Summary

Hybridation in situ par fluorescence infrarouge photothermique optique (OPTIR-FISH)

Published: February 23, 2024
doi:

Summary

Ici, nous présentons un protocole utilisant l’hybridation in situ par fluorescence infrarouge photothermique optique (OPTIR-FISH), également connue sous le nom de FISH PHOTOTHERMIQUE DANS L’INFRAROUGE MOYEN (MIP-FISH), pour identifier les cellules individuelles et comprendre leur métabolisme. Cette méthodologie peut être largement appliquée à diverses applications, notamment la cartographie du métabolisme cellulaire avec une résolution unicellulaire.

Abstract

Comprendre les activités métaboliques des cellules individuelles au sein de communautés complexes est essentiel pour démêler leur rôle dans la maladie humaine. Ici, nous présentons un protocole complet d’identification cellulaire et d’analyse métabolique simultanées avec la plateforme OPTIR-FISH en combinant des sondes FISH marquées à ARNr et des substrats marqués par isotope. L’imagerie par fluorescence permet l’identification cellulaire par la liaison spécifique de sondes FISH marquées à ARNr, tandis que l’imagerie OPTIR fournit des activités métaboliques au sein de cellules individuelles par décalage vers le rouge induit par les isotopes sur les spectres OPTIR. En utilisant des bactéries cultivées avec du 13C-glucose comme banc d’essai, le protocole décrit la culture microbienne avec marquage isotopique, l’hybridation in situ en fluorescence (FISH), la préparation des échantillons, l’optimisation de la configuration d’imagerie OPTIR-FISH et l’acquisition de données. Nous montrons également comment effectuer une analyse d’images et interpréter des données spectrales au niveau d’une cellule unique avec un débit élevé. La nature normalisée et détaillée de ce protocole facilitera grandement son adoption par des chercheurs de divers horizons et disciplines au sein de la vaste communauté de recherche sur le métabolisme unicellulaire.

Introduction

Le métabolisme cellulaire est un pilier fondamental de la biologie cellulaire, guidant de nombreux processus qui déterminent la santé, la fonction et l’interaction des cellules avec l’environnement. L’analyse du métabolisme au niveau des cellules individuelles, en particulier dans les environnements natifs, fournit des informations inestimables pour révéler les activités hétérogènes et complexes des systèmes biologiques1. Ceci est particulièrement crucial dans l’étude des micro-organismes, car de nombreux microbes présentent des exigences de croissance uniques ou des dépendances environnementales qui remettent en question les méthodes de culture traditionnelles2. Par exemple, certaines espèces peuvent nécessiter des compositions nutritionnelles spécifiques ou des relations symbiotiques difficiles à reproduire en laboratoire, ce qui les rend non cultivables par les techniques standard3. De plus, les longues périodes nécessaires à la culture de certaines espèces posent des défis importants pour la recherche microbiologique, s’étendant souvent au-delà des délais pratiques d’étude et d’analyse. Pour contourner ces limitations, des méthodes alternatives telles que la réaction en chaîne par polymérase et l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) permettent d’identifier les espèces microbiennes sans nécessiter de culture4, ce qui permet d’obtenir une vue plus précise et holistique des écosystèmes microbiens. Cependant, ces technologies analytiques n’ont pas la capacité d’élucider le métabolisme cellulaire. Cette lacune met en évidence les défis actuels dans le domaine de la microbiologie : la tâche concomitante de différencier l’identité cellulaire et d’élucider le métabolisme au niveau de la cellule unique. Les progrès de techniques telles que la spectrométrie de masse par imagerie (MÉMO) couplée à des isotopes stables sont devenus des outils puissants pour l’analyse métabolique d’une seule cellule5. Dans ces expériences, des cellules ont été incubées avec des substrats contenant des isotopes tels que le 13C ou le 15N. Les biomolécules nouvellement anabolisées portent ces isotopes, ce qui les rend distinguables sur les spectres m/z. Cependant, l’IMS souffre d’une instrumentation coûteuse, d’une préparation d’échantillon compliquée, d’un débit relativement faible et de l’expertise requise pour analyser les spectres m/z. Lorsqu’il est combiné à l’imagerie de fluorescence spécifique aux marqueurs moléculaires, des progrès ont été réalisés dans l’élucidation du métabolisme cellulaire avec une spécificité accrue6. Néanmoins, des défis persistent pour faire le lien entre ces deux modalités. La différence de résolution entre l’IMS et l’imagerie de fluorescence, combinée à des configurations opérationnelles différentes, rend difficile l’alignement et la corrélation des résultats7.

L’intégration de l’imagerie spectroscopique vibrationnelle avec le marquage des isotopes stables offre une solution novatrice pour l’étude du métabolisme des cellules uniques. L’incorporation d’isotopes plus lourds ralentit la vibration des liaisons chimiques, ce qui entraîne des pics décalés vers le rouge dans les spectres vibrationnels8. Notamment, l’imagerie vibrationnelle fournit une résolution spatiale comparable à l’imagerie de fluorescence, et la quantification métabolique et l’identification cellulaire peuvent être effectuées dans une seule configuration, simplifiant ainsi l’enregistrement et la corrélation des images. Nos travaux récents ont démontré la combinaison d’une plateforme d’imagerie vibratoire avancée : l’infrarouge photothermique optique (OPTIR) et l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) pour sonder le métabolisme du glucose dans les communautés bactériennes9 (Figure 1). OPTIR est un système de microscopie spectroscopique vibrationnelle qui exploite l’effet photothermique de l’absorption dans l’infrarouge moyen en détectant le changement de lumière visible, ce qui fournit une résolution submicrométrique comme en microscopie optique, mais avec des informations spectroscopiques vibratoires supplémentaires provenant de l’absorption dans l’infrarouge moyen. La FISH est une technique couramment utilisée pour déterminer l’identité des micro-organismes au niveau de la cellule unique. La séquence d’oligonucléotides pourrait être conçue pour cibler des séquences 16S spécifiques de différents taxons, et différents fluorophores pourraient être attachés. L’hybridation spécifique des sondes oligonucléotidiques conçues avec l’ARNr cible conduit à de forts signaux de fluorescence des espèces cibles dans les cellules individuelles, et l’imagerie de fluorescence multicanal pourrait être réalisée pour identifier plusieurs espèces au sein de la population. Comme l’imagerie OPTIR et l’imagerie de fluorescence sont toutes deux basées sur la détection optique, la combinaison de la fluorescence OPTIR et FISH est simple à mettre en œuvre. Les deux modalités partagent la même résolution optique pour l’analyse d’une seule cellule et peuvent être commutées facilement sans nécessiter d’alignement ou de co-enregistrement supplémentaire.

Ce protocole présente un guide détaillé sur l’exploitation de la plateforme OPTIR-FISH pour l’analyse avancée de la structure et de la fonction d’une cellule unique. Nous avons utilisé les échantillons bactériens cultivés dans des milieux contenant du 13C-glucose comme banc d’essai et avons quantifié la synthèse de novo des protéines à partir du 13C-glucose. Afin de démontrer la capacité de la plateforme à identifier les cellules, nous avons utilisé des mélanges bactériens dans lesquels chaque espèce a été marquée à l’aide de sondes FISH ciblées sur l’ARNr. Cette approche a permis l’identification précise de souches bactériennes spécifiques, telles que Escherichia coli (E. coli) et Bacteroides thetaiotaomicron (B. theta), et leur métabolisme. Ce protocole offre aux chercheurs un outil puissant pour le profilage métabolique et l’identification simultanée des espèces au niveau de la cellule unique, promettant de faire progresser notre compréhension des interactions cellulaires, de la physiologie et de leurs rôles dans des environnements complexes.

Protocol

L’utilisation d’échantillons bactériens dans cette étude est conforme aux directives de l’Institutional Review Board (IRB) de l’Université de Boston et du National Institute of Health. REMARQUE : Le flux de travail général suivi dans ce protocole est résumé à la figure 2. 1. Culture bactérienne et marquage isotopique (figure 2A)</str…

Representative Results

Le flux de travail général pour l’analyse métabolique microbienne unicellulaire avec identification génétique par OPTIR-FISH est résumé dans Graphique 2. Les résultats représentatifs démontrant la capacité d’imagerie métabolique unicellulaire d’OPTIR sont présentés dans Graphique 3. Cet exemple a utilisé des cellules E. coli incubées avec 12C- ou 13C-glucose pendant 24 h. L’incorpora…

Discussion

Ici, nous avons décrit un protocole détaillé pour l’application de la plateforme OPTIR-FISH pour l’identification simultanée des espèces microbiennes et la quantification des activités métaboliques à la résolution de la cellule unique. Les étapes critiques comprennent la culture avec marquage d’isotopes stables pour l’étude d’activités métaboliques spécifiques et l’hybridation in situ en fluorescence pour identifier les espèces microbiennes cibles. L?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le National Institute of Health R35GM136223, R01AI141439 à J.X.C.

Materials

96% Ethanol ThermoScientific T032021000
Calcium Fluoride Crystran CAFP10-0.35
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7021-1KG
D-Gluocose (U-13C6, 99%) Cambridge Isotopic Laboratories CLM-1396-1
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E9884-100G
formamide ThermoScientific 17899
Luria-Bertani broth  Sigma-Aldrich L3522-250G
M9 Minimal Salts 5x SIGMA M6030-1KG
OPTIR instrument Photothermal Spectroscopy Corp. mIRage LS
Paraforaldehyde Solution, 4% in PBS ThermoScientific J19943-K2
poly-L-lysine solution 0.1% (w/v)  Sigma-Aldrich P8920-500ML
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888-25G
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771-25G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 99+% ThermoScientific A11379.18
Trypic Soy Broth Sigma-Aldrich 22092-500G

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Citer Cet Article
Guo, Z., Bai, Y., Pereira, F. C., Cheng, J. Optical Photothermal Infrared-Fluorescence In Situ Hybridization (OPTIR-FISH). J. Vis. Exp. (204), e66562, doi:10.3791/66562 (2024).

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