Imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali in fette di cervello embrionale di topo

Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, la glia radiale (apicale) nella zona ventricolare palliale (VZ) che riveste il ventricolo laterale produce prima neuroni e poi progenitori gliali con un periodo di sovrapposizione¹. I neuroni sono generati anche da progenitori intermedi o glia radiale basale nella zona subventricolare (SVZ) adiacente alla VZ, entrambi originati dalla glia radiale (apicale) ^2,3. Nei topi, le cellule gliali radiali producono solo neuroni nel giorno embrionale (E) 12-14, sia neuroni che progenitori gliali in E15-16 e progenitori gliali da E17 in poi⁴. La maggior parte della popolazione di progenitori gliali generati durante questi stadi embrionali si differenzia preferenzialmente in astrociti, sebbene alcune cellule si differenzino anche in oligodendrociti⁵. I neuroni e i progenitori degli astrociti generati in queste fasi migrano verso la superficie cerebrale ed entrano nella placca corticale (futura materia grigia corticale). La migrazione neuronale dalla VZ alla placca corticale avviene in più fasi. I neuroni adottano inizialmente una morfologia multipolare appena sopra la zona di accumulo cellulare multipolare (MAZ), sovrapponendosi alla SVZ o zona intermedia, dove estendono e ritraggono vigorosamente più processi sottili e migrano lentamente (migrazione multipolare)^6,7. Dopo circa 24 ore, i neuroni si trasformano in una morfologia bipolare, estendendo un processo di guida spesso verso la superficie cerebrale e un processo di trascinamento sottile all’indietro, e migrano linearmente verso la superficie cerebrale utilizzando un processo radiale che si estende dalla glia radiale alla superficie piale come un’impalcatura, che è chiamata modalità di locomozione ^2,8. Poiché i neuroni in modalità locomozione raggiungono sempre la superficie più esterna della placca corticale, passando attraverso i loro predecessori appena sotto la zona marginale, i neuroni sono allineati in modo dipendente dalla data di nascita dall’interno verso l’esterno nella placca corticale ^9,10,11.

Al contrario, i progenitori degli astrociti migrano rapidamente verso la zona intermedia e la placca corticale, con frequenti cambiamenti direzionali. Questo comportamento migratorio è completamente diverso dalla migrazione neuronale ed è chiamato migrazione erratica⁵. I progenitori degli astrociti migrano anche lungo i vasi sanguigni in un processo chiamato migrazione guidata dai vasi sanguigni. I progenitori degli astrociti passano da una modalità di migrazione all’altra e raggiungono la placca corticale ^5,12. Sebbene il posizionamento degli astrociti non sia strettamente determinato dalla loro data di produzione, è stata osservata una lieve tendenza degli astrociti precoci a stabilirsi nella parte superficiale della placca corticale⁵. È interessante notare che gli astrociti che si depositano nella placca corticale sono generati in stadi embrionali e alla fine si differenziano in astrociti protoplasmatici, mentre gli astrociti generati postnatale non migrano attivamente, rimangono nella sostanza bianca e si differenziano in astrociti fibrosi⁵. Come si verifichi questa specificazione stadio-dipendente dei sottotipi astrocitici rimane poco chiaro.

È stato identificato un numero crescente di geni coinvolti nella migrazione neuronale, compresi quelli coinvolti nei disturbi dello sviluppo neurologico e psichiatrici^13,14. Pertanto, è fondamentale chiarire gli effetti delle mutazioni in questi geni sul comportamento dei neuroni migratori. Come accennato in precedenza, la migrazione neuronale avviene in più fasi. Le osservazioni time-lapse possono determinare direttamente la fase che viene maggiormente interessata (uscita dal ciclo cellulare, transizione multipolare-bipolare, velocità di migrazione della locomozione, ecc.). Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base della specificazione, della migrazione e del posizionamento degli astrociti rimangono in gran parte sconosciuti. Dato che gli astrociti svolgono un ruolo cruciale nella sinaptogenesi¹⁵ e nella formazione della barriera emato-encefalica durante lo sviluppo del cervello¹⁶, i difetti di sviluppo negli astrociti possono causare disturbi dello sviluppo neurologico. Studi time-lapse sui progenitori degli astrociti possono chiarire questi meccanismi molecolari e la loro relazione con la malattia mentale.

Questo protocollo fornisce un metodo per l’osservazione in time-lapse di cellule corticali derivate da VZ. Un protocollo video simile per l’osservazione della migrazione neuronale è già stato pubblicato¹⁷. Qui, descriviamo il metodo sia per i neuroni migratori che per i progenitori degli astrociti. Per marcare queste cellule con proteine fluorescenti, come le proteine fluorescenti verdi e rosse (GFP e RFP), miscele plasmidi contenenti componenti appropriati vengono introdotte nella VZ corticale mediante elettroporazione in utero agli stadi appropriati 18,19,20,21. Gli embrioni manipolati vengono rimossi nelle fasi desiderate e i cervelli vengono affettati e utilizzati per osservazioni time-lapse utilizzando un microscopio a scansione laser. La velocità di migrazione, la direzione e altri comportamenti, che non vengono mai affrontati utilizzando campioni di cervello fissi, possono essere esaminati utilizzando questo metodo. Utilizzando l’elettroporazione in utero, l’espressione e i vettori knockdown/knockout possono essere facilmente trasferiti in concomitanza con vettori proteici fluorescenti, consentendoci di condurre studi di guadagno di funzione e perdita di funzione di geni specifici.