CAR-T ciblant CD19 ou l’antigène de maturation des cellules B (BCMA) ont été approuvées à l’échellemondiale4. Cependant, malgré des recherches approfondies, la reproduction de l’efficacité remarquable de la thérapie CAR-T dans le traitement des hémopathies malignes reste difficile pour son application aux tumeurs solides 5,6,7,8.

Le microenvironnement tumoral immunosuppresseur (TME) est l’un des principaux contributeurs à la faible efficacité du CAR-T dans le cadre de la tumeur solide. L’EUT entrave l’activité et la survie des cellules CAR-T en raison d’un manque de nutriments, d’une hypoxie, d’un pH acide et de l’accumulation de déchets métaboliques 9,10,11,12. Une autre hostilité provient de l’infiltration de cellules immunosuppressives telles que les lymphocytes T régulateurs (Tregs), les cellules suppressives dérivées de myéloïdes (MDSC) et les macrophages associés à la tumeur (TAM), qui, parallèlement aux cellules tumorales, sécrètent des cytokines immunosuppressives qui provoquent une inhibition supplémentaire des cellules CAR-T une fois qu’elles pénètrent dans la tumeur13,14.

Outre l’efficacité thérapeutique insatisfaisante, les problèmes de sécurité sont un autre talon d’Achille des cellules CAR-T lorsqu’il s’agit de tumeurs solides15,16. Le problème de sécurité provient du fait qu’aucun des antigènes spécifiques de la tumeur (TSA) identifiés jusqu’à présent n’est strictement limité aux cellules tumorales. En d’autres termes, les antigènes associés à la tumeur (TAA) choisis comme cible de la CAR, bien que montrant une expression plus élevée dans les cellules tumorales, sont souvent également exprimés par les tissus normaux17. Des effets non tumoraux ciblés pourraient donc se produire à partir de l’activation inattendue des cellules CAR-T lorsque les cellules CAR-T reconnaissent efficacement les tissus normaux, conduisant au syndrome de libération de cytokines (CRS), au syndrome d’encéphalopathie liée aux CAR-T (CRES)18 et à d’autres résultats indésirables19.

De nombreuses stratégies ont été explorées pour éviter de tels effets, notamment la diminution de l’affinité des CAR pour permettre aux cellules CAR-T de distinguer les cellules tumorales des cellules normales en fonction des niveaux d’expression du TAA ciblé ; équiper les cellules CAR-T d’un interrupteur d’arrêt, tel qu’un gène de suicide ou un marqueur d’élimination, afin de favoriser leur élimination lors d’une activation inattendue ; partitionner les signaux CD3ζ et de co-stimulation en deux fractions CAR, dont l’engagement simultané est par conséquent nécessaire pour une activation efficace des cellules CAR-T ; l’utilisation d’un circuit synthétique basé sur Notch (synNotch) qui limite l’activité des cellules CAR-T aux cellules ciblées co-exprimant deux TAA différents ; et l’ingénierie des cellules CAR-T pour atteindre la sensibilité de l’ETM en mettant en œuvre un mécanisme permettant d’ajuster l’expression des CAR aux signaux environnementaux changeants 20,21,22,23,24,25,26.

L’une des principales considérations dans l’option de sensibilité aux EUT décrite ci-dessus est le faible niveau d’oxygène dans l’EUT en raison de la prolifération rapide des cellules tumorales. L’adaptation des cellules tumorales à l’hypoxie dépend de l’activation du facteur 1 inductible par l’hypoxie (HIF-1), un facteur transcriptionnel hétérodimérique composé d’une sous-unité inductible, HIF-1α, et d’une sous-unité exprimée de manière constitutive, HIF-1β27. Dans des conditions normoxiques, la protéine HIF-1α subit une ubiquitination et une dégradation protéasomale rapide, en fonction de son domaine de dégradation dépendant de l’oxygène (ODD)28. Lorsque l’apport cellulaire en oxygène devient limité, HIF-1 est stabilisé et active la transcription de ses gènes cibles en aval en se liant aux éléments de réponse à l’hypoxie (HRE)29. Étant donné la nature de l’ODD et de l’HRE en tant qu’éléments sensibles à l’oxygène, ils ont été explorés pour réaliser l’expression conditionnelle des CAR dans l’EUThypoxique 30. Ici, nous présentons un protocole axé sur des méthodes de caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules CAR-T sensibles à l’hypoxie, précédé d’une brève description de la conception des CAR et des procédures de préparation de ces cellules. Ce protocole vise à fournir une ligne directrice utile pour l’exploitation des cellules CAR-T sensibles à l’hypoxie afin de générer des cellules CAR-T avec une toxicité hors tumeur limitée.

Protocol

Dans cette étude, HER2-BBz-ODD, un CAR sensible à l’hypoxie ciblant HER2 (ID du gène : 2064) a été comparé à son homologue régulier, HER2-BBz. Les schémas des deux RAC sont illustrés à la figure 1A, qui montre que HER2-BBz-ODD est dérivé de HER2-BBz en ajoutant la séquence ODD à la séquence C-terminale de CD3ξ. La construction de vecteurs lentiviraux exprimant les deux CAR, et la génération du lentivirus correspondant par transfection de…

Representative Results

La fusion du domaine ODD de HIF-1α avec la fraction CAR représente une stratégie primaire pour générer un CAR sensible à l’hypoxie. Le CAR ciblant HER2 sensible à l’hypoxie analysé dans cette étude, nommé HER2-BBz-ODD, a été construit à l’aide de cette stratégie en intégrant la séquence ODD dans son HER2-BBz conventionnel (Figure 1A). Dans cette étude, nous avons utilisé la transduction lentivirale pour exprimer HER2-BBz-ODD CAR ou HE…

Discussion

Les problèmes de sécurité sont des problèmes importants qui doivent être résolus pour que toute thérapie cellulaire CAR-T passe à l’utilisation clinique. L’utilisation des propriétés uniques des cellules tumorales ou du TME est devenue une orientation de recherche principale, axée sur le développement de cellules CAR-T qui ciblent les tissus tumoraux de manière sélective. La conception d’un CAR-T sensible à l’hypoxie est une stratégie attrayante dans cette directi…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par des subventions du Programme national de recherche et de développement clés de la Chine (2016YFC1303402), du Mégaprojet national sur les principales maladies infectieuses (2017ZX10202102, 2017ZX10304402-002-007) et du Programme général de la Commission municipale de la santé de Shanghai (201740194).

Materials

1.5 mL Centrifuge tube QSP 509-GRD-Q Supernatants and cells cellection
Protocol Step 2,3,4
10% ExpressCast PAGE NCM biotech P2012 Immunoblotting
Protocol Step 3
10x PBS NCM biotech 20220812 Cell culture
Protocol Step 4
10 mL pipette Yueyibio YB-25H Pipetting
Protocol Step 1
10xTRIS-Glycine-SDS electrophoresis buffer Epizyme 3673020 Immunoblotting
Protocol Step 3
15 mL Centrifuge tube Thermo Scientific 339650 Supernatants and cells cellection
Protocol Step 1
25 cm2 EasYFlask Thermo Scientific 156367 Cell culture
Protocol Step 3,4
4x Protein SDS PAGE Loading Buffer Takara 9173 Immunoblotting
Protocol Step 3
6-well flat-bottom tissue culture plates Thermo Scientific 140675 T Cells culture
Protocol Step 1
96-well black flat-bottom tissue culture plates Greiner 655090 Cytotoxicity assay
Protocol Step 4
96-well ELISA plates Corning 3590 ELISA
Protocol Step 5
96-well plate shaker QILINBEIER MH-2 Shake
Protocol Step 4
96-well U-bottom tissue culture plates Thermo Scientific 268200 Supernatants cellection
Protocol Step 4,5
anti-FLAG antibody Sigma F1804-50UG Immunoblotting
Protocol Step 3
Carbinol Sinopharm 10010061 Immunoblotting
Protocol Step 3
Carbon dioxide incubator Thermo Scientific 360 Cell culture
Protocol Step 1,2,3,4
Cell counting plate Hausser scientific 1492 Cell counting
Protocol Step 1,3,4
CELLection Pan Mouse IgG Kit Thermo Scientific 11531D Mouse IgG magnetic beads
Protocol Step 1
Centrifuge Thermo Scientific 75002432 Cell culture
Protocol Step 1,3,4
Chemiluminescence gel imaging system BIO-RAD 12003154 Immunoblotting
Protocol Step 3
Cobalt chloride solution (0.5 M) bioleaper BR4000203 Hypoxic condition
Protocol Step 2,3,4
DMEM Corning 10-103-CV Cell culture
Protocol Step 4
Electronic balance Sartorius PRACTUM612-1CN weigh
Protocol Step 5
FBS BI 04-001-1ACS Cell culture
Protocol Step 3,4
GAPDH Mouse mAb ABclonal AC002 Immunoblotting
Protocol Step 3
Gel electrophoresis apparatus BIO-RAD 1645070 Immunoblotting
Protocol Step 3
GloMax Microplate Readers Promega GM3000 luciferase activity measurement
Protocol Step 4
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Yeasen P1126151 Immunoblotting
Protocol Step 3
High speed microfreezing centrifuge eppendorf 5810 R Cell culture
Protocol Step 1
Human IFN-γ ELISA Set BD 555142 ELISA
Protocol Step 5
Items: Recombinant Human IFN-γ Lyophilized Standard, Detection Antibody Biotin Anti-Human IFN-γ , Capture Antibody Purified Anti-Human IFN-γ, Enzyme Reagent Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (SAv-HRP)
Human IL-2 ELISA Set BD 555190 ELISA
Protocol Step 5
Items: Recombinant Human IL-2 Lyophilized Standard, Detection Antibody Biotin Anti-Human IL-2 , Capture Antibody Purified Anti-Human IL-2, Enzyme Reagent Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (SAv-HRP)
IL-15 R&D systems P40933 T Cells culture
Protocol Step 1
IL-21 Novoprotein GMP-CC45 T Cells culture
Protocol Step 1
IL-7 R&D systems P13232 T Cells culture
Protocol Step 1
Inverted microscope Olympus CKX41 Cell culture
Protocol Step 1,3,4
Jurkat ATCC TIB-152 CAR-Jurkat construction
Protocol Step 3
LSRFortessa BD LSRFortessa Flow cytometry
Protocol Step 2
Luciferase Assay System Promega E1501 luciferase reporter assay
Protocol Step 4
Items: Passive lysis buffer, firefly luciferase substrate
Microplate reader BioTek HTX ELISA
Protocol Step 5
mobile CO2/O2/N2 Incubator Chamber China Innovation Instrument Co., Ltd. Smartor118 Hypoxic condition
Protocol Step 2, 3, 4
Mouse Anti-Hexa Histidine tag Sigma SAB2702218 Immunoblotting
Protocol Step 3
NcmBlot Rapid Transfer Buffer NCM biotech WB4600 Immunoblotting
NcmECL Ultra NCM biotech P10300 Immunoblotting
Protocol Step 3
Items: NcmECL Ultra Luminol/Enhancer Reagent (A) ,NcmECL Ultra Stabilized Peroxide Reagent (B) 
NovoNectin -coated 48-well flat plates Novoprotein GMP-CH38 CAR-T cells construction
Protocol Step 1
OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride) tablet set Sigma P9187 Substrate Reagent
Protocol Step 5
Items: OPD tablet (silver foil),urea hydrogen peroxide tablet (gold foil)
PE-conjugated anti-DYKDDDDK Biolegend 637310 Flow cytometry
Protocol Step 2
Protamine sulfate Sigma P3369-1OG Lentivirus infection
Protocol Step 1
Protein Marker 10 Kda-250 KDa Epizyme WJ102 Immunoblotting
Protocol Step 3
 Purifed NA/LE Mouse Anti-Human CD3 BD 566685 T Cells culture
Protocol Step 1
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28 BD 555725 T Cells culture
Protocol Step 1
PVDF membrane Millipore 168627 Immunoblotting
Protocol Step 3
RPMI 1640 Corning 10-040-CVRC Cell culture
Protocol Step 3
Skim milk powder Yeasen S9129060 Immunoblotting
Protocol Step 3
SKOV3-Luc ATCC HTB-77 Cytotoxicity assay
Protocol Step 4
Trypsin-EDTA NCM biotech C125C1 Cell culture
Protocol Step 4
Tween 20 Sinopharm 30189328 Immunoblotting
Protocol Step 3
Water bath keelrein NB014467 Heating
Protocol Step 1
X-VIVO 15  LONZA 04-418Q Serum-free lymphocyte culture medium
Protocol Step 1

References

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Citer Cet Article
Xue, Y., Mao, Y., Liao, Q., Zhao, C., Zhang, X., Xu, J. Generation and Functional Verification of Hypoxia-Sensitive Chimeric Antigen Receptor-T Cells. J. Vis. Exp. (208), e66697, doi:10.3791/66697 (2024).

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