マウス胚脳切片における移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージング

大脳皮質の発達中、側脳室の内側を覆う蒼白心室ゾーン(VZ)の(頂端)橈骨グリアは、最初にニューロンを生成し、次にいくつかの重複する期間¹を伴ってグリア前駆細胞を生成します。ニューロンは、VZに隣接する脳室内ゾーン(SVZ)の中間前駆細胞または基底橈骨グリアからも生成され、どちらも(頂端)橈骨グリア^2,3に由来します。マウスでは、放射状グリア細胞は胚日(E)12-14にニューロンのみを産生し、E15-16ではニューロンとグリア前駆細胞を、E17以降はグリア前駆細胞を産生^{します4。}これらの胚期に生成されたグリア前駆細胞の主要な集団は、優先的にアストロサイトに分化しますが、一部の細胞はオリゴデンドロサイトにも分化します⁵。これらの段階で生成されたニューロンとアストロサイト前駆細胞は、脳表面に向かって移動し、皮質プレート(将来の皮質灰白質)に入ります。VZから皮質板へのニューロンの移動は、複数の段階で発生します。ニューロンは、最初に多極細胞蓄積ゾーン(MAZ)のすぐ上で多極形態を採用し、SVZまたは中間ゾーンと重なり、そこで複数の薄いプロセスを激しく伸縮させ、ゆっくりと移動します(多極移動)^6,7。約24時間後、ニューロンは双極性形態に変化し、脳表面に向かって厚い先行突起を伸ばし、後方に細い後続突起を伸ばし、放射状グリアから小孔表面まで足場として伸びる動径突起を用いて脳表面に向かって直線的に移動する。これをロコモーションモード^と呼ぶ2,8.移動モードのニューロンは常に皮質板の最も外側の表面に到達し、その前身である辺縁帯のすぐ下を通過するため、ニューロンは皮質板^9,10,11において生年月日に応じた裏返しに整列する。

対照的に、アストロサイト前駆細胞は、頻繁に方向を変えながら、中間ゾーンと皮質プレートに急速に移動します。この移動行動は、ニューロンの移動とは全く異なり、不規則な移動⁵と呼ばれる。アストロサイト前駆細胞は、血管誘導移動と呼ばれるプロセスで血管に沿って移動します。アストロサイト前駆細胞は、これらの移動モードを切り替えて皮質プレート^5,12に到達します。アストロサイトの位置は、その産生年代によって厳密に決定されるわけではないが、早期に生まれたアストロサイトが皮質プレートの表層部に定着する穏やかな傾向が観察されている⁵。興味深いことに、皮質プレートに定着したアストロサイトは胚期に生成され、最終的には原形質アストロサイトに分化しますが、出生後に生成されたアストロサイトは活発に移動せず、白質に留まり、線維性アストロサイトに分化します⁵。このアストロサイトサブタイプのステージ依存的な仕様がどのように発生するかは、まだ不明です。

神経細胞の移動に関与する遺伝子の数が増えており、その中には神経発達障害や精神障害に関与する遺伝子も含まれています^13,14。したがって、これらの遺伝子の突然変異が移動するニューロンの振る舞いに及ぼす影響を解明することが重要です。前述のように、ニューロンの移動は複数のフェーズで発生します。タイムラプス観察は、主に影響を受けるフェーズ(細胞周期の終了、多極性-双極転移、移動速度など)を直接決定できます。しかし、アストロサイトの仕様、移動、および配置の根底にある分子メカニズムは、ほとんどわかっていません。アストロサイトがシナプス形成¹⁵や脳の発達における血液脳関門^形成16に重要な役割を果たしていることを考えると、アストロサイトの発達障害は神経発達障害を引き起こす可能性がある。アストロサイト前駆細胞のタイムラプス研究により、これらの分子メカニズムや精神疾患との関係が明らかになるかもしれません。

このプロトコルは、皮質VZ由来細胞のタイムラプス観察の方法を提供します。ニューロンの移動を観察するための同様のビデオプロトコルはすでに公開されています¹⁷。ここでは、移動するニューロンとアストロサイト前駆細胞の両方の方法について説明します。これらの細胞を、緑色および赤色の蛍光タンパク質(GFPおよびRFP)などの蛍光タンパク質で標識するために、適切な成分を含むプラスミド混合物を、適切な段階での子宮内エレクトロポレーションにより皮質VZに導入される18,19,20,21。操作した胚を所望の段階で取り出し、脳をスライスしてレーザー走査型顕微鏡によるタイムラプス観察に用います。移動速度、方向、およびその他の行動は、固定された脳サンプルを使用して対処されることは決してありませんが、この方法を使用して調べることができます。子宮内エレクトロポレーション、発現、ノックダウン/ノックアウトベクターは、蛍光タンパク質ベクターと併用して容易に導入できるため、特定の遺伝子の機能獲得および機能喪失の研究を行うことができます。