単一粒子極低温電子顕微鏡の最終スタックにおける粒子の大部分の除去による密度マップの強化

1. インストール GPUアクセラレーション環境の確認と設定ターミナルを開き、コマンド nvidia-smi を入力します。コマンドがGPUカードに関するすべての情報を正常に表示し、CUDAバージョンが10.2より後であることを確認してください。conda -V コマンドを実行して、Conda がインストールされているかどうかを確認します (補足図 1)。 仮想環境を構成する次のコマンドを入力して仮想環境を設定し、CRYOSIEVE_ENV を目的の環境名に置き換えます: conda create -n CRYOSIEVE_ENV python=3.8 cudatoolkit=10.2 cupy=10.0 pytorch=1.10 -c pytorch -c conda-forge。環境が正常に構成されるまで数分待ちます (補足図 2)。注: ユーザーは、必要に応じて環境名を柔軟に変更できます。提供されるコマンドは CUDA 10.2 に固有です。別の CUDA バージョンが必要な場合は、cudatoolkit のバージョン番号を調整してください。 CryoSieveをインストールするコマンド conda activate CRYOSIEVE_ENV を実行して、環境をアクティブ化します。pip install cryosieveまたはconda install -c mxhulab cryosieveを実行して、ソフトウェアをインストールします(補足図3)。cryosieve -h と入力し、ヘルプ情報が正しく表示されていることを確認します (補足図 4)。 2.粒子ふるい分け データを取得するEMPIAR-10097 最終スタックデータセットを EMPIAR からダウンロードします (資料の表を参照)。Github から Star ファイル、マスク ファイル (mask.mrc)、初期モデル (再推定ステップ用、initial.mrc) をダウンロードします (資料の表を参照)。これらすべてのファイルを一緒にフォルダに配置します(補足図5)。注: https://github.com/mxhulab/cryosieve-demos のリポジトリは、Git Large File Storage (Git LFS) を利用しています。Git LFS のインストールは、リポジトリ全体をクローンするために不可欠です。または、GitHubリンクからファイルにアクセスし、[Download raw file ]ボタンをクリックして個々のファイルをダウンロードします。 プロセス粒子ふるい分けターミナルを開き、コマンド cd FILEPATH を使用して、データセットが配置されているフォルダーに移動します。conda activate CRYOSIEVE_ENV を使用して Conda 環境をアクティブ化します。 次のコマンドを入力して、粒子ふるい分け実験を開始します: cryosieve –reconstruct_software relion_reconstruct –postprocess_software relion_postprocess –i T40_HA_130K-Equalized_run-data_CryoSPARC_refined.star –o output/ –mask mask.mrc –angpix 1.3099979 –num_iters 10 –frequency_start 40 –frequency_end 3 –retention_ratio 0.8 –sym C3 –num_gpus 1 –balance (補足図5)。実行中、ターミナルには各イテレーションの出力ログが表示されます。注: 各オプションの詳細な手順については、 補足ファイル 1 を参照してください。処理時間と実行の最小要件については、 補足ファイル 2 に詳しく説明されています。T40_HA_130K-Equalized_run-data_CryoSPARC_refined.starは、方位推定技術の進歩による影響を軽減するために、TCryoSPARCによってT40_HA_130K-Equalized_run-data.star（EMPIARからダウンロード）から改良されました。 3. 最適なイテレーションを見つける 解像度を確認するコマンド grep “+ FINAL RESOLUTION:” output/_postprocess*.txt を使用して、ふるい分けの 10 回の反復の解像度結果を印刷します (図 1)。7回目の 反復でフィルタリングされたパーティクルスタックは、最も少ないパーティクルで最高の解像度を持つため、最適な結果が得られる可能性があります。注:廃棄されたパーティクル15から保持されたパーティクル15への意図しない情報転送を回避し、パーティクルスタックがポストする第7の反復が実際に最適であることを確保するために、ユーザは、近くの反復に対して再推定ステップを実行する必要があります。このプロトコルでは、イテレーション 4、5、6、7、および 8 が検証の対象となります。 ふるいにかけた粒子のインポートCryoSPARCのWebインターフェースを開き、次の手順に従います:ワークスペースに入り、パネルの右上にある [ビルダー ]ボタンをクリックします。パネルで、[ Import Particle Stack ] オプションを選択してクリックします。[Particle Stack Import] パネルの [Parameters] セクションで、完成した結果の出力フォルダにある [Particle] メタパスを _iter{n}.star ファイルとして指定し、mrcs ファイルが保存されているフォルダへのパーティクル データ パスを指定します。「 Queue Job 」ボタンをクリックし、「 Queue 」ボタンをクリックしてプロセスを開始します。同じ方法を使用して、再推定が必要な残りの反復をインポートします (補足図 6A)。 初期モデルのインポートパネルの右上にある [ビルダー ]ボタンをクリックします。パネルで、[ Import 3D Volumes ]オプションを選択してクリックします。 ボリューム・データ・パスをinitial.mrcファイルとして指定します。 [Queue Job ] ボタンをクリックし、[ Queue ] ボタンをクリックしてプロセスを開始します (補足図 6B)。注: 初期モデルは、 ab initio 再構成 (補足ファイル 3) によって生成することもできます。 均質な改良 (ビルド ジョブ)パネルの右上にある [ビルダー ]ボタンをクリックします。パネルで、[ Homogeneous Refinement ]オプションを選択してクリックします。注:不均一なリファインメントも適用されます。 均質なリファインメント(インポート粒子)左側のメインパネルで、5番目の 反復 (または目的の反復) のパーティクルスタックをインポートするジョブを開きます。インポートしたパーティクルモジュールをメインパネルの右側からドラッグし、右側のビルダーのパーティクルスタックセクションにドロップします。メインパネルの右上隅にある赤い X をクリックして、Import Particle Stackジョブを閉じます。 3Dボリュームをインポートするジョブを開きます。インポートしたボリュームモジュールをメインパネルの右側からドラッグし、右側のビルダーの初期ボリュームセクションにドロップします。 均質なリファインメント (パラメータの変更)[パラメータ]フォールドの下で、[シンメトリ]オプションを見つけて C3 に設定します。[GS分割を強制する]オプションを見つけて無効にします。「 Queue Job 」ボタンをクリックし、「 Queue 」ボタンをクリックして、同種リファインメントを開始します。同じ方法を使用して、残りの反復計算に対して均質な細分化を実行します(補足図6C-D)。注: [GS 分割を強制再実行] オプションは重要です。このオプションを無効にすると、CryoSPARC はスターファイルによって与えられるゴールドスタンダードの分割を保持し、オーバーフィッティングを回避できます。Force Re-do GS Split を無効にする詳細な根拠は、 補足ファイル 4 にあります。 すべてのジョブの実行が終了するまで待ってから、結果を取得します。この結果から、6回目の 反復でフィルタリングされたパーティクルスタックが実際の最適な結果であることが確認されます。注:得られた結果が、このプロトコルで提供された結果からわずかにランダムな偏差を持つのは正常です。これらの逸脱は、全体的な結論に影響を与えません。