Les détails des réactifs et de l’équipement utilisé pour l’étude sont répertoriés dans la table des matériaux. 1. Conception et synthèse de banques de thiophènesulfonamides REMARQUE : Les inhibiteurs du thiophènesulfonamide tels que le 3-phényl-1-(thiophène-2-ylsulfonyl)-1 H-pyrazole (PTSP) sont synthétisés par condensation de base en une étape 8,9, comme le montre la figure 2. Pour concevoir de nouvelles bibliothèques de composés à étudier, les chercheurs doivent se procurer des amines et des chlorures de sulfonyle appropriés et suivre les étapes résumées ci-dessous. Si la structure de l’amine diffère considérablement de celle du dérivé aromatique du pyrazole, il peut être nécessaire d’identifier d’autres conditions de réaction en effectuant une recherche dans la littérature. Cette procédure est robuste, et des bases telles que l’hydroxyde de sodium, la triéthylamine et la pyridine ont également bien fonctionné. Si cela est effectué dans un cours, les étudiants peuvent avoir la liberté de choisir leur propre procédure avec des résultats probablement favorables. Synthèse et isolement du PTSPREMARQUE : Cela peut être complété en une période de laboratoire de 3 heures.Dissoudre 822 mg de phénylpyrazole (5,7 mmol de l’amine, 1,5 eq.) dans 15 mL de tétrahydrofurane dans une fiole à fond rond de 50 mL à l’aide d’un agitateur. Ajouter lentement 306 mg d’hydrure de sodium (60 % dans l’huile, 7,65 mmol, 2 eq.) pour créer une suspension. Laissez cette suspension remuer sur une plaque d’agitation pendant 10 min. Dans un flacon, préparer une solution de chlorure de thiophènesulfonyle (3,82 mmol de chlorure de sulfonyle, 1 eq.) dans 5 mL de THF. Ajouter la solution de chlorure de sulfonyle préparée à l’étape 1.1.3 à la suspension préparée à l’étape 1.1.2 et laisser la suspension résultante agiter pendant 30 minutes supplémentaires. Ajouter 20 mL d’eau DI au mélange réactionnel dans la fiole à fond rond de 50 mL. Transvaser tout le contenu du ballon de réaction, à l’exception de la barre d’agitation, dans un entonnoir séparateur10 de 250 ml. Ajouter 20 ml d’acétate d’éthyle (EtOAc) dans l’entonnoir séparateur et agiter. Retirez la couche inférieure (aqueuse) et réservez. Retirer la couche supérieure (organique) et réserver dans un erlenmeyer de 200 ml. Remettre la couche aqueuse dans l’entonnoir de séparation et extraire avec 20 mL d’acétate d’éthyle. Répétez les étapes 1.1.8 et 1.1.9. Remettre les couches organiques combinées dans l’entonnoir de séparation et laver avec 20 ml de NaCl saturé (saumure). Retirez la couche inférieure (aqueuse) et réservez. Égouttez la couche supérieure (organique) dans l’erlenmeyer. Sécher les couches organiques combinées sur du MgSO4 dans l’erlenmeyer et filtrer dans une fiole à fond rond de 250 mL à l’aide de papier filtre qualitatif10. Retirez le solvant organique sur un évaporateur rotatif. Analyser le mélange réactionnel brut par RMN 1H pour s’assurer que le produit a formé10.REMARQUE : Le temps nécessaire à cette étape dépendra du niveau d’aisance de l’élève avec la spectroscopie RMN. Purifier le produit par chromatographie sur colonne de gel de silice (hexanes 10:1 : acétate d’éthyle)10.REMARQUE : Cela peut être complété en une période de laboratoire de 3 heures. Caractériser le produit de manière spectroscopique.REMARQUE : Le temps nécessaire à cette étape dépendra du niveau d’aisance de l’élève avec la spectroscopie RMN.REMARQUE : Données de caractérisation du 3-phényl-1-(thiophène-2-ylsulfonyl)-1 H-pyrazole (PTSP)10 :1RMN H (400 MHz, CDCl 3 ) : δ 8,11 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 7,88 – 7,79 (m, 3H), 7,68 (dd, J = 5,0, 1,4 Hz, 1H), 7,44 – 7,31 (m, 3H), 7,07 (dd, J = 5,0, 3,9 Hz, 1H), 6,71 (d, J = 2,8 Hz, 1H).RMN 13C (101 MHz, CDCl 3 ) : δ 157.17, 136.84, 135.40, 135.36, 132.55, 131.28, 129.36, 128.72, 127.79, 126.47, 106.90.SGRH (ESI) : Calculé pour C13H10O2N2NaS2 [M+Na+] : 313,0076. Trouvé : 313.0078. 2. Modélisation structurale pour prédire la liaison des thiophènesulfamides au régulateur Vibrio LuxR/HapR REMARQUE : Ce protocole utilise la version Web d’AutoDock Vina appelée Webina11 pour ancrer des inhibiteurs de petites molécules (PTSP dans ce cas) dans la poche de liaison du ligand de l’homologue LuxR/HapR appelé SmcR de Vibrio vulnificus12. Les résultats de ce protocole sont (1) des affinités de liaison calculées et (2) un fichier de structure qui peut être ouvert dans PyMol ou un programme connexe pour visualiser les interactions ligand-protéine. Ce protocole peut être adapté à n’importe quelle petite molécule et à toute protéine avec une poche de liaison de ligand. Il faut quelques minutes pour s’amarrer à SmcR car la zone de recherche de ce récepteur est définie ci-dessous. S’il faut définir la zone de recherche d’un nouveau récepteur (étapes 2.15 à 2.20), cela peut être fait en une période de laboratoire de 3 heures. Une fois la zone de recherche définie, les amarrages suivants ne prendront que quelques minutes. Téléchargez les outils AutoDock. Sélectionnez le fichier approprié pour le système d’exploitation et installez-le sur l’ordinateur.REMARQUE : Ce protocole utilise une version Web d’AutoDock Vina. L’amarrage peut également être effectué localement si ce programme est installé (voir les instructions du fabricant). Téléchargez la structure pour apo SmcR. Accédez à la banque de données sur les protéines. Dans la barre de recherche, entrez l’ID PDB 3KZ9. Cliquez sur Télécharger les fichiers dans le menu déroulant vers le coin supérieur droit de la page et sélectionnez le format pdb . Après avoir téléchargé le fichier , enregistrez-le dans un nouveau dossier dédié au travail d’amarrage. Créez un fichier de structure .mol de l’inhibiteur de petites molécules (PTSP). Naviguez jusqu’à molview et cliquez sur l’icône de la corbeille pour supprimer la structure qui s’y trouve. Dessinez PTSP dans la fenêtre de la structure. Cliquez sur 2D vers 3D. Cliquez sur Outils → exporter → fichier MOL. Un fichier intitulé « Molview.mol » sera téléchargé sur l’ordinateur. Donnez au fichier un nom qui a du sens et enregistrez-le dans le dossier qui contient le fichier pdb de la protéine. Définissez la zone de recherche. Définissez l’aire dans Webina comme la poche de liaison de la protéine (SmcR) pour faciliter l’amarrage dans la bonne région.REMARQUE : Les coordonnées de SmcR sont fournies et générées à l’aide du protocole suivant. Si SmcR est utilisé, les étapes 2.15 à 2.20 peuvent être ignorées. Le protocole peut être adapté à n’importe quelle protéine avec une poche de liaison de ligand connue. Coordonnées : center_x = 17, center_y = 40, center_z = 56, size_x = 12, size_y = 12, size_z = 12. Dans les outils AutoDock, cliquez sur Fichier → Lire la molécule et ouvrez le fichier de protéine pdb téléchargé à l’étape 2.5. Accédez au tableau de bord et cliquez sur la flèche bleue à côté du nom de la protéine. Cela fera apparaître une liste de chaînes. Cliquez sur la flèche bleue à côté de l’une des chaînes de protéines. Pour mettre en évidence les acides aminés de la poche de liaison, trouvez l’acide aminé d’intérêt dans la liste qui est apparue. À côté de l’acide aminé, allez dans le triangle dans la colonne Cl (couleur) à l’extrême droite. Cliquez sur le triangle et sélectionnez par arc-en-ciel.REMARQUE : Utilisez cette méthode pour mettre en évidence les acides aminés suivants :12 Phe75, Phe78, Leu79, Ile96, Met100, Trp114, Phe129, Asn133, Gln137, Val140, Ala163, Phe166, His167, Cys170 (si Met100 est manquant, cela peut être ignoré). Ensuite, cliquez sur Grid → GridBox. Une boîte doit apparaître sur la structure de la protéine avec une face rouge, verte et bleue. Avant d’apporter des modifications, remplacez l’espacement (angström) par 1. Cela garantira que la boîte est correctement mise à l’échelle pour les prochaines étapes.Ensuite, modifiez les cadrans de la boîte de grille centrale pour traduire la boîte dans les directions x, y et z afin de la placer sur les acides aminés en surbrillance. Cliquez et faites glisser sur la protéine pour faire pivoter la structure en trois dimensions.REMARQUE : Cela aidera à s’assurer que la boîte est dans la bonne position. Si nécessaire, utilisez les trois cadrans supérieurs pour le nombre de points afin de modifier la taille de la boîte. Une fois la position et les dimensions de la boîte définies, cliquez sur Fichier → Fermer Enregistrement du courant. Dans le menu, cliquez sur Grille → Sortie → Enregistrer GPF. Nommez le fichier et enregistrez-le dans le même dossier que les deux fichiers de structure. Ce fichier GPF contient les coordonnées de la boîte. Effectuez le « Docking » dans Webina pour générer une énergie de liaison calculée. Ouvrez le dossier qui contient le fichier de ligand .mol et le fichier de protéine .pdb. Webina nécessite des fichiers .pdbqt et effectuera la conversion des fichiers. Accédez à Webina. Récepteur : Faites glisser le curseur sur le fichier téléchargé à partir de la base de données appelée 3kz9.pdb. Cliquez sur Ajouter des atomes d’hydrogène, puis cliquez sur convertir. Cliquez sur Ok dans la fenêtre contextuelle suivante pour travailler avec un monomère. Ligand : faites glisser le curseur sur le fichier .mol pour PTSP (ou un autre inhibiteur de petites molécules). Assurez-vous qu’aucune case n’est sélectionnée et cliquez sur Convertir. Laissez l’option « Corriger la pose » vide et faites défiler jusqu’à la boîte d’accueil. Entrez les paramètres de boîte appropriés (soit ceux énumérés ci-dessus pour SmcR, soit un ensemble généré par le protocole aux étapes 2.15-2.20 pour une protéine différente). Cliquez sur Démarrer Webina et attendez. Une série d’énergies de liaison calculées sera rapportée [Affinité (kcal/mol)] directement sous une visualisation de la molécule amarrée. Assurez-vous que la première valeur est la plus négative. Pour visualiser le ligand ancré dans pymol ou un autre programme similaire, téléchargez le fichier PDBQT de sortie en cliquant sur le bouton de téléchargement approprié. Ce fichier n’est que le ligand (PTSP) dans les coordonnées ancrées. Visualisez le complexe ligand-SmcR arrimé dans PyMol13.Téléchargez et ouvrez PyMol.REMARQUE : Les étudiants à temps plein et les éducateurs peuvent recevoir une licence PyMol gratuitement. Lorsqu’on vous demande une licence après avoir démarré PyMol pour la première fois, cliquez sur Acheter une licence. Sélectionnez Élève/Enseignant. Ouvrez le fichier pdb appelé 3kz9.pdb. Ouvrez le fichier de sortie pdbqt créé par Webina. Visualisez la meilleure conformation (celle avec l’affinité de liaison la plus faible) en cliquant sur les petites flèches pointantes en bas à droite de l’écran PyMol. La première conformation sera la plus favorable et se verra à l’ouverture du fichier. Manipulez la protéine avec le ligand amarré dans PyMol à l’aide des commandes standard14.REMARQUE : L’étude précédente de Newman et al. a comparé les affinités de liaison prédites de plusieurs composés déterminées par Webina à des essais in vitro et in vivo 9. Ces affinités de liaison servent de références pour les composés susceptibles d’être de bons inhibiteurs avec des affinités élevées (qui sont corrélées à des nombres kcal/mol plus faibles) pour la poche de liaison. Un exemple des données de sortie Webina est inclus dans la figure 3A,B pour la liaison PTSP dans la poche de SmcR. 3. Évaluation biologique des thiophénésulfamides dans l’inhibition de la détection du quorum REMARQUE : La procédure spécifique pour le dosage de la protéine LuxR de Vibrio campbellii est décrite ici. Cependant, cette procédure peut être adaptée pour être utilisée avec n’importe quelle protéine Vibrio LuxR/HapR, qui sont toutes disponibles sur des plasmides à réplication ectopique compatibles avec le plasmide rapporteur pJV0649. Le test « écran rouge-vert » est réalisé dans un fond bactérien hétérologue à l’aide de cellules E. coli contenant les deux plasmides. Le plasmide d’expression LuxR/HapR (conférant une résistance à la kanamycine) est disponible et exprime différents gènes LuxR (Figure 4A). Le plasmide pJV064 (conférant une résistance au chloramphénicol) code pour un gène gfp sous le contrôle d’un promoteur activé par LuxR et un gène mCherry sous le contrôle d’un promoteur réprimé par LuxR (Figure 4A). Les deux promoteurs ont été choisis en raison de leur identification en tant que gènes régulés par LuxR avec de grands changements d’expression in vivo15. Les souches d’E. coli LuxR/HapR et le plasmide pJV064 ont été publiés précédemment 9,15. Préparation des milieux liquides : Préparez 1 L de milieu LB.Pesez 10 g de NaCl, 10 g de bactotryptone et 5 g d’extrait de levure. Mélangez les composants dans un bécher ou un cylindre gradué à l’aide d’une plaque d’agitation. Porter le volume total à 1 L à l’aide de cylindres gradués. Si désiré, aliquote dans 100 mL par bouteille avant l’autoclavage. Autoclave pendant 15 min pour chaque 1 L de support. Alternativement, si un autoclave n’est pas disponible, un Instant Pot peut être utilisé16. Inoculation de la souche (Jour 1)Ajouter des antibiotiques au milieu LB aux concentrations finales de kanamycine (40 μg/mL) et de chloramphénicol (10 μg/mL). Aliquote 5 mL de milieu LB/Kan40/CM10 dans des tubes à essai stériles avec bouchons. Inoculer des souches d’E. coli à partir de stocks congelés : culture d’E. coli exprimant LuxR/HapR et le plasmide pJV064 (LuxR+)9,15 ; Culture de lutte antivectorielle vide E. coli et plasmide pJV064 (LuxR-)9,15. Agiter la culture pendant une nuit à 275 tr/min à 30 °C pendant 16-18 h. Dosage des thiophènesulfamides (jour 2)Pesez ~30 mg du composé. Remettre en suspension à 100 mM dans le DMSO et le vortex pour mélanger. Ensuite, préparez un stock de 10 mM. Mélangez 20 μL de la pâte de 100 mM avec 180 μL de DMSO pour le diluer (1:10) afin d’obtenir une matière de travail de 10 mM. Vortex à mélanger. Diluer à contre-courant la culture LuxR+ et les cultures LuxR- (1:100) dans 10 mL de milieu LB/Kan/CM dans des tubes coniques de 15 mL et agiter brièvement pour mélanger. Utilisez une plaque stérile à 96 puits à fond noir, à fond transparent pour le dosage. Préparez une série de dilutions pour toutes les colonnes. Un schéma de la série de dilution 4 fois est inclus à titre de référence (figure 4B).REMARQUE : Une pipette numérique multicanaux est recommandée pour ce processus. Cette méthode permet d’obtenir une série de dilution 4 fois (1:4). Cependant, différentes séries de dilution peuvent être utilisées (par exemple, 1:10, 1:5).Pipeter 200 μL du mélange de culture LuxR+ dans une plaque à 96 puits dans la rangée A, 1 à 6 (figure 4B ; vert). Pipeter 200 μL du mélange de culture LuxR dans une plaque de 96 puits dans la rangée A, 7-12 (figure 4B ; orange). Pipeter 150 μL du mélange de culture LuxR+ dans une plaque de 96 puits en rangées B-E, 1-6 (figure 4B ; vert). Pipeter 150 μL du mélange de culture LuxR dans une plaque de 96 puits en rangées B-E, 7-12 (figure 4B ; orange). Ajouter 2 μL du composé ou du DMSO dans chaque puits de la rangée A conformément à la figure 4B. Pour chaque colonne, effectuez une pipette vers le haut et vers le bas 3 fois, puis transférez 50 μL de la rangée A à la rangée B, dans la même colonne. Répétez le mélange et le pipetage pour les rangées B, C, D, E. Après avoir mélangé la rangée E, prélever 50 μL et mettre les déchets. Au final, il faut avoir 150 μL dans chaque puits. Couvrez la plaque avec du ruban adhésif microporeux. Incuber la plaque en l’agitant à 275 tr/min à 30 °C pendant une nuit de 16 à 18 h. Mesurer la fluorescence et la densité optique des plaques de dosage (Jour 3).Retirez le ruban avec précaution et ne renversez pas de liquide hors des puits. Sur un lecteur de plaques, lisez la densité optique à 600 nm (OD600), GFP et mCherry.REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser un gain défini pour les deux canaux de fluorescence afin de permettre les comparaisons entre les dosages. Enregistrer les données sous forme de fluorescence normalisée par cellule : GFP/OD600 et mCherry/OD600. Tracez le graphique des données, comme le montre la figure 5, pour illustrer les résultats du contrôle DMSO par rapport aux échantillons d’essai. 4. Lavage des plaques de test noires pour la réutilisation Trempez les assiettes dans de l’eau de Javel.Étiquetez un bécher en plastique de 1 L comme « déchet biologique ». Versez le liquide des plaques dans ce conteneur à déchets (nettoyez soigneusement les gouttes avec 70% d’EtOH). Rincez les plaques avec de l’eau DI de la bouteille à jet d’eau sur les déchets et versez-les dedans. Étiquetez un autre bécher en plastique de 1 L comme « eau de Javel à 30 % ». Mettez les assiettes/couvercles dans ce récipient et couvrez avec 30% d’eau de Javel. Enveloppez le dessus avec une feuille de plastique et pesez les plaques avec une boîte à pointes ou quelque chose de similaire. Laisser reposer immergé dans la solution d’eau de Javel pendant la nuit. Rincez et trempez dans de l’éthanol.Rincez abondamment les plaques avec de l’eau DI dans l’évier afin qu’il ne reste pas d’eau de Javel. Videz toute l’eau restante des puits dans l’évier. Ajoutez 70 % d’EtOH à tous les puits et couvercles à l’aide d’un flacon pulvérisateur. Laissez les plaques reposer à la verticale avec le couvercle sur le dessus, mais de travers pour que l’EtOH puisse s’évaporer, mais rien ne tombe dans les puits. Laissez reposer l’assiette toute la nuit. Laissez sécher les plaques.Jetez tout EtOH restant. Retournez l’assiette sur une serviette en papier et laissez le reste de l’EtOH s’évaporer. Laissez les plaques de cette façon dans une hotte. Les plaques seront prêtes pour la prochaine utilisation.