Technique d’élevage in vitro pour l’étude de la dynamique cellulaire dans les écailles de poisson-zèbre

Tous les protocoles décrits ici suivent les lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux et ont été approuvés chaque année par le comité de protection des animaux de l’Université Saint Mary’s et de l’Université Mount Saint Vincent sous les numéros de protocole 20-14 et 21-12. Avant d’appliquer ce protocole, les utilisateurs doivent s’assurer que les lignes directrices fédérales et provinciales sur l’utilisation des animaux en recherche ou en enseignement sont respectées23. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux. 1. Préparation des réactifs pour la culture de tartre Préparez le milieu DMEM avec HEPES (10 g de poudre de DMEM, 5,95 g de HEPES, dans 1 L d’eau distillée ou dH2O, pH : 6,91), aliquotez-vous et conservez-le à 4 °C. Préparez le milieu de culture – solution de travail (88 % de milieu DMEM avec HEPES, 10 % de sérum fœtal bovin et 2 % de pénicilline-streptomycine [5000 unités de pénicilline et 5 mg de streptomycine par ml] ajustée au volume nécessaire le jour de la réalisation de l’expérience.REMARQUE : La solution de travail doit être préparée fraîche tous les jours et ne peut pas être conservée. Le milieu de culture doit être conservé au froid (à 4 °C ou sur glace) jusqu’à ce qu’il soit utilisé. Aliquote la solution de travail du milieu de culture dans les récipients dans lesquels l’expérience sera réalisée. Dans ce cas, des tubes de 0,2 mL ou une plaque de 96 puits ont été utilisés. Conservez ces aliquotes sur de la glace jusqu’à ce que vous en ayez besoin.REMARQUE : Cette solution doit être préparée fraîche et ne peut pas être conservée plus de 1 jour. Voir le tableau 1 pour tous les réactifs. 2. Retirer les écailles des poissons vivants Préparez un récipient ou un réservoir pour le poisson-zèbre avec un volume d’eau d’environ 2 L pour 4-5 poissons adultes.REMARQUE : Les paramètres typiques de l’eau qui conviennent au poisson-zèbre sont pH 7,5, température 28,5 °C, conductivité 640-781 μS et un cycle de lumière sombre de 12-12 heures. Assurez-vous que la température est constamment maintenue dans le réservoir. Utilisez un filet de pêche pour capturer 4 à 5 poissons-zèbres adultes et placez-les dans le réservoir de stockage de poisson-zèbre préparé ci-dessus. Préparez un contenant d’au moins 60 ml d’eau où le poisson sera anesthésié.REMARQUE : Le poisson doit pouvoir se déplacer dans le récipient et être suffisamment profond pour l’empêcher de sauter. Ce récipient doit contenir du méthane-sulfonate de tricaïne tamponné à 0,01 % (MS222), qui doit être composé d’eau de poisson-zèbre (dilué à 0,1 % de MS222, qui est préparé avec 0,3 g de MS222, 615 μL de 1 M de NaOH dans 300 mL de système d’eau de poisson zèbre, dix fois).ATTENTION : Les personnes qui mènent ces expériences doivent avoir l’approbation du comité d’éthique animale de l’établissement pour capturer, anesthésier et manipuler le poisson-zèbre. De même, l’anesthésique utilisé est une faible concentration de méthane-sulfonate de tricaïne (MS222), qui est un produit chimique couramment utilisé en biologie des poissons, mais qui nécessite une manipulation appropriée, comme un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants en nitrile jetables, des lunettes de sécurité/lunettes anti-éclaboussures et une blouse de laboratoire (voir la fiche de données de sécurité du MS222 pour plus d’informations). Préparez un contenant de récupération avec les mêmes spécifications que celles utilisées précédemment à l’étape 1 (au moins 2 L d’eau) où le poisson sera placé après l’enlèvement des écailles. Ce récipient doit avoir suffisamment d’espace et les bons paramètres d’eau, comme indiqué ci-dessus. À l’aide d’un filet, transférez avec précaution un seul poisson-zèbre adulte dans le récipient contenant 0,01 % de MS222. Attendez que le poisson soit complètement immobile et qu’il ait un mouvement operculaire minimal (cela prend généralement moins de 10 minutes).REMARQUE : Toute cette étape est effectuée un poisson à la fois. Ne pas anesthésier le poisson suivant tant que les écailles n’ont pas été retirées avec succès du poisson manipulé et que ce poisson n’a pas été transféré dans le récipient de récupération. Placez individuellement le poisson-zèbre adulte sur une boîte de Pétri inversée recouverte d’une serviette en papier humide. À l’aide d’un stéréomicroscope de dissection et à l’aide d’une pince fine, retirez un maximum de 10 à 12 écailles d’un poisson. Les écailles sont retirées de la région latérale du poisson, où les écailles sont plus grandes et ont une taille plus constante par rapport aux autres parties du corps (figure 2). Les deux côtés du poisson peuvent être utilisés.Retirez les écailles une à la fois en tirant doucement dans la direction naturelle de l’écaille (c’est-à-dire dans la direction de l’avant vers l’arrière). Cela doit être fait le plus rapidement possible. Placez chaque balance dans un tube séparé de 0,2 mL contenant la solution de travail du milieu de culture des cochenilles (préparée à l’étape 1.1) pour éviter que les cochenilles ne se dégradent. Une plaque à 96 puits peut être utilisée comme alternative.REMARQUE : L’isolement des balances individuelles dans des tubes ou des puits séparés empêche les balances de coller ensemble et permet le suivi des balances individuelles qui peuvent être nécessaires pour plusieurs expériences. Si l’expérience spécifique nécessite un traitement à l’échelle, appliquez-le à cette étape. Pour obtenir des exemples de certains protocoles, reportez-vous aux étapes 4 et 5. Placez les tubes avec les balances dans un incubateur à 28 °C. Le milieu de culture doit être changé toutes les 24 heures (avec la solution de travail du milieu de culture). Un incubateur sansCO2 a été utilisé pour les expériences décrites ici. Après l’enlèvement des écailles, remettez soigneusement le poisson-zèbre dans le réservoir de récupération et surveillez jusqu’à ce que le mouvement reprenne. Une pipette ou une pierre d’aération est utilisée pour fournir de l’air dans le réservoir afin d’accélérer la récupération. Une fois le mouvement rétabli, remettez le poisson-zèbre dans un bassin d’élevage régulier. N’oubliez pas de garder les poissons qui ont été utilisés séparément de tous les autres poissons afin qu’ils puissent se rétablir séparément et de garder une trace des poissons qui régénèrent activement leurs écailles. Attendez ~2 semaines avant de répéter l’ablation des écailles de ces mêmes poissons. Cela leur laisse le temps de régénérer naturellement leurs écailles. 3. Fixation des écailles Lavez les balances trois fois avec 200 μL de 1x de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) préparée à partir de 10x PBS (pour 1 L, ajoutez 80 g de NaCl, 2 g de KCl et 11,2 g de Na2HPO4, ajoutez dH2O jusqu’à 1 L). Retirez le 1x PBS et ajoutez 200 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pendant la nuit à 4 °C. Pour 100 ml de PFA, ajoutez 4 g de paraformaldéhyde et 0,1 g de NaOH, puis ajoutez 1 fois le PBS jusqu’à 100 ml. Mélangez sur une plaque chauffante réglée à feu doux et remuez jusqu’à ce que la solution soit claire, puis laissez la solution refroidir et stabiliser le pH à 7,4. Conserver à -20 °C. Pour plus de détails, veuillez consulter le Fichier supplémentaire 1 (Tableau 1). Après la fixation, lavez les balances trois fois avec 200 μL de 1x PBS. Stockez les balances à 4 °C.ATTENTION : Le PFA est nocif. Reportez-vous à la fiche de données de sécurité pour plus d’informations. Tous ces processus nécessitent une manipulation appropriée, comme un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants en nitrile jetables, des lunettes de sécurité/lunettes anti-éclaboussures et une blouse de laboratoire. 4. L’homéostasie osseuse REMARQUE : Deux procédures d’homéostasie osseuse sont décrites ci-dessous. La coloration à la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP) et au phosphate alcalin (AP) est généralement utilisée pour identifier les ostéoclastes et les ostéoblastes actifs, respectivement. Les ostéoclastes résorbent la matrice osseuse tandis que les ostéoblastes déposent la matrice osseuse. L’AP est la principale enzyme libérée par les ostéoblastes lors de la formation osseuse, tandis que la TRAP est sécrétée par les ostéoclastes dans l’espace acide entre l’ostéoclaste et la matrice osseuse, aidant à la dégradation et à la résorption osseuses 24,25,26. Ce protocole est également disponible sur The Zebrafish Information Network27et a été publié précédemment28. La phosphatase alcaline est une enzyme produite par plusieurs types de cellules dans le cadre du processus métabolique. Ce processus n’est pas entièrement spécifique aux ostéoblastes, mais dans le tissu osseux, il est utilisé comme marqueur de la fonction des ostéoblastes. Coloration à la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP)Placez chaque balance fixe dans un tube de 0,2 mL ou une plaque à 96 puits avec 200 μL de dH2O. Lavez les balances en ajoutant et en retirant environ 150 μL de dH2O pendant 15 minutes trois fois. Pour plus de détails, veuillez consulter le Fichier supplémentaire 1 (Tableau 2). Retirez les écailles du tube ou du puits de 0,2 mL et placez-les dans un nouveau tube contenant 200 μL de tampon de tartrate de 50 mM. Incuber 1 h à température ambiante.Pour 100 mM de tampon de tartrate, préparez un récipient en verre, ajoutez 2,3 g d’acide tartrique et mélangez-le avec un tampon d’acétate 0,2 M (pH 5,5) jusqu’à ce que 100 mL de solution. Bien mélanger et conserver à 4 °C. Pour préparer 50 mM de tampon de tartrate, ajoutez des volumes égaux de dH2O et 100 mM de tampon de tartrate. Pour plus de détails, veuillez consulter le fichier supplémentaire 1 (tableau 3 et tableau 4). Retirer le tampon de tartrate du tube et ajouter 200 μL de solution de substrat TRAP. Incuber les échantillons pendant 1 h à température ambiante. Assurez-vous que les échantillons restent dans l’obscurité.Préparez un récipient en verre foncé et ajoutez 30 ml de tampon de tartrate de 100 mM, 1 mL de PRS hexazotisé (solution de chlorhydrate de pararosaniline) et 2 mL de solution de substrat enzymatique. Bien mélanger.REMARQUE : Cette solution ne peut pas être stockée ; Gardez-le dans l’obscurité à température ambiante pendant l’utilisation. Pour les solutions nécessaires à la préparation de la solution de substrat TRAP, veuillez consulter le fichier supplémentaire 1 (tableaux 5 à 9). Retirez la solution de substrat TRAP et lavez les écailles en ajoutant et en enlevant environ 150 μL de dH2O pendant 15 min, trois fois. Retirez les écailles du tube et placez-les dans un nouveau tube ou un puits avec 200 μL de glycérol à 80 % (pour 100 ml, mélangez 80 ml de glycérol avec 20 mL de dH2O) enveloppés dans du papier d’aluminium pour éviter la décoloration et stockez-les à 4 °C. Pour visualiser les écailles au microscope, utilisez une lame de dépression ou concave. Coloration au phosphate alcalin (AP)Placez chaque balance fixe dans un tube de 0,2 mL ou une plaque à 96 puits avec 200 μL de dH2O et lavez-les en ajoutant et en retirant environ 150 μL de dH2O pendant 15 min, trois fois. Pour plus de détails, veuillez consulter le Fichier supplémentaire 1 (Tableau 2). Retirez les écailles des tubes ou des puits de 0,2 mL et placez-les dans un nouveau tube contenant 200 μL de tampon tris-maléate et incubez-le pendant 1 h à température ambiante.Pour ce tampon, préparez un récipient en verre et ajoutez 0,605 g de tampon tris et 0,55 g d’acide maléique. Ajouter dH2O jusqu’à 25 mL et bien mélanger. Stabiliser à pH 8,3. Conserver à 4 °C. Pour plus de détails, veuillez consulter le fichier supplémentaire 1 (tableau 10). Retirer le tampon tris-maléate du tube et ajouter 200 μL de solution de substrat AP. Incuber 1 h à température ambiante. Assurez-vous que les échantillons restent dans l’obscurité.Pour cette solution, préparez un récipient en verre foncé, ajoutez 8 mg de sel de diazonium et mélangez-le avec 0,1 ml de phosphate de napthol-AS-TR dans du N,N-diméthylformamide et 10 ml de tampon de tris-maléate (pH 8,3), en remuant bien. Préparez cette solution fraîche. Pour plus de détails, veuillez consulter le Fichier supplémentaire 1 (Tableau 11). Retirez la solution de substrat AP et lavez les écailles en ajoutant et en enlevant 200 μL de dH2O pendant 15 min, trois fois. Retirez les écailles du tube et placez-les dans un nouveau tube ou un puits avec 200 μL de glycérol à 80 % enveloppé dans du papier d’aluminium pour éviter la décoloration. Conserver à 4 °C. Pour visualiser les écailles à l’aide d’un microscope, placez les écailles sur une lame concave ou de dépression.ATTENTION : La plupart des réactifs utilisés dans la coloration TRAP et AP peuvent être nocifs. Reportez-vous à la fiche de données de sécurité de chaque produit chimique. Toutes ces procédures nécessitent une manipulation appropriée, comme un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants en nitrile jetables, des lunettes de sécurité/lunettes anti-éclaboussures et une blouse de laboratoire. 5. Visualiser la dynamique cellulaire dans les écailles de poisson-zèbre REMARQUE : Une gamme de méthodes de coloration peut être utilisée pour visualiser les différences entre les échelles et pour étiqueter les cellules à l’intérieur de l’échelle (Figure 3B). Par exemple, les méthodes de coloration des noyaux et des lysosomes dans les cellules de l’échelle sont décrites ci-dessous. Coloration DAPI pour la visualisation des noyaux cellulairesREMARQUE : Le DAPI est utilisé pour marquer les noyaux de toutes les cellules en marquant l’ADN. Le DAPI est un marqueur fluorescent qui se lie fortement aux régions enrichies en adénine et en thymine dans les séquences d’ADN.Avant d’utiliser le DAPI, assurez-vous que les balances sont fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % (étape 3). Lavez les balances avec 200 μL 1x PBS pendant 5 min après la fixation. Préparez une solution de travail DAPI dans une dilution de 1:10 comme suit. Mélangez 1 μL de DAPI avec 9 μL de 1x PBS pour obtenir un volume total de 10 μL. Après avoir préparé la solution de DAPI, à l’aide d’une pince ou d’une pipette en plastique, placez la balance sur une lame concave, retirez l’excès de PBS et ajoutez environ 10 μL de la solution de DAPI préparée.REMARQUE : Le DAPI colorera immédiatement l’écaille, de sorte qu’elle peut être visualisée à l’aide d’un microscope à fluorescence avec une longueur d’onde d’excitation de 352 à 402 nm et une longueur d’onde d’émission de 417 à 477 nm. Le DAPI colorera tous les noyaux cellulaires d’une couleur bleu vif. Afin de voir toute l’échelle dans le champ de vision, l’objectif 4x a été utilisé. Des noyaux colorés simples sont visibles à l’aide de l’objectif 20x. Comptez le nombre de noyaux colorés au DAPI afin de déterminer le nombre de cellules dans l’échelle. Coloration apoptotique pour la visualisation de la mort cellulaire dans des échantillons vivantsREMARQUE : Des colorants fluorescents peuvent être utilisés pour marquer les cellules apoptotiques. Par exemple, le protocole de marqueur de fluorescence utilisé ici est destiné aux environnements acides et peut être utilisé pour le marquage et le traçage d’organites acides comme les lysosomes. Une augmentation du nombre de ces organites est corrélée à une augmentation de la mort cellulaire. Cette coloration doit être appliquée sur des écailles non fixées qui sont soit fraîchement arrachées, soit cultivées jusqu’à 2 jours.Préparez une solution de colorant fluorescent pour le suivi de l’apoptose selon les instructions du fabricant en utilisant le milieu de culture comme diluant.REMARQUE : La concentration de la coloration fluorescente peut changer radicalement en fonction de la méthode d’apoptose utilisée. Reportez-vous au protocole commercial de la coloration de votre choix pour des détails spécifiques sur les concentrations recommandées. Retirez délicatement le milieu de culture de chaque tube ou puits de 0,2 mL d’une plaque à 96 puits si les écailles ont déjà été cultivées. Ajoutez suffisamment de solution de coloration fluorescente pour couvrir toute la balance (environ 50 μL). Couvrez tous les tubes de papier d’aluminium pour éviter qu’ils ne se décolorent et laissez agir 30 min. Retirez la solution de coloration fluorescente des tubes ou des puits. Lavez les échantillons en ajoutant 200 μL de 1x PBS dans les tubes ou les puits pendant 5 min. Retirer le PBS et ajouter 200 μL de PFA à 4 % dans les tubes ou les puits pour fixer les échantillons pendant 1 h à température ambiante. Laver les échantillons en ajoutant 200 μL 1x PBS dans les tubes ou les puits pendant 5 min. Transférez les balances dans un nouveau tube ou puits de 0,2 ml et ajoutez 200 μL de PBS frais 1x. Couvrez ces tubes/puits dans du papier d’aluminium pour éviter la décoloration. Conserver à 4 °C. Pour visualiser les échelles à l’aide d’un microscope à fluorescence, utilisez une lame concave ou à dépression et le bon filtre. Le signal fluorescent utilisé ici a une excitation et une émission maximales de 577-590 nm. La coloration fluorescente montre des cellules apoptotiques contenant des lysosomes en rouge. Comptez le nombre de cellules colorées afin de déterminer le nombre de cellules subissant l’apoptose.REMARQUE : Une feuille d’aluminium est utilisée pendant la coloration et le stockage pour éviter la décoloration. Les échantillons peuvent être conservés dans l’obscurité pendant quelques heures, voire quelques jours, selon la coloration fluorescente utilisée. Pour conserver les échantillons fluorescents pendant de plus longues périodes, utilisez un protocole de fixation et de montage compatible avec le colorant fluorescent. Toutes les couleurs fluorescentes ont été visualisées à l’aide d’un microscope à fluorescence avec un grossissement d’au moins 20x. Le filtre utilisé était le suivant : pour DAPI 417-477 nm ; pour le suivi de l’apoptose 577-590 nm.