胚胎小鼠脑切片中迁移神经元和神经胶质祖细胞的延时成像

在大脑皮层的发育过程中，侧脑室内衬的肺源脑室区 （VZ） 的（顶端）桡状胶质细胞首先产生神经元，然后产生神经胶质祖细胞，并有一些重叠的周期¹。神经元也来自与 VZ 相邻的脑室下区 （SVZ） 的中间祖细胞或基底放射状胶质细胞，两者都起源于（顶端）放射状胶质细胞 ^2,3。在小鼠中，放射状神经胶质细胞仅在胚胎日 （E） 12-14 产生神经元，在 E15-16 上产生神经元和神经胶质祖细胞，从 E17 开始产生神经胶质祖细胞⁴。在这些胚胎阶段产生的神经胶质祖细胞的主要群体优先分化为星形胶质细胞，尽管有些细胞也分化为少突胶质细胞⁵。在这些阶段产生的神经元和星形胶质细胞祖细胞向大脑表面迁移并进入皮质板（未来的皮质灰质）。神经元从 VZ 到皮质板的迁移分多个阶段进行。神经元首先在多极细胞积累区 （MAZ） 上方采用多极形态，与 SVZ 或中间区重叠，在那里它们大力伸展和缩回多个薄突并缓慢迁移（多极迁移）^6,7。大约 24 小时后，神经元转变为双极形态，向脑表面延伸一个厚的引导过程和一个向后延伸的薄拖突，并使用从放射状胶质细胞延伸到软脑膜表面的放射状过程作为支架向大脑表面线性迁移，这称为运动模式 ^2,8.因为处于运动模式的神经元总是到达皮质板的最外表面，穿过边缘区下方的前身，所以神经元在皮质板中以依赖于出生日期的由内而外的方式排列 ^9,10,11。

相比之下，星形胶质细胞祖细胞迅速迁移到中间区和皮质板，方向频繁改变。这种迁移行为与神经元迁移完全不同，称为不稳定迁移⁵ （erratric migration）。星形胶质细胞祖细胞也沿血管迁移，这个过程称为血管引导迁移。星形胶质细胞祖细胞在这些迁移模式之间切换并到达皮质板 ^5,12。虽然星形胶质细胞的位置并不严格由其产生日期决定，但已经观察到早产星形胶质细胞在皮质板浅表部分沉淀的轻微趋势⁵。有趣的是，定居在皮质板中的星形胶质细胞是在胚胎阶段产生的，最终分化为原生质星形胶质细胞，而出生后产生的星形胶质细胞不会主动迁移，而是留在白质中，并分化为纤维状星形胶质细胞⁵。星形胶质细胞亚型的这种阶段依赖性特征是如何发生的尚不清楚。

已经鉴定出越来越多的参与神经元迁移的基因，包括那些与神经发育和精神疾病有关的基因^13,14。因此，阐明这些基因突变对迁移神经元行为的影响至关重要。如前所述，神经元迁移发生在多个阶段。延时观察可以直接确定主要受影响的阶段（细胞周期退出、多极-双极转变、运动迁移速度等）。然而，星形胶质细胞的规格、迁移和定位的分子机制在很大程度上仍然未知。鉴于星形胶质细胞在大脑发育过程中的突触发生¹⁵ 和血脑屏障形成¹⁶ 中起着至关重要的作用，星形胶质细胞的发育缺陷可能导致神经发育障碍。对星形胶质细胞祖细胞的延时研究可能会阐明这些分子机制及其与精神疾病的关系。

该协议提供了一种对皮质 VZ 衍生细胞进行延时观察的方法。用于观察神经元迁移的类似视频方案已经发布¹⁷。在这里，我们描述了迁移神经元和星形胶质细胞祖细胞的方法。为了用荧光蛋白标记这些细胞，例如绿色和红色荧光蛋白（GFP 和 RFP），通过在适当的阶段通过宫内电穿孔将含有适当成分的质粒混合物引入皮质 VZ 18,19,20,21。在所需阶段取出纵的胚胎，并使用激光扫描显微镜将大脑切片并用于延时观察。使用这种方法可以检查迁移速度、方向和其他行为，这些行为从未使用固定大脑样本解决。在子宫内使用电穿孔、表达和敲低/敲除载体可以很容易地与荧光蛋白载体一起转移，使我们能够对特定基因进行功能获得和功能丧失研究。