배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징
Summary
대뇌 피질이 발달하는 동안 뉴런과 신경교세포는 심실 내벽의 심실 영역에서 시작하여 뇌 표면으로 이동합니다. 이 과정에는 많은 유전자가 관여합니다. 이 프로토콜은 이동하는 뉴런과 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징 기술을 소개합니다.
Abstract
대뇌 피질이 발달하는 동안 뉴런과 신경교세포는 심실 내벽의 심실 영역에서 시작하여 뇌 표면으로 이동합니다. 이 과정은 적절한 뇌 기능에 매우 중요하며, 조절 장애는 출생 후 신경 발달 및 정신 장애를 초래할 수 있습니다. 실제로 이러한 질병의 원인이 되는 많은 유전자가 이 과정에 관여하는 것으로 밝혀졌으므로 이러한 돌연변이가 세포 역학에 어떻게 영향을 미치는지 밝히는 것은 이러한 질병의 발병 기전을 이해하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 마우스 배아에서 얻은 뇌 절편에서 이동하는 뉴런과 신경교 전구 세포의 타임 랩스 이미징 기술을 소개합니다. 세포는 자궁 전기천공법 (in utero electroporation)을 사용하여 형광 단백질로 표지되며, 이는 높은 신호 대 잡음비로 심실 영역에서 이동하는 개별 세포를 시각화합니다. 또한, 이 in vivo 유전자 전달 시스템을 사용하면 발현 또는 knockdown/knockout 벡터의 동시 전기천공을 통해 주어진 유전자에 대한 Gain-of-Function 또는 Loss-of-function 실험을 쉽게 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하면 고정된 뇌에서는 절대 얻을 수 없는 정보인 개별 세포의 이동 행동과 이동 속도를 분석할 수 있습니다.
Introduction
대뇌피질(cerebral cortex)이 발달하는 동안, 외측심실(lateral ventricle)을 둘러싸고 있는 팔심실영역(pallial ventricular zone, VZ)에 있는 (정점) 요사상교세포(radial glia)는 먼저 뉴런을 생성하고, 그 다음에는 일부 주기가 겹치는 신경교세포(glial progenitor)를 생성한다1. 뉴런은 또한 VZ에 인접한 뇌실하 영역(SVZ)의 중간 전구 세포 또는 기저 요골 아교세포에서 생성되며, 둘 다 (정점) 요골 아교세포 2,3에서 유래합니다. 마우스에서 요골 신경교세포는 배아 일(E) 12-14일에만 뉴런을 생성하고, E15-16에는 뉴런과 신경교 전구세포를, E17 이후에는4.의 신경교세포를 생성합니다. 이러한 배아 단계에서 생성된 신경교세포(glial progenitor)의 주요 집단은 우선적으로 성상교세포(astrocyte)로 분화하지만, 일부 세포는 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)로 분화하기도 한다5. 이 단계에서 생성된 뉴런과 성상세포(astrocyte) 전구세포는 뇌 표면으로 이동하여 피질판(cortical plate, 미래의 대뇌피질 회백질)으로 들어갑니다. VZ에서 피질판으로의 신경 세포 이동은 여러 단계에서 발생합니다. 뉴런은 먼저 SVZ 또는 중간 영역과 겹치는 다극 세포 축적 영역(MAZ) 바로 위의 다극 형태를 채택하여 여러 얇은 돌기를 격렬하게 확장 및 수축하고 천천히 이동(다극 이동)합니다(다극 이동)6,7. 약 24시간 후, 뉴런은 양극성 형태로 변형되어 두꺼운 선행 돌기를 뇌 표면 쪽으로 확장하고 얇은 후행 돌기를 뒤로 확장하고, 요골 아교세포에서 pial 표면까지 확장되는 방사형 돌기를 골격으로 사용하여 뇌 표면을 향해 선형으로 이동하는데, 이를 운동 모드 2,8이라고 합니다. 운동 모드의 뉴런은 항상 피질판의 가장 바깥쪽 표면에 도달하기 때문에 가장자리 영역 바로 아래의 선행 뉴런을 통과하기 때문에 뉴런은 피질판 9,10,11에서 생년월일에 의존하는 안팎으로 정렬됩니다.
대조적으로, 성상교세포(astrocyte) 전구세포는 중간 영역(intermediate zone)과 피질판(cortical plate)으로 빠르게 이동하며 빈번한 방향 변화를 겪습니다. 이러한 이동 행동은 신경 세포의 이동과는 완전히 다르며, 불규칙한 이동(erratic migration)이라고 불린다5. 성상세포(astrocyte) 전구세포는 또한 혈관 유도 이동(bloodvessel-guided migration)이라고 불리는 과정에서 혈관을 따라 이동합니다. 성상세포(astrocyte) 전구세포는 이러한 이동 모드 사이를 전환하여 피질판(cortical plate) 5,12에 도달합니다. 성상세포(astrocyte)의 위치가 생산 날짜에 의해 엄격하게 결정되는 것은 아니지만, 일찍 태어난 성상교세포(astrocyte)가 피질판의 표피부에 정착하는 경미한 경향이 관찰되었다5. 흥미롭게도, 대뇌피질판에 정착한 성상세포는 배아 단계에서 생성되어 결국 원형질 성상세포로 분화하는 반면, 출생 후에 생성된 성상세포는 활발하게 이동하지 않고 백질에 남아 섬유성 성상세포로 분화한다5. 성상세포(astrocytic) 아형의 이러한 병기 의존적 사양이 어떻게 발생하는지는 불분명하다.
신경 발달 및 정신 장애에 관여하는 유전자를 포함하여 신경 세포 이동에 관여하는 유전자의 수가 점점 더 많이 확인되고 있습니다13,14. 따라서 이러한 유전자의 돌연변이가 이동하는 뉴런의 행동에 미치는 영향을 밝히는 것이 중요합니다. 앞서 언급했듯이 뉴런 이동은 여러 단계에서 발생합니다. 타임랩스 관찰은 주로 영향을 받는 단계(세포 주기 종료, 다극-양극 전이, 이동 속도 등)를 직접 결정할 수 있습니다. 그러나 성상세포의 사양, 이동 및 위치의 기저에 있는 분자 메커니즘은 대부분 알려져 있지 않습니다. 성상교세포(astrocyte)가 뇌 발달 중 시냅토형성(synaptogenesis)15과 혈액뇌장벽(blood-brain barrier) 형성에 중요한 역할을 한다는 점을 감안할 때16, 성상세포의 발달 결함은 신경발달 장애를 초래할 수 있다. 성상교세포 전구세포에 대한 타임랩스 연구는 이러한 분자 메커니즘과 정신 질환과의 관계를 명확히 할 수 있습니다.
이 프로토콜은 대뇌 피질 VZ 유래 세포의 타임 랩스 관찰 방법을 제공합니다. 신경 세포 이동을 관찰하기 위한 유사한 비디오 프로토콜이 이미 발표되었다17. 여기에서는 뉴런과 성상교세포 전구세포를 모두 이동하는 방법을 설명합니다. 이들 세포를 녹색 및 적색 형광 단백질(GFP 및 RFP)과 같은 형광 단백질로 라벨링하기 위해, 적절한 성분을 함유하는 플라스미드 혼합물 을 적절한 단계 18,19,20,21에서 자궁 내 전기천공법에 의해 대뇌 피질 VZ로 도입한다. 조작된 배아는 원하는 단계에서 제거되고, 뇌는 잘게 쪼개져 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 타임랩스 관찰에 사용됩니다. 이동 속도, 방향 및 기타 행동은 고정된 뇌 샘플로는 다루지 않지만 이 방법을 사용하여 검사할 수 있습니다. in utero electroporation을 사용하면 expression 및 knockdown/knockout 벡터를 형광 단백질 벡터와 동시에 쉽게 전달할 수 있으므로 특정 유전자에 대한 Gain-of-Function 및 Loss-of-Function 연구를 수행할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 pallial(cortical) VZ에서 유래한 세포의 타임 랩스 관찰 방법을 도입했습니다. VZ에서 이동하는 세포를 라벨링하기 위해 우리는 자궁 전기천공법(utero electroporation)을 사용했는데, 이 경우 바이러스 벡터 매개 라벨링보다 더 높은 신호 대 잡음비로 개별 세포를 명확하게 라벨링했습니다. 자궁 전기천공법(utero electroporation)에 사용하여, 어떤 조합으로든 모든 유형의 벡터를 살?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tα1 프로모터는 P. Barker와 F.D. Miller의 선물입니다. Dcx 프로모터는 Q. Lu의 선물입니다. hGFAP-Cre는 Albee Messing의 선물입니다. PiggyBac transposon 벡터 시스템은 Sanger Institute에서 제공했습니다. Flt1-DsRed 마우스는 M. Ema (Shiga University)에 의해 제공되었다. 이 연구는 JSPS KAKENHI(JP20H05688 타바타에게 보조금 번호 JP21K07309, K. 나카지마에게 JP22K19365)와 다케다 과학 재단, 교육 연구 진흥을 위한 게이오 기주쿠 후쿠자와 기념 기금, K. 나카지마에 게이오 기주쿠 학술 개발 기금의 지원을 받았습니다.
Materials
| Aspirator tube assembly | Drummond | 2-040-000 | |
| Atipamezole (5 mg/mL) | Meiji | Mepatia | |
| Autoclip | Becton Dickinson | 427630 | 9 mm |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Butorphanol (5 mg/mL) | Meiji | Vetorphale | |
| Cell culture insert | Millipore | PICM ORG 50 | |
| Confocal microscope | Nikon | A1RHD25 | Equipped with a long working distance lens (S Plan Fluor ELWD 20XC) |
| Cryomold | Tissue-Tek | 4566 | |
| Culture chamber | Tokken | TK-NBCMP | Custom-made |
| Electroporator | NEPA Gene | NEPA21 | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Gas mixer | Tokken | TK-MIGM01-02 | |
| Glass base dish | Iwaki | 3910-035 | Diameter of glass base is 27 mm |
| Glass capillaries | Narishige | GD-1 | |
| HBS (2x) | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| HBSS(-) | Wako | 084-08345 | |
| Heater Unit | Tokken | TK-0003HU20 | Custom-made, including hood and heater |
| hGFAP-Cre | Addgene | #40591 | A gift from Albee Messing |
| ImageJ | https://imagej.net/ij/ | ||
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | 25030 | |
| Low melting temperature agarose | Lonza | 50100 | |
| Medetomidine (1 mg/mL) | Meiji | Medetomin | |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Sandoz | Midazolam | |
| MTrackJ | https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ | ||
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| pCAG-hyPBase | The hyPBase cDNA from pCMV-hyPBase (a gift from Sanger Institute) was inserted into the downstream of the CAG promoter of pCAGGS (a gift from J. Miyazaki). | ||
| pDcx-Dre | The Dcx promoter from Dcx4kbEGFP70 (a gift from Q. Lu) was exchanged with CAG promoter of pCAG-NLS-HA-Dre34 (a gift from Pawel Pelczar, Addgene #51272). | ||
| Penicillin + Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plasmid purification kit | Invitrogen | PureLink HiPure plasmid midiprep kit (K210005) | |
| pPB-CAG-LNL-RFP | CAG-LNL cassette from pCALNL-DsRed (a gift from Connie Cepko, Addgene #13769), and TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). | ||
| pPB-CAG-rDIO-EGFP | The sequence containning synthetic rox sites, synthetic DIO cassette, and EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) in reverse direction were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). The sequence is provided in the Supplementary File. | ||
| Puller | Narishige | PN-31 | |
| StackRed | a plugin for ImageJ | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ | |
| Suture needle | Nazme | C-24-521-R No.1 | 1/2 circle, length 14 mm |
| Suture thread | Nazme | C-23-B2 | Silk, size 5-0 |
| Timed pregnant ICR (wild-type) mice | Japan SLC | ICR mouse | |
| TrackMate | https://imagej.net/plugins/trackmate/index | ||
| Tweezer-type electrode | BEX or NEPA Gene | CUY650P5 | |
| Tα1-EGFP | EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) was inserted into the downstream of the Tα1 promoter in plasmid 253 (a gift from P. Barker and F.D.Miller) | ||
| Vibrating microtome | Leica or Zeiss | Vibrating blade microtome VT1000S or Hyrax V50. |
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