Summary

Purification et caractérisation de vésicules extracellulaires à partir de cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain

Published: May 03, 2024
doi:

Summary

Ce protocole décrit toutes les procédures, de la culture de cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain (ADSC) et de la collecte du surnageant à l’extraction de vésicules extracellulaires (VE) par ultracentrifugation.

Abstract

Les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain (ADSC) peuvent favoriser la régénération et la reconstruction de divers tissus et organes. Des recherches récentes suggèrent que leur fonction régénératrice peut être attribuée au contact cellule-cellule et aux effets paracrines cellulaires. L’effet paracrine est un moyen important pour les cellules d’interagir et de transférer des informations sur de courtes distances, dans lesquelles les vésicules extracellulaires (VE) jouent un rôle fonctionnel en tant que transporteurs. Il existe un potentiel important pour les VE ADSC en médecine régénérative. De nombreuses études ont fait état de l’efficacité de ces méthodes. Diverses méthodes d’extraction et d’isolement des VE sont actuellement décrites sur la base de principes tels que la centrifugation, la précipitation, la taille moléculaire, l’affinité et la microfluidique. L’ultracentrifugation est considérée comme l’étalon-or pour l’isolation des VE. Néanmoins, un protocole méticuleux pour mettre en évidence les précautions lors de l’ultracentrifugation est toujours absent. Cette étude présente la méthodologie et les étapes cruciales impliquées dans la culture ADSC, la collecte de surnageants et l’ultracentrifugation des VE. Cependant, même si l’ultracentrifugation est rentable et ne nécessite aucun traitement supplémentaire, il existe tout de même quelques inconvénients inévitables, tels qu’un faible taux de récupération et une agrégation des VE.

Introduction

La plupart des ADSC sont dérivés du tissu adipeux et il a été démontré qu’ils favorisent la régénération et la reconstruction de divers tissus et organes, y compris le myocarde, les os et la peau1. Des recherches récentes suggèrent que la fonction régénératrice des ADSC pourrait être due au contact intercellulaire et aux effets paracrines des cellules2. L’effet paracrine est un moyen important pour les cellules d’interagir et de transférer des informations sur de courtes distances, et cette fonction est assurée par des vésicules extracellulaires (VE).

Les VE sont des structures membranaires à double couche produites par des cellules, d’un diamètre allant de 40 nm à 160 nm (avec une moyenne d’environ 100 nm). Ils affectent différentes fonctions cellulaires, telles que la production de cytokines, la prolifération cellulaire, l’apoptose et le métabolisme3,4. De nombreuses études ont été menées sur les fonctions des VE ADSC, notamment la promotion de la régénération osseuse, de la régénération du tissu de la muqueuse buccale, de la survie du tissu adipeux après une greffe de tissu et de la réparation des plaies cutanées 5,6,7,8. L’énorme potentiel des ADSC EV en médecine régénérative est évident. Diverses méthodes existent pour extraire et séparer les VE du surnageant, telles que les techniques basées sur la centrifugation, la précipitation, la taille moléculaire, l’affinité et la microfluidique. La méthode d’ultracentrifugation est largement considérée comme l’étalon-or pour l’isolation des VE9. Le principe fondamental de l’ultracentrifugation pour la séparation des EV est basé sur le fait que les particules dans l’échantillon ont des coefficients de sédimentation variables, ce qui entraîne leur sédimentation et leur agrégation en couches de séparation distinctes. Néanmoins, un protocole détaillé mettant l’accent sur les précautions lors de l’ultracentrifugation n’a pas encore été établi.

Par conséquent, cette étude décrit objectivement la culture ADSC, la collecte de surnageants et les procédures d’ultracentrifugation des VE, ainsi que les points clés, avec un flux logique d’informations et un langage clair et formel. Il s’agit d’une référence précieuse pour les expériences futures.

Protocol

La figure 1 présente une vue d’ensemble des étapes du protocole. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux. 1. Préparation des supports Préparez un milieu de culture pour l’ADSC sans exosomes en utilisant 450 ml de milieu de culture basal, 50 ml de sérum fœtal bovin sans exosomes et 5 ml de trithérapie. <p class="jove_titl…

Representative Results

Tout d’abord, les ADSC ont été caractérisées et identifiées, y compris leur morphologie10 et leurs anticorps de surface. D’après la figure 2A, il est évident que les ADSC sont disposés en forme de fuseau et forment un vortex après une croissance dense. Les cellules cultivées ont été différenciées en cellules adipogènes, ostéogéniques et chondrogéniques et colorées avec du rouge d’huile O, du rouge d’alizarine et du bleu d’alcian<sup class=…

Discussion

Au cours du processus expérimental formel, plusieurs points sont cruciaux pour obtenir les meilleurs résultats expérimentaux. Sur la base de notre expérience précédente, il est recommandé d’opter pour les ADSC de passage 3 à 6, car ils assurent le meilleur état cellulaire possible. Avant la P3, les globules rouges, les cellules endothéliales et d’autres cellules diverses n’ont peut-être pas été éliminés. Après P6, les cellules peuvent vieillir progressivement, ce qui peut affecter l’état des VE s…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été partiellement soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82202473).

Materials

Acrodisc Needle Filter of Supor Membrane Acros Organics 4652 0.22 μm
Basal Medium For Cell Culture OriCell BHDM-03011
Fetal Bovine Serum Without EXO + Culture Supplement (For Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells) OriCell HUXMD-05002
Inverted Microscope OLYMPUS Lx70-S8F2
Low Speed Centrifuge Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co.,Ltd. SC-3612
Normocin InvivoGen ant-nr-05
Optima Max-XP Tabletop Ultracentrifuge Beckman Coulter 393315
Penicillin-Streptomycin-Gentamicin Solution (100x) Solarbio P1410

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Citer Cet Article
Wang, Y., Han, Y., Han, Y. Purification and Characterization of Extracellular Vesicles from Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (207), e66585, doi:10.3791/66585 (2024).

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