EUCAST a développé un protocole de test direct de sensibilité aux antimicrobiens (AST) pour les hémocultures automatisées. Cependant, sa dépendance à l’identification microbienne basée sur la spectrométrie de masse peut être évitée en utilisant un protocole de préparation directe de l’inoculum dans un système automatisé d’identification microbienne. Cette approche permet de fournir des rapports AST dans les 24 heures suivant le prélèvement de l’échantillon.
Le sepsis à Gram négatif (GN) est une urgence médicale où la prise en charge dans des contextes à ressources limitées repose sur des techniques de culture microbiologique conventionnelles qui donnent des résultats en 3 à 4 jours. Reconnaissant ce délai d’exécution (TAT), EUCAST et CLSI ont développé des protocoles pour déterminer les résultats de l’AST directement à partir de flacons d’hémoculture automatisés (+aBC) signalés positivement. Le protocole EUCAST rapid AST (RAST) a été introduit pour la première fois en 2018, où les points de rupture du diamètre de zone pour quatre agents étiologiques courants du septicémie GN, à savoir Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa et le complexe Acinetobacter baumannii peuvent être rapportés. Cependant, les laboratoires cliniques qui ont mis en œuvre cette méthode dans leur flux de travail de routine s’appuient sur l’identification microbienne basée sur la spectrométrie de masse, qui n’est pas facilement disponible, ce qui empêche sa mise en œuvre dans des contextes aux ressources limitées. Pour contourner ce problème, nous avons évalué un protocole d’inoculum direct (DIP) à l’aide d’un système commercial automatisé d’identification microbienne et de test de sensibilité aux antimicrobiens (aMIAST) pour permettre une identification microbienne précoce dans les 8 heures suivant le signalement positif d’aBC. Nous avons évalué ce protocole de janvier à octobre 2023 afin d’identifier les quatre GN À DÉCLARATION RAST (RR-GN) dans l’aBC signalé positivement. Les résultats de l’identification microbienne dans le DIP ont été comparés au protocole standard de préparation de l’inoculum (SIP) dans l’aMIAST. Sur 204 +aBC avec GN monomorphe (+naBC), l’un des 4 RR-GN a été identifié dans 105 +naBC par SIP (E. coli : 50, K. pneumoniae : 20, P. aeruginosa : 9 et complexe A. baumannii : 26). De ce nombre, 94 % (98/105) ont été correctement identifiés par le DIP, tandis que les taux d’erreurs majeures et d’erreurs très importantes étaient de 6 % (7/105) et de 1,7 % (4/240), respectivement. Lorsque la DIP pour l’identification microbienne est effectuée à l’aide de la méthode EUCAST RAST, des rapports cliniques provisoires peuvent être fournis dans les 24 heures suivant la réception de l’échantillon. Cette approche a le potentiel de réduire considérablement le TAT, ce qui permettra l’instauration précoce d’un traitement antimicrobien approprié.
La septicémie, un problème de santé mondial important, est définie comme un dysfonctionnement d’organe potentiellement mortel dû à une réponse déréglée de l’hôte à l’infection. L’étude sur la charge mondiale des maladies a estimé qu’il y avait 48,9 millions de cas de septicémie et 11 millions de décès liés à la septicémie dans le monde en 2017, ce qui représentait près de 20 % de tous les décès dans le monde1. Environ 2/3 des infections du sang (BSI) causant la mortalité sont dues à des agents pathogènes bactériens à Gram négatif2. Les principales causes de mortalité chez les Gram négatifs (GN) sont Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter baumannii, qui représentent environ 40 % des cas parmi 33 bactéries pathogènes2.
Les hémocultures restent la référence pour diagnostiquer l’ISO, et l’identification microbienne rapide ainsi que les résultats des tests de sensibilité aux antimicrobiens (AST) sont la clé de la prise en charge. On a estimé qu’il y a une augmentation de 9 % des risques de mortalité avec un retard d’une heure dans l’instauration d’antimicrobiens appropriés dans le sepsis3. Le délai d’exécution (TAT) des rapports d’hémoculture microbiologiquement positifs avec des résultats AST est d’environ 48 à 72 heures avec les outils microbiologiques disponibles dans les environnements à ressources limitées, même avec des systèmes automatisés. En raison de cette TAT médiocre, des antimicrobiens à large spectre sont utilisés empiriquement, ce qui contribue au problème croissant de la résistance aux antimicrobiens (RAM). Reconnaissant ce besoin urgent de réduire la TAT pour les techniques de culture microbiologique pour le sepsis, EUCAST et CLSI s’orientent vers la réalisation de l’AST directement à partir de flacons d’hémoculture signalés positivement (+aBC)4,5.
En 2018, EUCAST a introduit pour la première fois la méthode AST rapide (RAST) pour déterminer l’AST par la méthode de diffusion sur disque Kirby-Bauer à des temps d’incubation courts, c’est-à-dire 4 h, 6 h et 8 h, directement à partir de +aBC 6,7. La méthode est actuellement validée pour déterminer l’AST pour les +aBC contenant l’une des 8 causes les plus courantes de BSI, à savoir E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa et le complexe A. baumannii parmi les gram-négatifs et Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, E. faecium et Streptococcus pneumoniae parmi les gram-positifs8. Les points de rupture pour la détermination de l’AST à divers intervalles de temps sont fournis en fonction des espèces microbiennes énumérées ci-dessus. Par conséquent, avant une interprétation catégorique des résultats de l’AST, l’identification microbienne est nécessaire. Cependant, la norme RAST ne spécifie pas la méthode permettant l’identification microbienne dans ce laps de temps.
La majorité des études évaluant la méthode RAST d’EUCAST dans leur contexte ont utilisé l’identification microbienne basée sur la spectrométrie de masse après une courte incubation sur des milieux plaquéspour identifier les micro-organismes 9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Cependant, les instruments de spectrométrie de masse ne sont pas largement disponibles, en particulier dans les pays à revenu faible ou intermédiaire (PRFI), ce qui limite considérablement l’utilité potentielle de cette méthode. Peu d’études ont rapporté la mise en œuvre de cette méthode dans leurs centres sans utiliser la spectrométrie de masse 18,19,20. Tayşi et al.18 ont signalé une large catégorisation de la GN parmi les Enterobacterales, les Pseudomonas et les Acinetobacter spp., sur la base de la morphologie de la coloration de Gram et du test d’oxydase avant d’interpréter les résultats de l’AST. Dans d’autres études menées par ce centre, par Gupta et al.19 et Siddiqui et al.20, l’identification microbienne au niveau de l’espèce a été effectuée en préparant une pastille bactérienne à partir du mélange de sang et de bouillon signalé positivement et en l’inoculant sur les tests biochimiques conventionnels. Bien que Tayşi et coll.18 n’aient pas commenté l’exactitude de l’identification microbienne avec leur approche, Gupta et coll.19 ont signalé qu’avec leur approche dans 165/176 cas (94 %), un Gram négatif à déclaration obligatoire RAST (RR-GN), c’est-à-dire l’un ou l’autre des E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa et A. baumannii complexe. Cependant, avec cette dernière approche, la lecture des résultats RAST a été effectuée rétrospectivement en utilisant des points de rupture de diamètre de zone de 8 h seulement après l’incubation complète des résultats biochimiques conventionnels, c’est-à-dire 18 à 24 heures après l’inoculation, et le délai moyen de déclaration était d’environ 2 jours.
Afin de réduire davantage le TAT des rapports cliniques, nous proposons une méthodologie alternative pour permettre l’identification précoce des GN présents dans les +aBC à l’aide d’aMIAST. Avant l’introduction des systèmes d’identification microbienne basés sur la spectrométrie de masse, ces systèmes d’identification automatisés étaient considérés comme la norme de soins pour l’identification microbienne, où l’identification était rendue possible par des changements colorimétriques et/ou fluorométriques induits par les bactéries d’essai lorsqu’elles étaient inoculées dans des tests biochimiques miniaturisés hébergés dans une cassette et faisant correspondre les résultats avec leur base de données d’isolats. Le temps moyen d’identification dans ces systèmes est d’environ 4 h à 8 h, cependant, ils sont limités par le fait que les fabricants recommandent la croissance nocturne des microbes avant que leurs cartes d’identification respectives puissent être inoculées. Cette exigence limite considérablement leur utilité pour réduire le temps consacré aux rapports.
Peu d’études ont évalué les méthodes permettant d’identifier directement les microbes des +aBC à l’aide de ces systèmes automatisés 21,22,23,24,25,26,27. Dans le cas des +aBC contenant du GN monomorphe, la majorité des études ont montré une excellente concordance entre l’inoculation directe à partir de granules bactériennes fabriquées à partir d’un mélange sanguin-bouillon positif et l’incubation standard en colonie. Cependant, dans le cas des Gram positifs, les taux de concordance étaient sous-optimaux. Comme le temps moyen de positivité des +aBCs est compris entre 8 h et 16 h et que l’identification des GN prend ~4 h à 8 h dans un système d’identification microbienne automatisé, nous émettons l’hypothèse qu’en utilisant un protocole d’inoculation directe dans l’identification microbienne automatisée, nous pouvons compléter le rapport clinique des +aBCs avec GN ayant un RR-GN dans les 24 heures suivant la réception de l’échantillon.
Cadre de l’étude
La présente étude a été menée dans le laboratoire de bactériologie clinique d’un institut universitaire de soins tertiaires d’importance nationale (INI) de 950 lits dans le centre de l’Inde de janvier à octobre 2023. Le laboratoire est équipé d’un système de surveillance continue des hémocultures (CBCMS) et d’aMIAST. Le laboratoire de bactériologie fonctionne 24 heures sur 24 et des techniciens et des microbiologistes sont disponibles pour traiter et signaler tout flacon d’hémoculture signalé positivement (+BCa).
Méthodes microbiennes utilisées ici
Le déroulement de l’étude est illustré à la figure 1. Les +aBC présentant des GN monomorphes (+naBC) ont été traités par inoculation directe des cartes d’identification correspondantes pour permettre l’identification et l’AST à l’aide du protocole EUCAST RAST. Ces résultats ont été comparés à la méthode standard de soins (SoC) pour les +aBC, c’est-à-dire la sous-culture sur des milieux conventionnels à l’aide d’une gélose au sang de mouton (SBA), d’une gélose au chocolat (CA) et d’une gélose MacConkey (MA), incubée en aérobie pendant 16 à 24 h, suivie d’une identification et de cartes AST données par l’aMIAST lorsque des colonies isolées apparaissent. Les hémocultures montrant des cocci à Gram positif, des bacilles à Gram positif, des cellules de levure en herbe et ≥2 micro-organismes différents sur des supports de coloration de Gram initiaux ou en plaques ont été exclues de l’étude.
À l’aide du DIP, nous avons réussi à identifier les RR-GN avec une précision diagnostique considérable. L’ITT moyen après l’observation positive d’un cancer du sein aBC n’était que de 507 min (~ 8,5 h). Ainsi, lorsqu’elle est effectuée en conjonction avec la méthode EUCAST RAST pour la détermination de l’AST, elle peut donner l’identification de l’isolat à 8 h de temps de lecture de l’AST. Cette approche a le potentiel de mettre en œuvre la méthode EUCAST RAST, évitant ainsi la nécessit…
The authors have nothing to disclose.
L’étude a été financée par la subvention de recherche intra-muros accordée au Dr Ayush Gupta par l’AIIMS Bhopal. Nous reconnaissons la contribution des techniciens de laboratoire et des médecins résidents qui ont effectué et lu les tests avec diligence pendant les heures de routine et d’urgence.
ANTIMICROBIAL DISKS | |||
Amikacin disk 30 µg | Himedia, Mumbai, India | SD035-1VL | Antimicrobial susceptibility testing |
Amoxyclav disk (20/10 µg) | Himedia, Mumbai, India | SD063-1VL | Antimicrobial susceptibility testing |
Cefotaxime disk 5 µg | Himedia, Mumbai, India | SD295E-1VL | Antimicrobial susceptibility testing |
Ceftazidime disk 10 µg | Himedia, Mumbai, India | SD062A-1VL | Antimicrobial susceptibility testing |
Ciprofloxacin disk (5 µg) | Himedia, Mumbai, India | SD060-1VL | Antimicrobial susceptibility testing |
Co-Trimoxazole disk (23.75/1.25 µg) | Himedia, Mumbai, India | SD010-1VL | Antimicrobial susceptibility testing |
Gentamicin disk 10 µg | Himedia, Mumbai, India | SD016-1VL | Antimicrobial susceptibility testing |
Imipenem disk 10 µg | Himedia, Mumbai, India | SD073-1VL | Antimicrobial susceptibility testing |
Levofloxacin disk 5 µg | Himedia, Mumbai, India | SD216-1VL | Antimicrobial susceptibility testing |
Meropenem disk 10 µg | Himedia, Mumbai, India | SD727-1VL | Antimicrobial susceptibility testing |
Piperacillin-tazobactam disk (30/6 µg) | Himedia, Mumbai, India | SD292E-1VL | Antimicrobial susceptibility testing |
Tobramycin disk 10 µg | Himedia, Mumbai, India | SD044-1VL | Antimicrobial susceptibility testing |
ATCC Escherichia coli 25922 | Microbiologics, Minnesota USA | 0335A | Recommended Gram negative bacterial strain for quality control in RAST |
BacT-Alert 3D 480 | bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France | 412CM8423 | Continuous automated blood culture system |
Biosafety cabinet II Type A2 | Dyna Filters Pvt. Limited, Pune, India | DFP-2/21-22/149 | For protection against hazardous and infectious agents and to maintain quality control |
Blood agar base no. 2 | Himedia, Mumbai, India | M834-500G | Preparation of blood agar and chocolate agar |
Clinical Centrifuge Model SP-8BL | Laby Instruments, Ambala, India | HLL/2021-22/021 | Centrifugation at low and high speed for separation of supernatant |
Dispensette S Analog-adjustable bottle-top dispenser | BrandTech, Essex CT, England | V1200 | Dispensing accurate amount of saline |
MacConkey agar | Himedia, Mumbai, India | M008-500G | Differential media for Lactose fermenters/ non-fermenters Gram negative bacilli |
Micropipette (100-1000 µL) | Axiflow Biotech Private Limited, Delhi, India | NJ478162 | Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation |
Micropipette tips (200-1000 µL) | Tarsons Products Pvt. Ltd., Kolkata, India | 521020 | Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation |
Mueller-Hinton agar | Himedia, Mumbai, India | M173-500G | Antimicrobial susceptibility testing by Kirby-Bauer method of disk diffusion |
Nichrome loop D-4 | Himedia, Mumbai, India | LA019 | For streaking onto culture media |
Nichrome straight wire | Himedia, Mumbai, India | LA022 | For stab inoculation |
Nulife sterile Gloves | MRK healthcare Pvt Limited, Mumbai, India | For safety precautions | |
Plain vial (Vial with red top), Advance BD vacutainer | Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA | 367815 | Obtaining pellet after second centrifugation |
Sheep blood | Labline Trading Co., Hyderabad, India | 70014 | Preparation of blood agar and chocolate agar |
SST II tube, Advance BD vacutainer | Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA | 367954 | Supernatant separation in first centrifugation |
Sterile cotton swab (w/Wooden stick) | Himedia, Mumbai, India | PW005-1X500NO | Lawn culture of blood culture broth for antimicrobial susceptibility testing |
Sterile single use hypodermic syringe 5ml/cc | Nihal Healthcare, Solan, India | 2213805NB2 | Preparing aliquots from +aBC |
VITEK DensiCHEK McFarland reference kit | bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France | 422219 | Densitometer to check the turbidity of suspension |
VITEK saline solution (0.45% NaCl) | bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France | V1204 | Adjustment of McFarland Standard turbidity |
VITEK tube stand | bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France | 533306-4 REV | Stand for proper placement of tubes before ID card inoculation |
VITEK tubes | bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France | Tubes for inoculum preparation | |
VITEK-2 Compact 60 | bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France | VKC15144 | Automated identification and AST system |
VITEK-2 GN card | bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France | 21341 | Identification of Gram negative bacilli |