Ici, nous décrivons un protocole simple et économique pour effectuer une quantification non biaisée de la densité microvasculaire pulmonaire pour des tissus pulmonaires de souris entières en utilisant une coloration unique de l’isolectine B4.
L’alternance anormale de l’angiogenèse pulmonaire est liée à un dysfonctionnement microvasculaire pulmonaire et est profondément liée à l’intégrité de la paroi vasculaire, à la régulation du flux sanguin et aux échanges gazeux. Dans les modèles murins, les lobes pulmonaires présentent des différences significatives de taille, de forme, d’emplacement et de vascularisation, mais les méthodes existantes ne tiennent pas compte de ces variations lors de la quantification de la densité microvasculaire. Cette limitation entrave l’étude complète du dysfonctionnement microvasculaire pulmonaire et le remodelage potentiel de la circulation microvasculaire à travers différents lobules. Notre protocole comble cette lacune en utilisant deux méthodes de sectionnement pour quantifier les changements de densité microvasculaire pulmonaire, en exploitant la taille, la forme et la distribution des branches des voies respiratoires à travers des lobes distincts chez la souris. Nous utilisons ensuite la coloration à l’isolectine B4 (IB4) pour marquer les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires sur différentes tranches, suivie d’une analyse non biaisée de la densité microvasculaire à l’aide du logiciel ImageJ disponible gratuitement. Les résultats présentés ici mettent en évidence divers degrés de changements de densité microvasculaire dans les lobules pulmonaires avec le vieillissement, en comparant des souris jeunes et âgées. Ce protocole offre une approche simple et rentable pour la quantification non biaisée de la densité microvasculaire pulmonaire, facilitant la recherche sur les aspects physiologiques et pathologiques de la microvascularisation pulmonaire.
Les cellules endothéliales (CE) sont un type spécial de cellules situées sur la paroi interne des vaisseaux sanguins, couvrant l’ensemble de l’arbre artériel et veineux et jouant un rôle crucial dans le maintien de la stabilité des vaisseaux sanguins et des organes1. Les poumons sont des organes hautement vascularisés et jouent des rôles physiologiques et pathologiques essentiels dans les poumons, tels que la formation de la paroi vasculaire, la régulation du flux sanguin, la facilitation des échanges gazeux, la modulation des réponses inflammatoires, le contrôle de l’activité plaquettaire, la sécrétion de substances régulatrices impliquées dans la croissance vasculaire, la réparation et le maintien de l’équilibre de la coagulation.
Les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires (LMEC) sont des cellules endothéliales spécifiques du tissu pulmonaire, en particulier dans la microvascularisation (capillaires) des poumons, ce qui les distingue des cellules endothéliales artérielles et veineuses plus généralisées des poumons. Ces cellules ont diverses fonctions, notamment la régulation du tonus vasculaire, le contrôle de la perméabilité vasculaire, la participation à la régulation des réponses inflammatoires et la régulation de la formation de thrombus. Ils jouent un rôle crucial dans la circulation pulmonaire, régulant les échanges gazeux et le transport des nutriments, et sont impliqués dans divers processus physiologiques et pathologiques liés aux poumons, probablement pour le vieillissement2. De plus, l’alternance anormale de l’angiogenèse pulmonaire est liée à un dysfonctionnement microvasculaire pulmonaire3. En utilisant le marqueur conventionnel des cellules endothéliales CD31 et la localisation spatiale (en particulier, les régions périphériques des poumons), Larissa L. et al. ont observé une diminution significative de la densité des cellules endothéliales microvasculaires chez les souris âgées (18 mois) par rapport à leurs homologues plus jeunes (4 mois)4. Dans le contexte de la pathologie pulmonaire associée à l’asthme, Makoto H. et al. ont démontré une augmentation substantielle de l’induction vasculaire dans des échantillons de biopsie bronchique colorés avec de l’anti-collagène IV de patients asthmatiques par rapport aux sujets témoins5. Récemment, en introduisant les techniques de transmission et de microscopie électronique à balayage, Maximilian A. et al. ont rapporté une augmentation notable de la densité numérique des caractéristiques liées à l’angiogenèse insensible et germinative chez les patients décédés du Covid-19 ou de la grippe A (H1N1)6. De toute évidence, la genèse microvasculaire anormale est liée à un dysfonctionnement pulmonaire. Cependant, il n’existe actuellement aucune méthode simple et économique pour quantifier les changements de densité microvasculaire.
Dans les modèles murins, les poumons sont conventionnellement segmentés en cinq lobes distincts : crâne droit, milieu droit, caudale droite, crâne gauche et caudale gauche. Chaque lobe présente des caractéristiques uniques en termes de taille, de forme, d’emplacement et de vascularisation probable, contribuant à un échange gazeux efficace et à une régulation potentiellement synergique de la circulation pulmonaire. Cependant, à notre connaissance, aucune méthodologie ne tient compte des différences entre ces lobes pulmonaires lors de l’étude des changements microvasculaires pulmonaires.
Cette étude présente une nouvelle méthode de sectionnement des lobules chez la souris, en utilisant IB4, un marqueur bien défini des cellules micro-endothéliales pulmonaires7, pour une évaluation quantitative non biaisée de la densité microvasculaire pulmonaire. Cette approche novatrice répond au besoin d’une compréhension plus complète des altérations microvasculaires dans les poumons murins en tenant compte des propriétés distinctes des lobes individuels des souris. À titre de démonstration, chez les souris vieillissantes, une réduction significative de la
La densité microvasculaire est observée spécifiquement dans le lobe caudal et le lobe gauche. Le protocole souligne l’importance d’intégrer des analyses spécifiques aux lobes dans les études sur les changements dans le paysage microvasculaire des poumons murins. Cette méthode fournit notamment des références de recherche précieuses pour les chercheurs qui cherchent à comprendre de manière exhaustive la progression physiologique et pathologique des développements et des lésions pulmonaires, allant au-delà de l’angiogenèse.
L’étude de la densité microvasculaire pulmonaire a des implications importantes pour la compréhension des processus physiologiques pulmonaires et aussi pour la définition des biomarqueurs des maladies respiratoires. La circulation pulmonaire présente une grande surface capillaire enveloppée d’une fine couche de cellules endothéliales. La juxtaposition harmonieuse de ces cellules et des cellules épithéliales alvéolaires donne naissance à une fragile membrane alvéolaire-cap…
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs expriment leur gratitude pour le soutien inestimable reçu de la plate-forme expérimentale publique de l’École de pharmacie de Chine occidentale. Nous remercions tout particulièrement Wendong Wang pour avoir fourni des conseils critiques et très précieux sur la pathologie. Cette recherche a été rendue possible grâce au financement du Département des sciences et de la technologie de la province du Sichuan (subventions 2023NSFSC0130 et 2023NSFSC1992) et des « Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales » à TJ.
4% Paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | Tissue Fixative |
4',6-diamidino-2-phenylindole | MCE | HY-D0814 | Nucleic Dyes |
Alexa-647 Fluor Conjugated Isolectin B4 | Thermo | I32450 | Binding Microvessels |
Anti-fluorescent Tablet Sealer | Abcam | AB104135 | Sample Fixation |
Antigen Repair Fluid | Biosharp | BL151A | Repair of Antigenic Sites |
Biopsy Cassette | ActivFlo | 39LC-500-1 | Fixing and Positioning Tissue Samples |
Bovine Serum Albumin | Sigma | B2064-50G | Sealing Solution |
Cold Plate | Leica | HistoCore Arcadia H | Freezing Samples |
Constant Temperature Electric Drying Oven | Taisite | 101-0AB | High Temperature Repair |
Disposable Microtome Blade | Leica | 14035838383 | Cutting Tissue Samples to Prepare Sections |
Embedding Molds | Shitai | 26155166627 | Fixing Tissue Samples |
Ethanol | Kelong | CAS 64-17-5 | Tissue Dehydration Solution |
Heated Paraffin Embedding Station | Leica | EG1150 | Embedding Tssue Samples in Paraffin |
HistoCore Water Bath | Leica | HI1220 | Flatten and Fix Tissue Samples |
ImageJ (Fiji) | NIH | 1.54f | Quantitative Tool |
Immunohistochemistry Pens | Biosharp | BC004 | Water-blocking Agent |
Medical Forceps | Shanghai Medical Equipment | N/A | Grasping, Manipulating, or Moving tissue samples |
Microscope | Nikon | Ts2 | Imaging Device |
Mounting Media | Jiangyuan | Tasteless | Fixing and Preserving Tissue Sections |
Paraffin Wax | SCHLEDEN | 80200-0014 | Fixing Tissue Structure |
PBS | Beyotime | C0221A | Wash Buffer |
Pentobarbital Sodium | Beijing Chemical Reagent Company | Q/H82-F158-2002 | Anesthetic |
Rotary Microtome | Biobase | Bk-2258 | Preparing Slices |
Sterile Scissors | Shanghai Medical Equipment | N/A | segmenting Tissue Samples |
Surgical Scalpel | Shanghai Medical Equipment | N/A | Cutting Tissue Samples |
Triton | Solarbio | T8200 | Permeabilization Solution |
Wash-Free Slide | PLATINUM PRO | PRO-04 | Fixing Samples for Staining |
Xylene | SUM | XK13-011-00031 | Tissue De-waxing Solution |