Mikroinjektion von Embryonen zur Transgenese bei Drosophila
Summary
Dieser Artikel nimmt die phiC31-Integrase-vermittelte Transgenese in Drosophila als Beispiel und stellt ein optimiertes Protokoll für die Mikroinjektion von Embryonen vor, ein entscheidender Schritt für die Entstehung transgener Fliegen.
Abstract
Die Transgenese in Drosophila ist ein wesentlicher Ansatz zur Untersuchung der Genfunktion auf der Ebene des Organismus. Die Mikroinjektion von Embryonen ist ein entscheidender Schritt für die Konstruktion transgener Fliegen. Für die Mikroinjektion sind einige Arten von Geräten erforderlich, darunter ein Mikroinjektor, ein Mikromanipulator, ein inverses Mikroskop und ein Stereomikroskop. Plasmide, die mit einem Plasmid-Miniprep-Kit isoliert wurden, sind für die Mikroinjektion qualifiziert. Embryonen im Prä-Blastoderm- oder Synzytial-Blastoderm-Stadium, bei denen sich die Zellkerne ein gemeinsames Zytoplasma teilen, werden einer Mikroinjektion unterzogen. Ein Zellsieb erleichtert den Prozess der Dechorionisierung von Embryonen. Der optimale Zeitpunkt für die Dechorionierung und Austrocknung von Embryonen muss experimentell bestimmt werden. Um die Effizienz der Mikroinjektion von Embryonen zu erhöhen, müssen die mit einem Abzieher vorbereiteten Nadeln mit einem Nadelschleifer abgeschrägt werden. Beim Schleifen von Nadeln verwenden wir eine Fußluftpumpe mit Manometer, um die Kapillarwirkung der Nadelspitze zu vermeiden. Wir injizieren routinemäßig 120-140 Embryonen für jedes Plasmid und erhalten mindestens eine transgene Linie für etwa 85% der Plasmide. Dieser Artikel nimmt die phiC31-Integrase-vermittelte Transgenese in Drosophila als Beispiel und stellt ein detailliertes Protokoll für die Mikroinjektion von Embryonen zur Transgenese in Drosophila vor.
Introduction
Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist äußerst empfänglich für genetische Manipulationen und genetische Analysen. Transgene Fruchtfliegen sind in der biologischen Forschung weit verbreitet. Seit ihrer Entwicklung in den frühen 1980er Jahren ist die P-Element-Transposon-vermittelte Transgenese für die Drosophila-Forschung unverzichtbar1. In einigen Szenarien wurden auch andere Transposons wie piggyBac und Minos für die Transgenese in Drosophila verwendet2. Transgene über Transposons werden zufällig in das Drosophila-Genom eingefügt, und die Expressionsniveaus von Transgenen an verschiedenen genomischen Loci können aufgrund von Positionseffekten variieren und können daher nicht verglichen werden2. Diese Nachteile wurden durch die phiC31-vermittelte ortsspezifische Transgeneseüberwunden 3. Das Bakteriophagen-Gen phiC31 kodiert für eine Integrase, die die sequenzspezifische Rekombination zwischen den attB- und attP-Stellen in Drosophila3 vermittelt. Viele attP-Andockstellen wurden charakterisiert und sind im Bloomington Drosophila Stock Center 3,4,5,6,7,8,9 verfügbar.
Das phiC31-Transgenese-System für Drosophila wird von der Fliegengemeinschaft in großem Umfang eingesetzt. Unter den attP-Andockstellen sind attP18 auf dem X-Chromosom, attP40 auf dem zweiten Chromosom und attP2 auf dem dritten Chromosom in der Regel die bevorzugten Stellen für die Transgenintegration auf jedem Chromosom, da Transgene an den drei Stellen ein hohes Maß an induzierbarer Expression aufweisen, während sie ein geringes Maß an basaler Expression aufweisen5. Kürzlich fanden van der Graaf und Kollegen jedoch heraus, dass die attP40-Stelle in der Nähe des Msp300-Genlocus und an attP40 integrierte Transgene in Drosophila10 eine nukleare Clusterbildung der Larvenmuskulatur verursachen. In einer anderen aktuellen Studie fanden Duan und Kollegen heraus, dass das homozygote attP40-Chromosom die normale glomeruläre Organisation der Or47b-Geruchsrezeptor-Neuronenklasse in Drosophilastört 11. Diese Ergebnisse legen nahe, dass bei der Planung von Experimenten und der Interpretation von Daten strenge Kontrollen einbezogen werden sollten.
Drosophila ist aufgrund seines kurzen Lebenszyklus, seiner geringen Kosten und seiner einfachen Wartung ein idealer Modellorganismus für die In-vivo-Abfrage der Genfunktion. Das genomweite genetische Screening beruht auf dem Aufbau genomweiter transgener Bibliotheken in Drosophila 12,13,14,15. Wir haben zuvor 5551 UAS-cDNA/ORF-Konstrukte basierend auf dem binären GAL4/Upstream Activating Sequence (GAL4/UAS)-System generiert, das 83% der Drosophila-Gene abdeckt, die beim Menschen in der Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) Gold Collection16 konserviert sind. Die UAS-cDNA/ORF-Plasmide können für die Erstellung einer transgenen UAS-cDNA/ORF-Bibliothek in Drosophila verwendet werden. Die effiziente Mikroinjektionstechnologie für Embryonen kann die Erstellung transgener Fliegenbibliotheken beschleunigen.
Bei der Mikroinjektion von Embryonen wird die Nadelspitze normalerweise gegen ein Deckglasgebrochen 17. Dadurch verstopfen häufig die Nadeln oder verursachen das Austreten großer Mengen an Zytoplasma, und wenn diese Probleme auftreten, müssen neue Nadeln verwendet werden. Obwohl das Anfasen von Nadeln die Effizienz der Mikroinjektion verbessern kann, gelangt die Schleiflösung während des Schleifvorgangs in die abgeschrägte Spitze. Die Mahllösung in der abgeschrägten Spitze verdunstet nicht schnell auf natürliche Weise; Daher können Nadeln nicht direkt nach dem Anfasen für die Mikroinjektion verwendet werden. Diese Faktoren verringern die Effizienz von Mikroinjektionsverfahren für Embryonen. Am Beispiel der phiC31-vermittelten ortsspezifischen Transgenese in Drosophila wird ein Protokoll für die Mikroinjektion von Embryonen zur Transgenese in Drosophila vorgestellt. Um zu verhindern, dass die Schleiflösung in die Nadel eindringt, verwenden wir eine Luftpumpe, die Luftdruck in der Nadel ausübt und so verhindert, dass die Schleiflösung in die abgeschrägte Spitze eindringt. Abgeschrägte Nadeln sind direkt nach dem Anfasen bereit für die Probenbeladung und Mikroinjektion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier stellen wir ein Protokoll für die Mikroinjektion von Embryonen zur Transgenese bei Drosophila vor. Für die phiC31-vermittelte ortsspezifische Transgenese injizierten wir 120-140 Embryonen für jedes Plasmid und erhielten mindestens eine transgene Linie für etwa 85% der Plasmide (Ergänzende Tabelle 2). Unserer Erfahrung nach ist Plasmid-DNA, die mit einem Plasmid-Miniprep-Kit isoliert wurde, für die Transgenese in Drosophila ausreichend. Plasmid-DNA-Konzentrationen von 20 ng/μ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit wurde vom Scientific Research Fund for High-Level Talents der University of South China unterstützt.
Materials
| 100 μm Cell Strainer | NEST | 258367 | |
| 3M double-sided adhesive | 3M | 415 | |
| Borosilicate glass | SUTTER | B100-75-10 | |
| Diamond abrasive plate | SUTTER | 104E | |
| FLAMING/BROWN Micropipette Puller | SUTTER | P-1000 | |
| Foot air pump with pressure gauge | Shenfeng | SF8705D | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma | H8773 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2R | |
| Microinjection pump | eppendorf | FemtoJet 4i | |
| Micromanipulator | eppendorf | TransferMan 4r | |
| Micropipette Beveler | SUTTER | BV-10 | |
| Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm) | CITOLAS | 10211818C | |
| Microscope slides (25 mm x 75 mm) | CITOLAS | 188105W | |
| Petri dish (90 mm x 15 mm) | LAIBOER | 4190152 | |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1026269 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 |
References
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