Summary

Un modèle préclinique de myopathie induite par la septicémie avec inutilisation chez la souris

Published: June 14, 2024
doi:

Summary

Ce modèle murin combine une agression septique avec une inutilisation des muscles des membres postérieurs pour récapituler la caractéristique alitée du patient septique typique. Le modèle représente un changement significatif par rapport aux modèles précédents pour étudier le dysfonctionnement musculaire dans le sepsis et constitue une approche reproductible pour aborder les stratégies thérapeutiques pour traiter cette maladie.

Abstract

La septicémie est l’une des principales causes de décès à l’hôpital. L’amélioration du traitement se traduit par un plus grand nombre de survivants de la septicémie. Environ 75 % des survivants développent une faiblesse musculaire et une atrophie, ce qui augmente l’incidence des réadmissions à l’hôpital et de la mortalité. Cependant, les modèles précliniques disponibles de la septicémie ne tiennent pas compte de la désutilisation des muscles squelettiques, un élément clé pour le développement de la myopathie induite par la septicémie. Notre objectif dans ce protocole est de fournir une ligne directrice étape par étape pour un modèle murin qui reproduit le cadre clinique vécu par un patient septique alité. Des souris mâles C57Bl/6 ont été utilisées pour développer ce modèle. Les souris ont subi une ligature et une ponction cæcales (CLP) pour induire une septicémie. Quatre jours après la CLP, les souris ont été soumises à une suspension des membres postérieurs (HLS) pendant sept jours. Les résultats ont été comparés à ceux d’interventions chirurgicales simulées et/ou d’animaux ayant une marche normale (NA). Les muscles ont été disséqués pour la mécanique musculaire in vitro et les évaluations morphologiques. Le modèle entraîne une atrophie et une faiblesse musculaires marquées, un phénotype similaire observé chez les patients septiques. Le modèle représente une plate-forme pour tester des stratégies thérapeutiques potentielles pour l’atténuation de la myopathie induite par le sepsis.

Introduction

La septicémie est une maladie potentiellement mortelle due à une réponse immunitaire hyperactive qui affecte négativement plusieurs systèmes organiques, ce qui représente un fardeau majeur pour les systèmes de santé du monde entier1. Plus récemment, la mortalité à l’hôpital liée à la septicémie a diminué en raison de l’amélioration de la prise en charge des unités de soins intensifs (USI) 1,2. Cependant, environ 75 % des patients qui survivent à l’agression septique initiale développent une atrophie des muscles squelettiques (p. ex., réduction de la section transversale) et une faiblesse (p. ex., réduction de la capacité de production de force)3,4. Ce phénomène a été caractérisé comme une myopathie induite par la septicémie, fortement liée à une activité physique altérée et à un manque d’indépendance pour effectuer les tâches de la vie quotidienne, entraînant une réhospitalisation et une mortalité dans les cinq ans suivant l’épisodeinitial 5.

En raison d’une infection agressive et généralisée, les patients septiques sont exposés à des périodes prolongées d’alitement pendant leur convalescence en soins intensifs. Dans ce contexte, le muscle squelettique subit une inutilisation sévère, ce qui exacerbe probablement l’atrophie et la faiblesse musculaires 3,4. À l’heure actuelle, aucun traitement n’a permis de traiter efficacement la myopathie induite par la septicémie. Les modèles précliniques disponibles conçus pour traiter la myopathie ont utilisé la ligature et la ponction cæcales (CLP)6, la suspension cæcale7 ou l’injection de lipopolysaccharide purifié (LPS), qui est un composant de la paroi cellulaire chez les bactéries à Gram négatif8. Bien que ces modèles réussissent à transmettre l’infection, ils ne reproduisent pas correctement la désuétude musculaire observée chez les hôtes septiques au-delà d’une réduction naturelle de l’activité physique observée chez les animaux septiques9.

L’objectif principal de cette étude est de fournir une description détaillée de la façon d’exécuter correctement le modèle de myopathie induite par le sepsis avec désuétude chez la souris. Nous démontrons la faisabilité de combiner la CLP comme modèle de septicémie avec la suspension des membres postérieurs (HLS) comme modèle de désuétude pour étudier la myopathie induite par la septicémie chez la souris3. De plus, des résultats représentatifs de la mécanique musculaire et des changements morphologiques typiques en réponse au modèle sont également fournis.

Protocol

Les procédures ont été examinées et approuvées par l’IACUC de l’Université de Floride (#202200000227). Des souris mâles C57BL/6J, âgées de 17 semaines, avec une masse corporelle variant de 27 g à 34 g, ont été utilisées pour la présente étude. Les procédures expérimentales et le calendrier décrits dans ce protocole sont illustrés à la figure 1. Comme indiqué, le protocole s’étend sur un total de 11 jours. Les animaux subissent une chirurgie de survie (CLP/Sham) le jour 0, suivie de quatre jours de soutien hydrique et analgésique. Le jour 4, les animaux commencent le SHN pour une durée de 7 jours. Les expériences terminales sont menées le jour 11. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisé sont répertoriés dans la table des matériaux. 1. Ligature et ponction cæcales (CLP) Après avoir obtenu les animaux de la source commerciale, laissez-les s’acclimater dans l’animalerie pendant au moins 1 semaine avant d’effectuer des chirurgies CLP (ou simulées). Cela aidera à minimiser le stress associé au transport. Hébergez les souris en groupe, en respectant les directives locales de l’IACUC.REMARQUE : En règle générale, les animaux sont logés dans un maximum de 5 souris par cage jusqu’au jour de l’opération. Des cages standard, mesurant 7,25 pouces de largeur, 11,75 pouces de longueur et 5 pouces de hauteur, sont utilisées et meublées avec une litière d’épis de maïs. Un cycle lumière-obscurité de 12h est maintenu, avec les lumières allumées à 7 heures et éteintes à 19 heures. La température du boîtier est maintenue à 20-22 °C et l’humidité relative (HR) est maintenue entre 30 % et 60 %. L’accès ad libitum à un régime alimentaire standard et à de l’eau est assuré. Pour effectuer la CLP, anesthésier l’animal avec de l’isoflurane (2,5 %, 500 mL/min) dans une chambre d’induction. Confirmez l’anesthésie en pinçant la patte avec une pince à épiler. Une fois sous anesthésie profonde, comme le confirme l’absence de retrait réflexe du pincement de la patte, transférer l’animal sous anesthésie continue à l’aide d’un cône nasal (2,5 %, 100-125 mL/min).REMARQUE : Des techniques aseptiques doivent être utilisées tout au long de la procédure. Appliquez une pommade lubrifiante vétérinaire pour protéger les yeux de l’animal contre les dommages ou les blessures potentiels induits par le cône de nez pendant la chirurgie. Pour nettoyer le site chirurgical, utilisez un épilateur disponible dans le commerce. Retirez la fourrure du bas-ventre uniquement, en évitant une surexposition de la peau.REMARQUE : Alternativement, des tondeuses à poils d’animaux peuvent être utilisées, mais des précautions doivent être prises pour éviter d’endommager la peau. Une fois le site chirurgical exposé, nettoyez la zone avec trois applications de povidone iodée (ou un gommage germicide équivalent), suivi d’un rinçage à 70 % d’alcool entre chaque application. Administrez une dose unique de 3,25 mg/kg de buprénorphine à libération prolongée ou équivalent, selon le traitement analgésique approuvé par votre IACUC local. Transférez la souris dans la zone chirurgicale. Isolez le site chirurgical à l’aide d’un champ adhésif. Sous anesthésie profonde, faites une incision médiane ventrale (~2 cm) dans la peau à l’aide d’une lame de scalpel.Utilisez des ciseaux pour séparer la peau de la couche musculaire. À l’aide de la lame du scalpel, faites une incision plus petite (~1 cm) dans la couche musculaire. Une fois les intestins visualisés, à l’aide d’une pince émoussée, localisez le caecum et extériorisez-le. Une fois extériorisé, ligaturez le caïcum à l’aide d’une suture stérile résorbable en polyglactine 5-0. Considérez la zone du caïcum ligaturé, définie comme la distance entre l’extrémité distale du caecum et le point de ligature, car elle contribuera à la gravité de l’infection. Pour reproduire les résultats présentés ici, attachez le caecum à 1 cm de son point distal.REMARQUE : La ligature d’une plus grande zone de caïcum entraînera une augmentation dela gravité 10. À l’aide d’une aiguille de 27 G, perforez le caecum de part en part, permettant au contenu fécal de s’échapper. Avec prudence, pressez doucement le caecum pour extérioriser le contenu fécal. Pour effectuer une chirurgie simulée, suivez les mêmes étapes en exposant l’animal cæcum. Cependant, ne ligaturez pas et ne percez pas le caecum.REMARQUE : La jauge de l’aiguille affecte directement la gravité de l’infection. Pour produire une infection de bas grade, des aiguilles de 26 G à 28 G sont recommandées. Veuillez noter que l’utilisation de jauges d’aiguille plus épaisses entraînera une augmentation du taux de mortalité, et que les animaux peuvent ne pas tolérer la phase de suspension ultérieure des membres postérieurs du protocole. Déplacez le caecum dans la cavité abdominale. Fermez la couche musculaire avec une suture résorbable stérile 5-0. Fermez la peau avec une suture en nylon 5-0 non résorbable. Une fois la suture cutanée terminée, fournir une solution saline stérile (1 mL pour les mâles et 0,5 mL pour les femelles) par injection sous-cutanée dans le dos de l’animal.REMARQUE : Pour fermer la couche musculaire, une technique de suture continue est recommandée, tandis que pour la couche cutanée, une technique de suture interrompue est recommandée. Consultez et conformez-vous aux directives locales de l’IACUC pour la suture en chirurgie de survie. Après l’opération, placez les animaux dans une cage propre sur un matelas chauffant ou un coussin chauffant réglé à 35 °C. Observez la souris toutes les 15 minutes pendant la première heure suivant la récupération de l’anesthésie, après quoi elle peut être renvoyée dans l’établissement d’hébergement.REMARQUE : Fournir une quantité minimale de nourriture sur le sol de la cage pour permettre aux animaux de manger à volonté sans affecter le site chirurgical. Après leur retour à l’établissement, les animaux sont contrôlés deux fois par jour à la suite de l’évaluation des animaux septiques (étape 3). Fournir une solution saline stérile et un analgésique au cours des quatre jours suivants pour permettre à l’incision chirurgicale de guérir.REMARQUE : La surveillance quotidienne de la température de surface des xiphoïdes et du poids corporel permet de tenir des registres précis de la gravité du sepsis11. 2. Suspension des membres postérieurs (HLS) Pour effectuer le HLS, les chercheurs doivent suivre les directives éthiques locales de l’IACUC. Il s’agit notamment de s’assurer de l’utilisation de dimensions de cage et de planchers appropriés, qui sont des aspects cruciaux pour s’adapter à la locomotion, à l’alimentation et aux habitudes d’abreuvement des animaux dans des conditions de SHN.REMARQUE : 4 jours de récupération après la CLP sont recommandés pour la cicatrisation des plaies. Après 4 jours de convalescence après une CLP ou une chirurgie simulée, anesthésier l’animal sous un léger flux d’isoflurane (2,5 %, 100-125 mL/min). Attachez la queue de la souris à une courte chaîne métallique à l’aide de ruban adhésif. Placez la chaîne métallique parallèlement à la queue tandis que le ruban de mousse embrasse fermement la queue et la chaîne ensemble. Pour assurer la suspension des membres postérieurs, attachez la chaîne métallique à un crochet relié à une barre transversale le long du centre de la cage. De plus, fixez une deuxième petite barre qui peut se déplacer le long de la barre transversale pour permettre une plus grande capacité de mouvement à l’animal.REMARQUE : Les animaux doivent être capables de se déplacer via leurs membres antérieurs en utilisant la grille métallique sur le sol de la cage. Ajustez la hauteur des membres suspendus pour éviter le contact des pattes avec les granulés de chow. Surveillez les animaux et nettoyez la zone rasée autour de la peau suturée à la main avec un coton-tige imbibé d’eau au moins deux fois par jour pendant la période de suspension.REMARQUE : Le nettoyage est crucial pour éviter l’infection sur le site de la chirurgie, en particulier les brûlures urinaires dues à la position surélevée du corps. Pour reproduire les résultats, assurez-vous que les animaux subissent 7 jours de suspension des membres postérieurs. La durée a été déterminée sur la base d’études antérieures montrant que le temps minimum requis pour que la suspension des membres postérieurs provoque des effets significatifs sur les muscles squelettiques dans des conditions non septiques12,13.REMARQUE : La survie, l’inconfort ou la détresse de l’animal augmenteront en fonction de la gravité de l’infection. 3. Évaluation des animaux septiques REMARQUE : L’évaluation de l’état clinique de l’animal est un aspect clé du suivi de la gravité après une chirurgie CLP ou une chirurgie fictive. De plus, comme l’exige l’IACUC, des critères d’évaluation sans cruauté doivent être établis pour le bien-être des animaux. Pour répondre à ces préoccupations et fournir des normes pour les soins quotidiens aux animaux, des instructions pour effectuer l’évaluation des animaux à l’aide du score de septicémie murin modifié (MMSS) ont été utilisées14. Utilisez le MMSS (Fichier supplémentaire 1) pour évaluer l’animal. Notez que pour chaque catégorie, un score de 0 représente un animal en bonne santé. Notez l’animal deux fois par jour de 0 à 3 selon la gravité de l’infection. Pour améliorer la précision, mesurez la température de surface des xiphoïdes et le poids corporel deux fois par jour11,15 et enregistrez avec la feuille de score MMSS.REMARQUE : Les fluctuations typiques de la température de surface et du poids corporel des xiphoïdes sont fournies dans la figure supplémentaire 1. Consultez l’IACUC local pour connaître les critères d’évaluation sans cruauté.REMARQUE : Pour reproduire les résultats, les critères suivants ont été utilisés comme critères d’évaluation : (1) Perte de poids corporel >40 % par rapport à la ligne de base. (2) Température 5 °C par rapport à la valeur précédente. (3) Un score de 3 dans les domaines suivants : Réponse au stimulus, niveau de conscience ou qualité de la respiration. (4) MSSS journalier total ≥17. L’évaluation décrite ici est conçue pour être effectuée après la chirurgie et chez les animaux subissant une marche normale. Il est recommandé de ne pas manipuler les animaux subissant un SHN afin d’éviter tout contact entre leurs membres postérieurs et les surfaces. Après l’évaluation finale, euthanasier l’animal selon les recommandations du comité local d’éthique animale.

Representative Results

Pour les données représentatives présentées dans les résultats, des souris C57BL/6J mâles, âgées de 17 semaines, avec une masse corporelle variant de 27 à 34 g, ont été utilisées. L’ensemble du protocole dure onze jours et comprend l’intervention chirurgicale (CLP ou simulacre), le support salin et analgésique (jours 0 à 4) et l’inutilisation du HLS (jours 4 à 11). Des expériences terminales peuvent être effectuées à n’importe quel moment de la phase de suspens…

Discussion

Le protocole actuel fournit des lignes directrices techniques pour la mise en œuvre d’un nouveau modèle préclinique de myopathie induite par le sepsis. Tous les matériaux et les étapes importantes sont décrits en détail pour la reproduction du modèle. Cette approche permet de reproduire le dysfonctionnement des muscles squelettiques observé chez les patients septiques, mettant en évidence le rôle de la désuétude en tant qu’élément crucial dans l’aggravation de la myo…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le AG072011 R21 des NIH à l’OL.

Materials

4-0 Ethicon Coated Vicryl Ethicon D5792 Absorbable suture used for closure of muscle layer and for ligation of the cecum.
4-0 Ethilon Black 18"  Ethicon 662G Non absorbable suture for closure of the skin layer.
BD  PrecisionGlide Needle 26-28 G BD 305136 for 27g needle Needle for puncturing the cecum.
C57BL/6J mice  Jackson Laboratory  strain #000664
Cotton Tipped Applicators Puritan S-18991 Swabs for topical application of iodine.
Cryostat (Leica CM1950)
Dynarex Povidone Iodine Prep Solution Dynarex 1415 Topical Antiseptic Liquid for Skin and Mucosa
Ethanol 200 Proof (100%) Fisher Scientific To make 70% ethanol for cleaning skin.
Hindlimb Suspension Cages Custom Made N/A These custom made cages will be highlighted in the video recordings of the MS.
Optixcare Eye Lube Optixcare Eye lube for protection during survival surgery.
Scalpel blades #11 Fine Science Blade used to make incisions on skin and muscle.
Skin-Trac Zimmer 736579 Foam tape for fixing the tail to the suspension apparatus.
SomnoSuite Low-Flow Digital Vaporizer Kent Scientific Corporation SS-01 Vaporizer for Isoflurane Anesthesia
Tissue bath apparatus  Aurora Scientific Model 800A, Dual Mode Muscle Lever 300C

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Citer Cet Article
Boeno, F. P., Muller, D. C., Aldakkan, A., Li, Z., Reis, G., Barton, E. R., Laitano, O. A Preclinical Model of Sepsis-Induced Myopathy with Disuse in Mice. J. Vis. Exp. (208), e66685, doi:10.3791/66685 (2024).

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