単離加圧リンパ管における絶対、細胞質、遊離Ca²⁺ 、および対応する収縮性のリアルタイム評価

生後9〜13週齢のオスのSprague-Dawleyラットは、商業ベンダーから購入されました。到着後、すべてのラットは、アーカンソー医科大学(UAMS)の実験動物医学部門(DLAM)施設で標準的な実験室食で飼育および維持され、25 °Cで12時間の明暗サイクルに曝露されました。すべての手順は、UAMSのInstitutional Animal Care and Use Committee(IACUC)によって承認された動物使用プロトコル#4127に従って実施されました。 1. 腸間膜LVの解剖とカニューレ挿入 注:腸間膜LVを分離する前に灌流チャンバーをセットアップして、実験を中断するような流れや漏れがないことを確認することが重要です。 灌流浴の準備ホウケイ酸ガラス製マイクロピペット(外径1.2mm、内径0.68mm、先端外径75-100μmまで引っ張る)を市販業者から購入します。マイクロピペット(別名カニューレ)を約1〜2cmの長さに切断して研磨し、分離された容器灌流チャンバーに取り付けます。 容器灌流チャンバーに取り付けられた各ガラスカニューレを、ポリエチレンチューブを使用して独立した重力供給圧力レギュレーターと一直線に配置された独立した圧力トランスデューサーに接続します。注:これにより、研究デザインに応じて流入圧力と流出圧力を独立して操作できます。 図 1 に、このセットアップの詳細を示します。 灌流チャンバー(5 mL)、ガラス製マイクロピペット、および独立した重力供給圧力調整器を、生理的塩溶液(PSS; 119 mM NaCl; 24 mM NaHCO3; 1.17 mM NaH2PO4; 4.7 mM KCl; 1.17 mM MgSO4; 5.5 mM C6H12O6 (グルコース); 0.026 mM C10H16N2O8 (EDTA); および 1.6 mM CaCl2 を埋め戻します。)気泡がありません。次に、カニューレが加圧されないように圧力をクランプします。注:この溶液のpHは~7.5です。ステップ1.3.7で説明したように、PSS内の重炭酸塩緩衝系に作用するCO2 バブリングを利用して、灌流槽内で7.4のpHが維持されます。ここでは、過剰なCa2+ イオンをキレート化するためにEDTAが使用されます。 結び目の準備編組シルク縫合糸(サイズ8-0)を使用して、顕微鏡下でダブルオーバーハンドノットを結びます。主な手順を 図 2 に示します。1本のフィラメントを分離します。 マイクロ鈍い先端を持つ2つのデュモン#5鉗子を使用し、1つの鉗子を使用して他の鉗子の先端の周りに二重ループを作ります。 ループ状の鉗子で、縫合糸の緩い端をつかみ、結び目を完全に閉じて小さな開口部を残さないように、両方のループを通して引っ張ります。 バンナスプリングハサミを使用して、両側から余分な縫合糸をカットします。後でこれらの結び目を使用して、LVをカニューレに固定します。注:結び目を結ぶときに鉗子の先端を損傷する危険性が高いため、解剖またはカニューレ挿入するのと同じ鉗子を使用しないでください。 腸間膜LVの分離とカニューレ挿入5%イソフルランを1.5 L / minのO2 過剰摂取で投与することにより動物に深く麻酔をかけ、斬首によって放血します。. 腸間膜LVの解剖のために腸間膜全体を分離するには、最初に腹壁の正中線に沿って縦に切り込みを入れ、腸間膜を外部化し、次に幽門括約筋のすぐ下と盲腸の上の~2〜3 cmの接続部と直腸への接続を切り取ります。 解剖した腸間膜全体を氷冷したPSS200mLで洗浄し、次に氷冷PSSを含むシリコン裏地(8-10mm)のペトリ皿(100mm)に移してピン留めします。 実体顕微鏡を使用して、周囲の脂肪や結合組織から二次腸間膜LVを解剖し、Dumont #5 Inoxファイン鉗子、およびVannaスプリングハサミを解剖します。組織から除去されたLVの端を特定するために、LVの近位端に小さな脂肪片を残します。 解剖したLVを血管灌流チャンバーに移し、ガラスカニューレにカニューレを挿入します。 2つの事前に研がれたDumont#5 Inox Fine鉗子、ストレートチップ(0.05 x 0.01 mm)を使用して、LVの遠位端をP1カニューレ(流入)に、血管の近位端をP2カニューレ(流出)に使用して、リンパの流れの方向を模倣します。注意: P1とP2のカニューレは同一であり、LVのどちらの端が接続されているかによってのみ異なります。細い血管壁をつかむのを容易にするために、先端で完全に接触し、損傷のない鉗子を使用することが重要です。1つの事前に結ばれた結び目を各ガラスカニューレにスライドさせて、後で容器をカニューレに固定します。 脂肪の小片を使用してLV方向の向きを変え、最初に遠位端をP1にカニューレ状にします。 結び目をカニューレに滑り込ませ、締めてLVを固定します。カニューレの先端を締めすぎて壊さないように注意してください。 灌流チャンバー内でLVを4〜5mmHgに加圧します。注:私たちの目的のために、P1とP2の圧力を等しく設定します。ただし、実験条件によっては、各カニューレで圧力を調整して、せん断応力や逆流を誘発する場合があります。 手順1.3.6.1〜1.3.6.4を繰り返して、LVの近位端をP2にカニューレ挿入します。 7%の二酸化炭素(CO2)/ 93%の酸素(O2)を含む泡立つ石を浴室に入れて、生理学的pHを維持します。 チャンバーを温度調節器に接続し、LVが平衡化して安定した自発的な収縮が発生するまで37 °Cに設定します(約30分)。メモ: 図 1 に、このセットアップの詳細を示します。 2. LV中の[Ca2+]i の絶対濃度の測定 カニューレLVのFura-2AM染色自然収縮が進行した後(ステップ1.3.8から)、LVをFura-2-アセトキシメチルエステル(Fura-2AM;2 μMまたは10 μL/5 mL)およびプルロン酸(PA;0.02% W/Vまたは5 μL/5 mL of 20% PA)と暗所で30分間インキュベートします。注:Fura-2AMを追加した後、残りのすべての手順は暗闇で実行する必要があります。 30分後、灌流チャンバー3xで全槽容量を負圧真空で空にし、温度一致(37 °C)試薬フリーのPSSと交換して溶液を交換します。注意: これは、LVが空中に吊り下げられる時間を最小限に抑えるために迅速に行う必要があります。例えば、右手は真空、左手は新しい試薬フリーPSSの交換に使うなど、両手を使ってください。 洗浄後、LVを暗所で15分間インキュベートして、余分なインジケーターを取り除き、脱エステル化します。 Ca のキャプチャ2+ 蛍光と血管径LED光源、20x S Fluor対物レンズ、セルフレーミングアダプター、高速CMOSビデオカメラシステムを備えた倒立型蛍光顕微鏡ステージにチャンバーを移し替え、15Hzでフレームごとの蛍光捕捉を可能にします。注: このワークフロー設定の概略図を 図 3 に示します。Ca2+ 信号は、少なくとも15fpsのCCDカメラを使用してキャプチャできます。 イメージングソフトウェアを搭載したコンピューターに顕微鏡を接続して、蛍光とエッジ検出を記録します。注:参照されているソフトウェアは、同時圧力記録も可能にします。ただし、これには含まれていません。 LED光源と蛍光灯システムインターフェースをオンにします。注意: ここで説明するソフトウェアの手順は参照されているソフトウェア用ですが、他のソフトウェアを使用してこのデータを取得できます。 ソフトウェア(IonWizard)を開きます。 [ファイル] タブで、[新規] を選択します。 [収集] タブで、 [実験] を選択します。 目的の実験テンプレートを読み込み、[ OK]をクリックします。注:測定するパラメータを使用して実験テンプレートを設定する必要があります。テンプレートのセットアップ手順は、ソフトウェアマニュアル29に記載されています。 画面上のトレースを調整して 、血管の直径、分子 (340 信号)、 分母 (380 信号)、 比率 を降順で表示します。 必要に応じて Y 軸のスケールを調整して、トレースを視覚化します。[トレース] で、[ユーザー制限の編集] を選択します。[自動制限] がオフになっていることを確認します。 調整するパラメータを選択し、軸の最小値と最大値を入力して、[ OK]を選択します。 テストを開始するには、画面下部の [開始 ] をクリックします。 LVの直径を同時に測定するには、イメージングシステムに組み込まれたエッジ検出ソフトウェアを使用して、3 HzでLVの収縮トレースを生成します。これらの測定値を使用して、セクション3で説明し、 図4に示す収縮性およびリズム性のパラメータを分析します。LVの壁が暗い線で表示されるように、照明を調整してください。 脂肪や破片がない関心領域(ROI)を選択します。実験が開始されたら、この ROI を動かさないでください。 閾値が、収縮サイクル全体を通じて血管壁の端が検出されるように設定されていることを確認してください。 蛍光測定の場合は、光電子増倍管(PMT)をオンにします。 レシオメトリックインジケータであるFura-2を、LEDイルミネーターを使用して50 msの露光で340 nmと380 nmの波長を交互に行い、イメージングフィールド全体で15 Hzで510 nmの発光スペクトルをキャプチャします。注:再現性のあるCa2+ 測定を得るためには、一連の実験全体ですべての光学パラメータ(励起設定、発光フィルター、対物レンズ、ダイクロイックミラー)を同じに保つことが重要です。 まず、視野の中央にLVを配置した340および380蛍光(信号)を取得し、次にステージマニピュレータを使用して、容器のない浴の端に視野を移動させることにより、S/N比を測定します(シリコンで裏打ちされた端を避けるように注意し、および/または浴から破片を取り除くことによって)背景をキャプチャする。注:Ca2+ 測定のためには、毎回容器の元のセクションに戻ることが重要です。 浴液を温度一致した試薬フリーのPSSと交換して、浴中の余分なインジケーターを取り除きます。余分なFura-2を除去するには数回の浴交換が必要な場合があるため、信号とバックグラウンドの比率が約10:1になるまでこの交換を繰り返します。 ベースラインの Fura-2 蛍光シグナルと自発的な収縮を約 30 分間記録し、続いて電位依存性の Cav1.x アンタゴニストであるニフェジピン (NIF; 0.1-100 nM) の累積濃度応答を示します。各薬物濃度のバックグラウンド測定値を取得します。 各実験の最後に、温度が一致したCa2+フリーPSSでLVを洗浄し、Ca2+非存在下でのLVの最小Fura-2蛍光シグナル(Rmin)とLVの最大直径を得ます。必ず背景を測ってください。注:Ca2+フリーPSSはPSSと同じ組成ですが、CaCl2は含まず、EDTAは1 mM EGTA(C14H24N2O10)(pH ~7.5)に置き換えられます。 浴溶液を、10 mM Ca2+とイオノマイシン(10 μM IONO)、Ca2+イオノフォアを含む温度一致PSSと交換して、Ca2+を飽和させる条件下で最大Fura-2蛍光シグナル(Rmax)とLVの最小直径を取得します。必ず背景を測ってください。 絶対値 [Ca2+]i の測定式Rmin とRmax を使用して、340 nmと380 nmの波長の比率を較正し、絶対細胞質遊離Ca2+ 濃度([Ca2+]i)を計算します。 式(1)26を使用して、絶対細胞質遊離Ca2+濃度([Ca2+]i)を計算します。(1)ここで、K d = 225 nM (Fura-2 の解離定数)26、R = 340/380 比、Rmin = 340/380 比 Ca2+ 非存在下、Rmax = 340/380 比 Ca2+ 飽和条件、Sfree = 380 Ca2+ 不在下での信号、Sbound = 380 Ca2+ 条件での信号注:すべての蛍光シグナルは、バックグラウンド蛍光について補正しました。 図 5 は、記録されるパラメータを詳述した Ca2+ トレースの例です。ベースライン Ca2+ を Ca2+ スパイクの前の最低安静時 Ca2+ と定義し、ピーク Ca2+ を Ca2+ スパイク中に達成された最高 Ca2+ と定義します。振幅は、ピークとベースラインCa2+の差です。Ca2+スパイクの周波数を除き、イメージングソフトウェアから直接すべてのパラメータをエクスポートします。ただし、Ca2+スパイクの数/秒としてオフラインで計算します。以下は、これらのパラメータを取得するための参照ソフトウェア内の主要な手順です。注:トレース全体を.txtファイルにエクスポートでき、選択したソフトウェアですべてのパラメータを分析または計算できます。 [Rmin] で、Ca2+ フリー PSS 中の背景に対応する分子トレースのセクションを強調表示します。ダイアログボックスが開き、トレースのこの部分の値が表示されます。 「操作」で、「定数」を選択します。 「Calcium-Numeric background」を選択し、前のステップの「Numerator」と「Denominator」の背景番号を入力します。[OK] をクリックします。 Ratioトレースのセクションのうち、Ca2+フリーPSS中の最も低い比率に対応する部分をハイライト表示します。これが Rの最小値です。また、このセクションの分母の値にも注意してください。これはSフリーです。 Rmax と S について 、トレースの高 Ca2+ フリー PSS と最高比率に対応するセクションにバインドされた R max と S について、手順 2.3.4 から 2.3.7 を繰り返します。 「操作」で、「定数」を選択します。 [Calcium-Calcium Calibration]を選択し、式1にリストされている値を入力します。[OK] をクリックします。 ステップ 2.2.8 の説明に従って、画面上のトレースの 1 つを調整して、 Calcium-Numeric から Calcium を減算した値が表示されるようにします。 単調過渡解析を実行して、残りのパラメータを取得します。この手順は、ソフトウェアマニュアル30に記載されています。 または、[ エクスポート] で [ 現在のトレース] を選択します。 .txtファイルをエクスポートする場所を選択し、[ OK]をクリックします。注:エクスポートする個々のトレースを必ずクリックしてください。トレース全体またはトレースの選択したセクションをエクスポートできます。 3. 左室収縮性とリズム性の測定 イメージングシステムに組み込まれたエッジ検出ソフトウェアは、上記のようにLV直径測定用の収縮性トレースを生成します。これらの測定値を使用して、収縮パラメータとリズミカルパラメータを解析します。 図 4 は、記録する縮約パラメータを詳述した縮約トレースの例です。Diameterトレース30のMonotonic Transient Analysis機能を使用して、すべてのパラメータをイメージングソフトウェアから直接エクスポートしますが、収縮の頻度、計算された流量、およびオフラインで計算される間隔は除きます。注:トレース全体を.txtファイルにエクスポートでき、以下の式を使用して、選択したソフトウェアですべてのパラメータを分析または計算できます。 EDD、ESD、振幅、周波数、および計算流量測定LVがリズミカルで自発的な収縮中に達成できる最大直径と最小直径(拡張末期直径[EDD]と収縮期末端直径[ESD])をそれぞれ測定します。 収縮の振幅(AMP)をEDDとESDの差として計算します。 度数を測定期間あたりの収縮数(s)として計算します。 計算式 (2) を使用して、計算された μm あたりの流量を計算します。計算流量 = π/4(EDD2- ESD2)F (2)ここで、EDD2 = 弛緩状態における血管断面積、ESD2 = 収縮時の血管断面積の測定値、F = 収縮の頻度/秒 リズミカルさ:収縮とリラクゼーションの時間:LVリズミカルさの他の尺度は、収縮時間とリラクゼーション時間です。 収縮時間は、収縮のたびに LV が ESD に到達するのにかかる時間として定義します。 リラクゼーション時間を、LV が各リラクゼーションの EDD に到達するのにかかった時間として定義し、特定の時間枠内で絶対 [Ca2+]i と相関するリズム性の全体的な指標を提供します。 式(3)からインターバル時間(ΔT)を計算します。Δt = t2 (ESD2)-t1 (ESD1) (3)