폐포 점막 면역 반응을 연구하기 위한 면역 유능한 폐포-온-칩 모델
Summary
Lung-on-chip 모델은 공기-액체 계면과 내피 세포 관류를 모방하여 폐 생리학 연구에 중요한 혈류 및 영양소 교환을 시뮬레이션함으로써 기존 2D 배양을 능가합니다. 이는 폐 연구의 관련성을 높여 호흡기 감염에 대한 이해와 치료를 촉진할 수 있는 역동적이고 생리학적으로 정확한 환경을 제공합니다.
Abstract
우리는 인간의 폐포 구조와 기능을 복제하도록 설계된 고급 면역 역량 있는 폐-온-칩 모델을 소개합니다. 이 혁신적인 모델은 인간 허파꽈리의 환경을 모방한 공기-액체 인터페이스를 지원하는 미세유체 관류 바이오칩을 사용합니다. 조직 공학은 내피 세포, 대식세포 및 상피 세포를 포함한 주요 세포 구성 요소를 통합하여 폐포의 대표 조직 모델을 만드는 데 사용됩니다. 이 모델은 바이러스, 박테리아 및 곰팡이를 포함한 다양한 병원체에 대한 점막 면역 반응에 대한 심층적인 검사를 용이하게 하여 폐 면역에 대한 이해를 증진합니다. 이 프로토콜의 주요 목표는 이 폐포-온-칩 모델을 감염 연구를 위한 강력한 체외 플랫폼으로 확립하기 위한 세부 정보를 제공하여 연구원이 폐 환경 내에서 병원체와 숙주의 면역 체계 간의 복잡한 상호 작용을 면밀히 관찰하고 분석할 수 있도록 하는 것입니다. 이는 혈류 및 내피 세포의 생체 역학적 자극을 포함한 인간 폐포의 주요 생리학적 상태를 시뮬레이션하기 위한 미세유체 기반 기술의 적용을 통해 달성되며, 상피 세포가 공기에 사실적으로 노출되는 데 중요한 공기-액체 인터페이스를 유지함으로써 달성됩니다. 이 모델 시스템은 면역형광 염색, 사이토카인 프로파일링, 콜로니 형성 단위(CFU)/플라크 분석과 같은 다양한 표준화된 분석법과 호환되므로 감염 중 면역 역학에 대한 포괄적인 통찰력을 얻을 수 있습니다. 폐포-온-칩은 다공성 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 막으로 분리된 인간 원위 폐 상피 세포(H441) 및 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)를 포함한 필수 세포 유형으로 구성되며, 상피층과 내피층 사이에 1차 단핵구 유래 대식세포가 전략적으로 배치되어 있습니다. 조직 모델은 체외에서 폐 면역 반응과 관련된 미묘한 요인을 해부하고 분석하는 능력을 향상시킵니다. 가치 있는 도구로서 폐 연구의 발전에 기여해야 하며, 호흡기 감염의 발병 기전을 연구하고 잠재적인 치료 개입을 테스트하기 위한 보다 정확하고 역동적인 체외 모델을 제공해야 합니다.
Introduction
인간의 폐는 폐포 점막의 면역 반응 사이의 복잡한 상호 작용과 함께 호흡과 면역 방어에 놀라운 역할을 합니다1. 효율적인 면역 반응을 생성하는 폐포의 능력은 폐 감염을 예방하고 폐 건강을 확보하는 데 매우 중요합니다. 폐는 박테리아, 바이러스, 곰팡이, 알레르기 및 미립자 물질을 포함한 광범위한 잠재적 위험에 지속적으로 노출되어 있기 때문에 폐포 점막 면역 반응의 복잡성을 이해하는 것은 호흡기 감염, 염증성 질환의 메커니즘을 발견하고 폐 질환을 치료하는 데 매우 중요합니다1.
in vitro에서 호흡기의 감염 및 염증 관련 과정을 연구하려면 폐포 환경과 면역 반응을 충실하게 모방할 수 있는 모델이 필요합니다. 2D 세포 배양 및 동물 모듈은 폐 면역 반응에 대한 생물의학 연구를 위한 필수 도구로 수십 년 동안 사용되어 왔습니다. 그러나 그들은 종종 인간 상황에 대한 번역 잠재력에 한계가 있습니다. Lung-on-chip 모델은 기존의 in vitro 모델과 in vivo 모델 간의 격차를 메우는 데 기여할 수 있으며 인간 특이적 면역 반응을 연구하는 새로운 접근 방식을 제공할 수 있습니다 2,3. Lung-on-chip 모델은 폐 세포가 호흡기의 생리학적 상태를 재현하고 보다 정확하고 견고한 조직 모델을 개발하는 데 필요한 공기-액체 인터페이스를 모방할 수 있습니다. 이 배양 기법을 사용하면 in vitro2에서 세포 분화, 기능 및 약물 또는 질병 관련 자극에 대한 반응을 정밀하게 검사할 수 있습니다.
이 연구에서는 내피 세포의 혈류 및 생체 역학적 자극을 모방하기 위해 관류를 적용하고 공기 위상에 노출된 상피 세포와 공기-액체 인터페이스를 통합함으로써 인간 폐포 환경을 요약하는 효과적인 도구로 인간 폐포의 미세유체 기반 모델을 제시합니다4. 우리는 특히 공기-액체 계면에 중점을 두고 인간 폐포의 물리적 구조와 생물학적 상호 작용을 모방하는 미세유체 관류 폐포 온 칩을 개발했습니다. 이 인터페이스는 호흡기 상피 세포의 분화에 중요한 역할을 하며, 이는 폐 환경을 정확하게 모델링하는 데 필수적입니다. 이 모델은 인간 원위 폐 상피 세포(H441)와 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)를 사용하며, 다공성 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 막으로 분리되어 있으며 세포층 사이에 1차 단핵구 유래 대식세포가 있습니다. 이 설정은 폐포의 복잡한 세포 배열을 복제하며 폐 조직의 생리적 기능에서 중요한 요소인 공기-액체 계면을 정확하게 시뮬레이션하는 데 중요합니다.
모델 개발의 근거는 순환 면역 세포와 조직 상주 면역 세포를 모두 통합하는 것으로 확장됩니다. 이 접근법은 인간 호흡기 감염에 대한 염증성 숙주 반응을 정확하게 모방하도록 설계되어 병원체-숙주 상호 작용을 연구할 수 있는 동적 환경을 제공합니다. 대식세포의 존재는 즉각적인 면역 반응과 병원체와의 상호 작용을 검사할 수 있게 하며, 이는 호흡기 감염에 대한 첫 번째 방어선을 반영합니다. 또한, 바이오칩 플랫폼의 설계는 생체물리학적 및 생화학적 단서를 편리하고 정밀하게 조작할 수 있도록 하며, 이는 체외에서 폐포 기능을 복제하는 데 매우 중요합니다. 이러한 유연성은 인간 감염에 기여하는 요인을 분석하는 데 중요한 역할을 하며, 연구자가 다양한 질병 상태를 반영하도록 조건을 조정하거나 잠재적인 치료 개입을 테스트할 수 있도록 합니다. 고급 현미경 검사, 미생물 분석 및 생화학 폐수 분석을 포함한 여러 판독 기술과 플랫폼의 호환성은 유용성을 향상시킵니다. 이러한 기능을 통해 세포 행동, 병원체 증식 및 면역 반응의 효과 평가를 포함하여 감염에 대한 조직 반응을 포괄적으로 평가할 수 있습니다.
우리는 공기-액체 인터페이스를 복제하고 면역 세포를 통합하여 체외에서 인간 감염을 연구하는 데 중점을 둔 인간 폐포-온칩 모델을 만들고 활용하기 위한 자세한 프로토콜과 기술을 제시합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
폐포-온-칩(alveolus-on-chip) 모델은 인간 폐포의 다층 조직 모델을 나타내며, 폐 상피 세포, 내피 세포 및 대식세포를 포함한 하부 호흡기의 필수 세포 유형을 통합하며, 내피 내벽의 중간 관류와 함께 ALI에서 기관형 배열로 배양됩니다. 서로 다른 층의 세포는 폐 상피 세포의 칼슘 의존성 접착 분자인 E-cadherin과 같은 특정 세포 마커 단백질을 발현하며, 이는 세포 간 상피 장벽을 형성하는 데 핵심적입…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
H.K.와 A.S.M.은 라이프니츠 협회의 전략적 네트워킹(Strategic Networking)이라는 자금 지원을 받는 라이프니츠 사이언스 캠퍼스 감염광 예나(Leibniz Science-Campus InfectoOptics Jena)의 자금 지원을 인정합니다. M.A.와 A.S.M.은 독일 연방하원의 결의안에 기초하여 연방 경제 에너지부(Federal Ministry for Economic Affairs and Energy)가 자금을 지원하는 IGF 프로젝트 IMPROVE의 지원을 받았습니다. A.S.M은 독일의 Excellence Strategy – EXC 2051 – Project-ID 690 390713860에 따라 Cluster of Excellence Balance of the Microverse의 재정 지원을 인정합니다.
Materials
| Consumables | ||
| Cellcounting chamber slides (Countess) | Invitrogen | C10283 |
| Cell culture Multiwell Plates, 24 Well, steril | Greiner Bio-One | 662 160 |
| Cell culture Multiwell Plates, 6 Well, steril | Greiner Bio-One | 657 160 |
| Coverslips (24x40mm; #1.5) | Menzel-Gläser | 15747592 |
| Eco wipes | Dr. Schuhmacher | 00-915-REW10003-01 |
| Eppies 2.0 | Sarstedt | 72.691 |
| Eppis 0.5 | Sarstedt | 72.699 |
| Eppis 1.5 | Sarstedt | 72.690.001 |
| Falcons 15mL | Greiner Bio-One | 188 271-TRI |
| Falcons 50mL | Greiner Bio-One | 227 261-TRI |
| Gauze swab | Noba | PZN 2417767 |
| Gloves Nitril 3000 | Meditrade | 1280 |
| Microscope slides | Menzel-Gläser | AAAA000001##12E |
| Multiwell Plates 24 Well, sterile | Greiner Bio-One | 662 160 |
| Pasteur pipettes (glass) 150mm | Assistent | 40567001 |
| Pasteur pipettes (glass) 230mm | Assistent | 40567002 |
| Round-bottom tubes (PS, 5mL) | Falcon | 352052 |
| Safety-Multifly-Set, 20G, 200mm | Sarstedt | 85.1637.235 |
| Scalpels | Dahlhausen | 11.000.00.715 |
| Serological pipettes 10mL | Greiner Bio-One | 607 160-TRI |
| Serological pipettes 25mL | Greiner Bio-One | 760 160-TRI |
| Serological pipettes 2mL | Greiner Bio-One | 710 160-TRI |
| Serological pipettes 50mL | Greiner Bio-One | 768 160-TRI |
| Serological pipettes 5mL | Greiner Bio-One | 606 160-TRI |
| S-Monovette, 7,5ml Z-Gel | Sarstedt | 1.1602 |
| S-Monovette, 9,0ml K3E | Sarstedt | 02.1066.001 |
| Softasept N | Braun | 3887138 |
| T25 flask | Greiner Bio-One | 690 960 |
| Tips sterile 10µL | Greiner Bio-One | 771 261 |
| Tips sterile 1250µL | Greiner Bio-One | 750 261 |
| Tips sterile 300µL | Greiner Bio-One | 738 261 |
| Tips unsterile 10µL | Greiner Bio-One | 765 290 |
| Tips unsterile 1000µL | Greiner Bio-One | 739 291 |
| Tips unsterile 200µL | Greiner Bio-One | 686 290 |
| Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm) | Roth | K343.1 |
| Chemicals | ||
| Descosept AF | Dr. Schuhmacher | N-20338 |
| Ethanol 96% | Nordbrand-Nordhausen | 410 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5kDa) | Sigma Aldrich | FD4-100MG |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S3023 |
| Methanol | VWR | 20847.295 |
| Saponin | Fluka | 47036 |
| Tergazyme | Alconox | 1304-1 |
| Cell culture | ||
| Collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533-5MG |
| Dexametason | Sigma-Aldrich | D4902 |
| DPBS (-/-) | Lonza | BE17-516F |
| DPBS (+/+) | Lonza | BE17-513F |
| EDTA solution | Sigma-Aldrich | E788S |
| Endothelial Cell Growth Medium | Promocell | C-22020 |
| Endothelial Cell Growth Medium supplement mix | Promocell | C-39225 |
| Fetal bovine Serum | Sigma-Aldrich | E2129-10g |
| H441 | ATCC | |
| Human recombinant GM-CSF | Peprotech | 300-30 |
| Lidocain | Sigma-Aldrich | L5647-15G |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 /-163 |
| RPMI | Gibco | 72400047 |
| Trypane blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 |
| Primary antibodies | ||
| Cadherin-5 / VE-Cadherin (goat) | BD | 610252 |
| CD68 (rabbit) | CellSignaling | 76437 |
| E-Cadherin (goat) | R&D | AF748 |
| SP-A (mouse) | Abcam | ab51891 |
| Secondary antibodies | ||
| AF488 (donkey anti mouse) | Invitrogen | R37114 |
| AF647 (donkey anti mouse) | invitrogen | A31571 |
| AF647 (donkey anti rabbit) | Invitrogen | A31573 |
| Cy3 (donkey anti goat) | jackson research | 705-165-147 |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | Invitrogen | D3571 |
| Microfluidic | ||
| Chip | Dynamic 42 | BC002 |
| Male Luer Lock (small) | ChipShop | 09-0503-0270-09 |
| Male mini luer plugs, row of four,PP, green | Microfluidic chipshop | 09-0558-0336-11 |
| Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque | Microfluidic chipshop | 09-0556-0336-09 |
| Male mini luer plugs, row of four,PP, red | Microfluidic chipshop | 09-0557-0336-10 |
| Plugs | Cole Parmer | GZ-45555-56 |
| Reservoir 4.5mL | ChipShop | 16-0613-0233-09 |
| Tubing | Dynamic 42 | ST001 |
| Equipment | ||
| Autoclave | Tuttnauer | 5075 ELV |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 |
| CO2 Incubator | Heracell | 150i |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 |
| Flowcytometer | BD | FACS Canto II |
| Freezer (-20 °C) | Liebherr | LCexv 4010 |
| Freezer (-80 °C) | Heraeus | Herafreeze HFU 686 |
| Fridge | Liebherr | LCexv 4010 |
| Heraeus Multifuge | Thermo Scientific | X3R |
| Microscope | Leica | DM IL LED |
| Orbital shaker | Heidolph | Reax2000 |
| Peristaltic pump | REGLO Digital MS-4/12 | ISM597D |
| Pipettes 10µL | Eppendorf Research plus | 3123000020 |
| Pipettes 100µL | Eppendorf Research plus | 3123000047 |
| Pipettes 1000µL | Eppendorf Research plus | 3123000063 |
| Pipettes 2.5µL | Eppendorf Research plus | 3123000012 |
| Pipettes 20µL | Eppendorf Research plus | 3123000039 |
| Pipettes 200µL | Eppendorf Research plus | 3123000055 |
| Scale | Sartorius | 6101 |
| Scale | Sartorius | TE1245 |
| Sterile bench | Kojair | Biowizard SL-130 |
| Waterbath | Julabo | SW-20C |
| Fluorescence Microscope Setup | ||
| Apotome.2 | Zeiss | |
| Illumination device | Zeiss | HXP 120 C |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer 5 |
| Optical Sectioning | Zeiss | ApoTome |
| Power Supply Microscope | Zeiss | Eplax Vp232 |
| Software | ||
| ZEN Blue Edition | Zeiss |
References
- Mettelman, R. C., Allen, E. K., Thomas, P. G. Mucosal immune responses to infection and vaccination in the respiratory tract. Immunity. 55 (5), 749-780 (2022).
- Artzy-Schnirman, A., et al. Advanced in vitro lung-on-chip platforms for inhalation assays: From prospect to pipeline. Eur J Pharma Biopharma. 144, 11-17 (2019).
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- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nat Meth. 13 (2), 151-157 (2016).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. A multi-organ chip with matured tissue niches linked by vascular flow. Nat Biomed Eng. 6 (4), 351 (2022).
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- Schicke, E., et al. Staphylococcus aureus lung infection results in down-regulation of surfactant protein-a mainly caused by pro-inflammatory macrophages. Microorganisms. 8 (4), 577 (2020).
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- Hoang, T. N. M., et al. Invasive aspergillosis-on-chip: A quantitative treatment study of human aspergillus fumigatus infection. Biomaterials. 283, 121420 (2022).
- Yuksel, H., Ocalan, M., Yilmaz, O. E-cadherin: An important functional molecule at respiratory barrier between defence and dysfunction. Front Physiol. 12, 720227 (2021).
- Van Roy, F., Berx, G. The cell-cell adhesion molecule e-cadherin. Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).
