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Médecine

Sviluppo di un modello di shock emorragico clinicamente rilevante nei ratti

Published: March 22, 2024
doi:
10.3791/66523
, , , , , , , , , , , , , , ,
1CNRS, INSERM, l’institut du thorax,Nantes Université, 2CNRS, INSERM, l’institut du thorax,Nantes Université, CHU Nantes, 3Departement of Biochemistry,CHU de Nantes, 4Oniris

Summary

Lo shock emorragico uccide 1,9 milioni di persone in tutto il mondo ogni anno. I piccoli animali sono spesso usati come modelli di shock emorragico, ma sono associati a problemi di standardizzazione, riproducibilità e significato clinico, limitandone così la rilevanza. Questo articolo descrive lo sviluppo di un nuovo modello di shock emorragico clinicamente rilevante nei ratti.

Abstract

Negli ultimi decenni, lo sviluppo di modelli animali ha permesso di comprendere meglio diverse patologie e di individuare nuovi trattamenti. Lo shock emorragico, cioè l’insufficienza d’organo dovuta alla rapida perdita di un grande volume di sangue, è associato a una fisiopatologia molto complessa che coinvolge diverse vie. Numerosi modelli animali esistenti di shock emorragico si sforzano di replicare ciò che accade negli esseri umani, ma questi modelli hanno limiti in termini di rilevanza clinica, riproducibilità o standardizzazione. Lo scopo di questo studio è stato quello di perfezionare questi modelli per sviluppare un nuovo modello di shock emorragico. In breve, lo shock emorragico è stato indotto nei ratti maschi Wistar Han (11-13 settimane di età) da un dissanguamento controllato responsabile di un calo della pressione arteriosa media. La fase successiva di 75 minuti è stata quella di mantenere una pressione arteriosa media bassa, compresa tra 32 mmHg e 38 mmHg, per innescare le vie fisiopatologiche dello shock emorragico. La fase finale del protocollo ha imitato la cura del paziente con la somministrazione di liquidi per via endovenosa, soluzione di lattato Ringer, per aumentare la pressione sanguigna. I punteggi relativi al lattato e al comportamento sono stati valutati 16 ore dopo l’inizio del protocollo, mentre i parametri emodinamici e i marcatori plasmatici sono stati valutati 24 ore dopo l’infortunio. Ventiquattro ore dopo l’induzione dello shock emorragico, la pressione arteriosa e diastolica media è diminuita nel gruppo shock emorragico (p < 0,05). La frequenza cardiaca e la pressione arteriosa sistolica sono rimaste invariate. Tutti i marcatori di danno d'organo sono aumentati con lo shock emorragico (p < 0,05). I punteggi di lattatemia e comportamentali sono aumentati rispetto al gruppo sham (p < 0,05). In conclusione, abbiamo dimostrato che il protocollo qui descritto è un modello rilevante di shock emorragico che può essere utilizzato in studi successivi, in particolare per valutare il potenziale terapeutico di nuove molecole.

Introduction

Lo shock emorragico (HS) è uno stato di shock caratterizzato da una significativa perdita di volume sanguigno, con conseguente disossia tissutale. L’HS è una patologia complessa che associa cambiamenti emodinamici e metabolici insieme a risposte pro e anti-infiammatorie. Circa 1,9 milioni di decessi in tutto il mondo sono attribuiti all’emorragia e alle sue conseguenzeogni anno 1. Le attuali linee guida per la cura riguardano principalmente la somministrazione di liquidi per via endovenosa (integrata o meno con molecole vasoattive) e l’ossigenoterapia. Tuttavia, questi trattamenti sono sintomatici e possono essere inefficaci, il che spiega perché la mortalità associata all’HS rimane elevata2. Ciò giustifica l’importanza di identificare nuovi meccanismi molecolari e cellulari e, quindi, trattamenti per ridurre la mortalità.

I modelli animali consentono di decifrare i meccanismi fisiopatologici coinvolti nelle malattie e di testare nuove strategie terapeutiche. In letteratura esistono numerosi modelli animali di shock emorragico. Questi modelli differiscono non solo per le specie utilizzate, ma anche per i mezzi di induzione dell’HS (ad esempio, pressione fissa vs. volume fisso) (Tabella 1, Tabella 2)3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Inoltre, i protocolli variano all’interno dello stesso tipo di modello (ad esempio, tempo di emorragia, pressione arteriosa media mirata) (Tabella 3)14,15,16,17,18,19,20. Considerando l’ampia varietà di modelli di shock emorragico esistenti e la complessità della replicazione della situazione clinica, lo studio preclinico di questa patologia rimane limitato. Lo sviluppo di un modello di shock emorragico riproducibile, standardizzabile e facile da implementare è nell’interesse di tutti. Ciò faciliterebbe il confronto tra i vari studi e quindi svelerebbe la complessa fisiopatologia dello shock emorragico. Lo scopo di questo protocollo è stato quello di sviluppare un nuovo modello clinicamente rilevante di shock emorragico nei ratti utilizzando due fasi successive di emorragia a volume fisso seguite da una fase fissa di bassa pressione sanguigna.

Tabella 1: Specie utilizzate come modello per lo shock emorragico 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: I diversi tipi di shock emorragico13. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Esempio della diversità dei modelli sperimentali di shock emorragico nei ratti indotto da un protocollo di pressione fissa. Riassunto dei parametri per diversi modelli sperimentali di shock emorragico. I vasi mostrati in rosso sono le arterie e quelli mostrati in blu sono le vene. Per la rianimazione si utilizza come riferimento il volume di sangue prelevato (sangue: rianimazione con un volume identico a quello del sangue prelevato durante lo shock; x2: rianimazione con un volume doppio di quello del sangue prelevato durante lo shock; x4: rianimazione con un volume quattro volte superiore a quello del sangue prelevato durante lo shock). MAP: pressione arteriosa media; RL: Ringer lattato 14,15,16,17,18,19,20. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Protocol

Tutte le procedure sono state approvate ed eseguite in conformità con il comitato etico regionale (protocollo (#17858 e #32499, CEEA-Pays de la Loire, Francia) secondo la Direttiva 2010/63/UE dell’Unione Europea. La segnalazione è conforme alle attuali linee guida ARRIVE e alla Guida del National Institutes of Health (NIH) per la cura e l’uso degli animali da laboratorio (NIH Pub. n. 85-23, rivista nel 2011). 1. Status etico e informazioni generali sui ratti I ratti maschi di Wistar Han (Charles River, Saint-Germain-Nuelles, Francia) sono stati consegnati all’Unité Thérapeutique Expérimentale a 10 settimane di età. Alloggiare i ratti per almeno 1 settimana a temperatura standard (21-24 °C), umidità (40%-60%) e ciclo luce/buio di 12 ore con un periodo di luce a partire dalle 07:30. Fornire cibo e acqua ad libitum. Utilizzare ratti di 11-13 settimane del peso di 300-400 g per il protocollo. 2. Fasi di allestimento e preparazione della sala Accendere la stazione di anestesia, impostare il tappetino riscaldante a 37,5 °C e coprirlo con un telo non sterile. Sterilizzare gli strumenti chirurgici necessari per il protocollo: pinza atraumatica DeBakey (1), forbici o bisturi fini e affilati (1), pinze standard (2), portaaghi (1), forbici per micro dissezione Vannas (1), pinza (1). Preparare i cateteri per la vena giugulare e l’arteria femorale.Per il catetere della vena giugulare, montare un tubo in polietilene (PE) (PE50) su un ago da 23 G con la punta tagliata all’estremità. Per il catetere dell’arteria femorale, preparare quello descritto al punto 2.3.1 e collegare un tubo PE10 all’estremità del tubo PE50. Preparare il trasduttore di pressione e i cateteri per l’arteria femorale e la vena giugulare riempiendolo con una soluzione di Ringer lattata eparinizzata a 100 UI/mL. Posizionare una siringa da 2 ml contenente la soluzione di Ringer lattato eparinizzata a 100 UI/mL all’estremità dei cateteri e del trasduttore di pressione. Fare attenzione a non formare bolle, poiché causano difetti di segnale. Accendere il software associato al trasduttore di pressione e tararlo secondo le istruzioni del fornitore. 3. Preparare il ratto per l’intervento chirurgico Anestetizzare il ratto con una scatola a induzione (parametri: sevoflurano 8%, portata d’aria: 1 L/min). Dopo aver controllato la profondità dell’anestesia tramite il riflesso del pedale, mantenere l’anestesia al sevoflurano al 4%, con una portata d’aria di 0,6 L/min. L’uso di analgesici prima dell’intervento è stato evitato a causa degli effetti emodinamici di queste molecole.NOTA: Da questo passaggio, la profondità dell’anestesia viene valutata ogni 20 minuti tramite il riflesso del pedale. Pesare il ratto, posizionarlo in posizione di decubito dorsale su un tappetino riscaldante e depilarlo nelle regioni inguinali e del collo. Disinfettare le aree depilate con soluzioni alternate di iodio povidone al 10% e al 4% (3 volte ciascuna) utilizzando garze non sterili. Applicare una goccia di unguento oftalmico sugli occhi dell’animale per evitare che si secchi. Posizionare il ratto su un tappetino riscaldante sul tavolo chirurgico (decubito dorsale). Posizionare la sonda rettale lubrificata per controllare la temperatura del ratto. Mantenere l’anestesia al sevoflurano al 4%, con una portata d’aria di 0,6 L/min. Sostituire i guanti con quelli sterili, posizionare il telo sterile sul ratto e tagliarlo nelle regioni inguinali e del collo. 4. Incannulamento della vena giugulare Localizzare la regione giugulare nella regione inferiore destra del collo, sopra la clavicola, mediante pulsazione visibile. Utilizzando la pinza atraumatica DeBakey, afferra delicatamente la pelle, quindi pratica un’incisione precisa usando forbici sottili e affilate o un bisturi. Applicare una goccia di anestetico locale (lidocaina 2%) sull’area incisa. Taglia delicatamente il tessuto con una pinza standard. Individua la vena giugulare e liberala delicatamente dal suo compartimento muscolare con una pinza standard. Posizionare un filo di sutura di seta 4/0 e legare saldamente il lato distale (verso la testa). Utilizzare la sutura con i portaaghi per tendere la vena giugulare. Posizionare una sutura 4/0 sul lato prossimale (verso il cuore) e preparare un nodo da chirurgo senza stringerlo. Praticare una piccola incisione nella vena giugulare utilizzando le forbici da micro dissezione Vannas. Dopo aver afferrato con cura la parete venosa con una piccola pinza, inserire il catetere PE50 nella vena giugulare a mano o con una pinza standard. In questa fase, utilizzare una garza sterile per asciugare eventuali gocce di sangue, che potrebbero fuoriuscire dalla vena. Far avanzare leggermente il catetere (0,5 cm) e verificarne il corretto posizionamento in vena prelevando una piccola quantità di sangue e quindi reiniettandolo (il sangue nella cannula indica che si trova nella vena). Stringere il nodo precedentemente preparato per fissare il catetere. Lasciare il catetere in posizione, collegato a una siringa preriempita con soluzione di Ringer lattato, e coprire l’area incisa con una garza sterile inumidita. 5. Incannulamento dell’arteria femorale Usa la pinza atraumatica DeBakey per afferrare la pelle del triangolo di Scarpa della gamba sinistra e fai un’incisione con forbici fini e affilate o un bisturi. Applicare una goccia di anestetico locale (lidocaina 2%) sull’area incisa. Dilacerare delicatamente il tessuto con una pinza standard. Individua la triade femorale (arteria, vena e nervo). Passare una pinza sotto la triade e, utilizzando la seconda pinza standard, separare molto delicatamente l’arteria dal nervo e dalla vena femorale.NOTA: L’arteria è più piccola, rosa e pulsante. Questo è un passaggio fondamentale; La vena e l’arteria sono fragili e possono rompersi facilmente. Posizionare una sutura 4/0 e legare l’arteria femorale distalmente (lato gamba). Prendi la sutura con i portaaghi per mettere in tensione l’arteria femorale. Posizionare una sutura 4/0 sul lato prossimale (lato cuore) e preparare un nodo senza chiuderlo. Clamp l’arteria (posizionare il clamp a monte della sutura laterale prossimale). Incidere l’arteria femorale trasversalmente con le forbici da micro dissezione Vannas (un piccolo volume di sangue dovrebbe fluire dall’arteria). Utilizzando una pinza standard, afferrare delicatamente la parete dell’arteria e incannulare l’arteria femorale con il catetere (PE10 terminato), tenendolo con una pinza. Sbloccare delicatamente per verificare la presenza di perdite, quindi controllare il segnale di pressione (convalida che il catetere si trovi nell’arteria femorale) e verificare che il sangue non rifluisca nel catetere (segno di perdita dalle valvole/trasduttore di pressione). Se il segnale è buono (valori attesi: pressione arteriosa sistolica: 120 mmHg, pressione arteriosa diastolica: 80 mmHg) e non ci sono segni di perdite, far avanzare leggermente il catetere (0,5 cm) e stringere il nodo del chirurgo precedentemente preparato. Eparinizzare l’animale a 100 UI/kg e applicare una garza sterile inumidita sull’area incisa. Dopo l’intervento chirurgico, mantenere l’anestesia al 3% di sevoflurano a una portata d’aria di 0,6 L/min. 6. Protocollo di shock emorragico (Figura 1) Fase 1: Stabilizzazione (5 min).Dopo l’eparinizzazione, attendere 10 minuti affinché i valori di pressione si stabilizzino. Effettuare una registrazione di 5 minuti per i valori emodinamici basali. Fase 2: Dissanguamento (5 min):NOTA: Questa fase corrisponde alla fase a volume fisso del modello.Prelevare 5 ml di sangue dall’arteria femorale in 5 minuti (500 μL/30 s) utilizzando una siringa da 1 ml (valori attesi: pressione arteriosa sistolica: 45 mmHg, pressione arteriosa diastolica: 30 mmHg). Preparare una miscela di soluzione di Ringer lattato al 50% con il 50% di sangue raccolto a temperatura ambiente. Mettere la miscela in una siringa da 2 ml e posizionarla all’estremità della cannula della vena giugulare. Fase 3: Shock emorragico (75 min)NOTA: Questa fase è la fase a pressione fissa del modello.Mantenere la pressione arteriosa media a una media di 35 mmHg. Quando la pressione arteriosa media è superiore o uguale a 38 mmHg, prelevare 200 μL di sangue attraverso l’arteria femorale (media su n = 12 ratti: 10,2 mL). Se la pressione arteriosa media scende al di sotto di 32 mmHg, iniettare 200 μL di una miscela di soluzione di Ringer 50% sangue e 50% lattato attraverso la vena giugulare (media su n = 12 ratti: 0,90 mL). Misurare il lattato nel sangue periferico su una goccia di sangue dall’estremità della coda utilizzando la punta di un ago (26 G) dopo aver preparato sterile la coda con una garza al termine della fase di shock emorragico. Fase 4: Rianimazione con fluidi per via endovenosa (20 min)Rianimare con una soluzione di Ringer lattato a temperatura ambiente (RT) a 10 ml/kg per 20 minuti (portata di 10,5 ml/h per un ratto da 350 g) con una siringa da 20 ml attraverso il catetere giugulare con una pompa a siringa. 7. Fine dell’intervento chirurgico e recupero e follow-up post-chirurgico Bloccare la vena giugulare e l’arteria femorale e rimuovere il catetere. Navi legittime. Controllare attentamente che non fuoriesca sangue. Aggiungere una goccia di anestetico locale sulle aree incise. Sutura le aree incise con punti sottocutanei e cutanei utilizzando sutura sterile 5-0. Disinfettare con soluzione di iodio povidone al 10%. Iniettare per via sottocutanea buprenorfina (0,05 mg/kg, 0,3 mL/kg) utilizzando una siringa da 1 mL con ago da 26 G. Attendere che il ratto si svezzi dall’anestesia mentre monitora la temperatura. Quando mostra segni di risveglio (vibrisse che si muovono, movimenti delle zampe), rimuovi la sonda rettale e posiziona il ratto nella sua gabbia su un tappetino riscaldante. 10 minuti dopo, riporta il ratto nella sua stanza d’alloggio. Somministrare buprenorfina per via sottocutanea (0,05 mg/kg, 0,3 mL/kg) ogni 8 ore. Valutare la frequenza respiratoria, il comportamento, la temperatura e il lattato nel sangue 16 ore dopo l’induzione dello shock emorragico, come descritto al punto 6.3. Figura 1: Modello di shock emorragico misto di ratto. Creato con BioRender.com Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 8. 24 ore dopo l’induzione dello shock emorragico Anestetizzare l’animale come descritto al punto 3.1. Posizionare l’animale sul tavolo operatorio e inserire la sonda rettale come descritto al punto 3.5. Preparare il catetere per l’incannulamento dell’arteria carotide come descritto per la vena giugulare nei passaggi 2.3 e 2.4. Usa la pinza atraumatica DeBakey per afferrare la pelle e praticare un’incisione al centro del collo con forbici fini e affilate o un bisturi. Applicare una goccia di anestetico locale (lidocaina 2%). Dilacerare delicatamente il tessuto con una pinza standard. Separare le ghiandole salivari, quindi aprire il muscolo tracheale per rivelare gli anelli tracheali. Prendi l’arteria carotide sinistra e separala dal nervo con una pinza standard (è molto probabile che la respirazione dell’animale acceleri). Legare l’arteria carotide distalmente (lato della testa) con filo di seta 4/0. Posizionare un filo di sutura sul lato prossimale (lato cuore) e preparare un nodo da chirurgo senza chiuderlo. Clamp l’arteria (posizionare il clamp a monte della sutura laterale prossimale). Incidere l’arteria carotide con le forbici da micro dissezione Vannas (un piccolo volume di sangue dovrebbe fluire dall’arteria). Utilizzando una pinza standard, afferrare delicatamente la parete dell’arteria per allargare l’apertura e incannulare l’arteria carotide con il catetere in dotazione, tenendolo con una pinza. Sbloccare e controllare il segnale di pressione per confermare il posizionamento del catetere e verificare che il sangue non rifluisca nel catetere (segno di perdita dalle valvole/trasduttore di pressione). Se il segnale è buono e non ci sono perdite, far avanzare leggermente il catetere (0,5 cm) e stringere e fissare il nodo del chirurgo precedentemente preparato. Eparinizzare l’animale a 100 UI/kg e applicare un impacco sterile inumidito sull’incisione. Dopo l’intervento chirurgico, mantenere l’anestesia utilizzando sevoflurano al 3% a una velocità del flusso d’aria di 0,6 L/min. Attendere 10 minuti per registrare i valori emodinamici delle 24 ore (valori attesi: pressione arteriosa sistolica: 120 mmHg, pressione arteriosa diastolica: 60 mmHg). Per valutare i marcatori plasmatici del danno d’organo, prelevare 1 mL di sangue dall’arteria carotide e centrifugare a 1600 x g per 10 minuti. Aliquotare e conservare il plasma per ulteriori analisi. Sacrificare il ratto subito dopo aver misurato i valori emodinamici a 24 ore e raccogliere il sangue.NOTA: Il metodo di eutanasia deve essere adattato ai parametri specifici o ai campioni che verranno raccolti in seguito. Il gruppo fittizio viene sottoposto solo a intervento chirurgico (sezioni 1-5, 7 e 8) senza la procedura di shock emorragico (sezione 6). Gli animali sono stati assegnati in modo casuale dallo sperimentatore tra i gruppi sham e shock emorragico. Solo lo sperimentatore era a conoscenza dell’assegnazione del gruppo nelle diverse fasi dell’esperimento.

Representative Results

Seguendo il protocollo sopra descritto, abbiamo valutato diversi parametri emodinamici 24 ore dopo l’induzione dello shock emorragico. La pressione arteriosa media basale (prima dell’inizio del protocollo di shock emorragico) è simile tra i gruppi di shock fittizio e emorragico (Figura 2A). Come previsto, la pressione arteriosa media è significativamente ridotta con il protocollo di shock emorragico, il che può essere spiegato dal calo della pressione arteriosa diastolica (Pressione arteriosa media: Sham: 92 mmHg ± 3 mmHg; HS: 82 mmHg ± 2 mmHg; Pressione arteriosa diastolica: 73 mmHg ± 3 mmHg; HS: 61 mmHg ± 2 mmHg) (Figura 2B, C). Lo shock emorragico non influisce sulla pressione arteriosa sistolica, sulla pressione del polso e sulla frequenza cardiaca (Figura 2D-F). L’indice di shock (rapporto frequenza cardiaca/pressione arteriosa sistolica) e l’indice di shock modificato (MSI) (rapporto frequenza cardiaca/pressione arteriosa media) sono due predittori di mortalità nei pazienti gravi14,15. Più alti sono i valori, maggiore è il rischio di mortalità. In questo modello, l’indice di shock non è modificato tra i due gruppi, mentre l’indice di shock modificato tende ad aumentare nello shock emorragico (MSI: Sham: 4,24 ± 0,11; HS: 4,70 ± 0,15) (Figura 2G,H). Figura 2: Impatto dello shock emorragico sui parametri emodinamici. (A) Pressione arteriosa media basale, (B) pressione arteriosa media, (C) pressione arteriosa diastolica, (D) pressione arteriosa sistolica, (E) pressione del polso, (F) frequenza cardiaca, (G) indice di shock e (H) indice di shock modificato tra animali Sham e shock emorragici. I risultati sono rappresentati come media ± SEM. La significatività statistica è stata valutata mediante t-test non accoppiato. *: p < 0,05; : p < 0,001. n = 6-12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. La compromissione metabolica globale durante lo shock emorragico può essere valutata mediante lattatemia. Come previsto, la latatemia è aumentata dopo il protocollo di shock emorragico e 16 ore dopo (Fine del protocollo: Sham: 1,13 mmol/L ± 0,14 mmol/L; HS: 5,98 mmol/L ± 0,39 mmol/L; H+16: Sham: 1,95 mmol/L ± 0,23 mmol/L; HS: 2,95 mmol/L ± 0,19 mmol/L) (Figura 3A, B). La temperatura e la frequenza respiratoria sono due componenti della Sindrome da Risposta Infiammatoria Sistemica (SIRS), una risposta pro-infiammatoria caratteristica dello stato di shock. Né la temperatura né la frequenza respiratoria vengono modificate tra i due gruppi 16 ore dopo l’induzione dello shock emorragico (Figura 3C, D). Abbiamo valutato l’impatto dello shock emorragico su alcuni parametri comportamentali come la postura, l’attività, ecc. (File supplementare 1). Il punteggio comportamentale è aumentato nel gruppo shock emorragico 16 ore dopo il protocollo (Sham: 0,33 ± 0,21; HS: 2,27 ± 0,69) (Figura 3E). Figura 3: Impatto dello shock emorragico sulla lattatemia, sulla temperatura, sulla frequenza respiratoria e sul punteggio comportamentale. (A) Lattatemia alla fine del protocollo di shock emorragico, (B) lattatemia, (C) temperatura, (D) frequenza respiratoria e (E) punteggio comportamentale 16 ore dopo l’induzione dello shock emorragico tra animali Sham e shock emorragico. I risultati sono rappresentati come media ± SEM. La significatività statistica è stata valutata mediante t-test non accoppiato. *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001. n = 6-12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Lo shock emorragico è associato a una disfunzione d’organo. Al fine di valutare se il modello potesse essere clinicamente rilevante, abbiamo valutato i marcatori plasmatici di danno d’organo 24 ore dopo il protocollo. La creatininemia (Sham: 19,13 μmol/L ± 0,33 μmol/L; HS: 28,88 μmol/L ± 2,69 μmol/L), la troponina cardiaca T (Sham: 9,38 ng/L ± 1,87 ng/L; HS: 35,62 ng/L ± 2,28 ng/L) e l’aspartato e l’alanina amino transferasi (ASAT: Sham: 221 UI/L ± 48 UI/L; HS: 963 UI/L ± 144 UI/L; ALAT: Sham: 36 UI/L ± 4 UI/L; HS: 323 UI/L ± 13 UI/L) che riflettono danni rispettivamente al rene, al cuore e al fegato sono tutti significativamente aumentati con lo shock emorragico (Figura 4). Figura 4: Il modello di shock emorragico è associato a disfunzione d’organo. (A) Livelli di creatininemia, (B) troponina T cardiaca, (C) aspartato aminotransferasi e (D) alanina aminotransferasi 24 ore dopo l’induzione dello shock emorragico tra Sham e animali da shock emorragico. I risultati sono rappresentati come media ± SEM. La significatività statistica è stata valutata mediante t-test non accoppiato. *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001. n = 4 Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. File supplementare 1: Dettagli del punteggio comportamentale Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussion

In questo articolo, abbiamo descritto per la prima volta un modello rappresentativo di shock emorragico basato su un mix tra i modelli a pressione fissa e a volume fisso. Abbiamo dimostrato che 24 ore dopo l’induzione dello shock, il nostro modello è associato ad un’alterazione dei parametri emodinamici e del metabolismo.

A causa della sua complessa fisiopatologia, lo studio dello shock emorragico richiede l’utilizzo di modelli animali integrati. Infatti, gli approcci in vitro non possono imitare tutti i percorsi coinvolti in questa malattia. Il risveglio degli animali dopo il protocollo di shock emorragico è un passaggio che garantisce una migliore replicazione della situazione clinica. A causa della difficoltà di svegliare gli animali, pochissimi studi hanno incluso questa fase. I rari studi che svegliano gli animali li sacrificano in tempi brevi (2 ore o 6 ore), il che non riflette pienamente ciò che sta accadendo per i pazienti 16,18,23,24. Nonostante lo sviluppo di modelli di shock emorragico, solo pochi studi hanno valutato i parametri (infiammazione, apoptosi, disfunzione d’organo) 24 h dopo l’induzione dello shock, evidenziando così la difficoltà di questo tipo di protocollo 25,26,27. Lo sviluppo di modelli informatici e matematici ha rivoluzionato la ricerca. Sono stati sviluppati numerosi modelli matematici di shock emorragico, ma la maggior parte di questi modelli non tiene conto dell’intera gamma di scambi di fluidi corporei durante lo shock emorragico e richiede miglioramenti prima della potenziale applicabilità clinica28. Ad oggi, una delle sfide principali è lo sviluppo di un modello animale che imiti il più fedelmente possibile la patologia nell’uomo.

In letteratura è descritto un gran numero di modelli di shock emorragico che si differenziano per approcci vascolari, volumi di sangue prelevati o pressione mirata13. Più in generale, i modelli di shock emorragico possono essere classificati in 3 gruppi: emorragia a volume fisso, emorragia a pressione fissa ed emorragia incontrollata. La standardizzazione e la riproducibilità con l’emorragia a volume fisso sono difficili e spiegate dal rapporto volume ematico/peso corporeo, che diminuisce linearmente con il peso del ratto. L’emorragia a pressione fissa è molto utilizzata, spiegando così che le impostazioni (pressione mirata, durata dello shock) sono molto variabili da uno studio all’altro, rendendo difficile la trasposizione dei risultati da un modello all’altro. È anche importante sottolineare che la compromissione emodinamica, che svolge un ruolo fondamentale nella fisiopatologia dello shock emorragico, non viene valutata sistematicamente, il che potrebbe aumentare la discrepanza nei risultati tra gli studi. Infine, il modello dell’emorragia incontrollata, sebbene clinicamente rilevante, solleva questioni di riproducibilità ed etica. Al fine di conciliare il più possibile rilevanza clinica, standardizzazione e riproducibilità, abbiamo sviluppato un modello misto con fasi sia a volume fisso che a pressione fissa.

Nel modello qui descritto, la temperatura e la frequenza respiratoria non vengono modificate 24 ore dopo l’intervento. Ciò può essere spiegato dal fatto che la chirurgia viene eseguita in condizioni sterili, limitando così la risposta pro-infiammatoria. Lo shock emorragico è definito come un’insufficienza circolatoria acuta dovuta a perdita di sangue associata a un calo della pressione sanguigna. Come nell’uomo, questo modello di shock emorragico provoca una diminuzione della pressione arteriosa media, in particolare a causa di una diminuzione della pressione arteriosa diastolica. È interessante notare che, come descritto in precedenza, la frequenza cardiaca è invariata dopo la fase di rianimazione in questo modello di shock emorragico 29,30,31. Il calo della pressione arteriosa media è probabilmente associato a una ridotta perfusione d’organo, che porta a disfunzione multiviscerale, che può essere illustrata dall’aumento di vari marcatori plasmatici nel nostro modello (creatininemia, troponina T cardiaca, ASAT e ALAT). L’interruzione dell’apporto di ossigeno porta al metabolismo anaerobico, che provoca un aumento della lattatemia32. Come descritto in precedenza, questo modello di shock emorragico porta ad un aumento dei livelli di lattato nel sangue30. Questo aumento potrebbe essere associato all’ischemia causata a livello dell’arteria femorale. Tuttavia, considerando che gli animali del gruppo fittizio hanno una lattemia fisiologica e sono stati sottoposti alla stessa procedura chirurgica del gruppo shock emorragico, sembrerebbe che questo aumento sia legato al protocollo di shock emorragico. Nel loro insieme, tutti questi dati confermano che il protocollo descritto in questo studio consente lo sviluppo di un nuovo modello rilevante di shock emorragico nel ratto.

Il limite di questo modello è l’uso dell’eparina, fondamentale per ridurre la naturale coagulazione del sangue quando viene a contatto con materiali plastici come le cannule. Tuttavia, l’uso di eparina può influire sulla coagulopatia associata allo shock emorragico traumatico33. Questo studio coinvolge animali maschi sani di età compresa tra 11 e 13 settimane. Considerando che il sesso, l’età e le comorbidità (ipertensione, diabete, ecc.) possono influire sui risultati, sarebbe rilevante valutare il loro impatto nel nostro modello. Nel protocollo, la fase di rianimazione viene eseguita tramite un’iniezione di Ringer Lactate, un cristalloide che potrebbe favorire la coagulopatia e l’edema tissutale34. Sebbene l’uso di emoderivati sia ottimale, questi sono scarsi e deperibili e potrebbe essere difficile avere una scorta sufficiente di sangue di ratto per l’intero protocollo. I modelli di shock emorragico per la rianimazione basati su emoderivati e cristalloidi/colloidi sono due approcci complementari.

I punti di forza di questo modello sono 1) la sua elevata riproducibilità (illustrata dalla bassa variabilità dei risultati), 2) la sua facilità di applicazione (la maggior parte degli strumenti sono classici e sono noti approcci vascolari) e 3) la sua rilevanza clinica, in particolare a causa del risveglio animale e della disfunzione multi-viscerale. Sulla base del punteggio comportamentale descritto nel File supplementare 1, sono stati stabiliti dei punti limite. Il sacrificio sarà discusso se si raggiunge un punteggio superiore a 9, secondo la tabella allegata. Se viene raggiunto un punteggio di 11, l’animale verrà sistematicamente soppresso. In questo studio, nessuno degli animali ha raggiunto un punteggio superiore a 8 e, pertanto, nessuno è stato escluso dallo studio. Questo potrebbe spiegare perché il modello qui descritto è associato a un tasso di mortalità 3 volte inferiore a quello dell’altro studio di 24 ore (16% vs. 47%)25.

La fase critica del modello è la fase di shock emorragico. È importante rispettare l’intervallo di pressione di 32-38 mmHg. Infatti, abbiamo osservato che il mantenimento di pressioni arteriose medie al di sotto di 32 mmHg ha comportato un rapido e brusco calo della pressione. Al contrario, il mantenimento di una pressione superiore a 38 mmHg non fornisce un modello sufficientemente vicino alla realtà clinica. Queste osservazioni sono in accordo con l’intervallo di pressione arteriosa media mirato in altri modelli13.

In conclusione, abbiamo dimostrato che il modello di shock emorragico di ratto descritto in questo studio è clinicamente rilevante e potrebbe essere utile sia nella comprensione dei meccanismi fisiopatologici attraverso l’identificazione di nuovi attori/percorsi biologici, sia nell’identificazione di nuove strategie terapeutiche testando diverse molecole candidate.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalla “Société Française d’Anesthésie et de Réanimation” (Parigi, Francia), dalla “Fondation d’entreprises Genavie” (Nantes, Francia), dalla “Fédération française de cardiologie” (Francia), dalla “Agence nationale de la recherche” (20-ASTC-0032-01-hErOiSmE) (Parigi, Francia) e dalla “Direction Générale de l’Armement” (Parigi, Francia). Thomas Dupas è stato sostenuto da sovvenzioni della Direction Générale de l’Armement (DGA), Francia e della Région des Pays de la Loire durante il suo dottorato. Antoine Persello è stato sostenuto da sovvenzioni di InFlectis BioScience, Francia durante il suo dottorato. Ringraziamo l'”Agence Nationale de la Recherche” (Parigi, Francia), la “Direction Générale de l’Armement” (Parigi, Francia) e l’associazione “Sauve ton coeur” (Francia) per aver sostenuto questo lavoro. Ringraziamo la struttura centrale UTE IRS-UN (SFR Bonamy, Nantes Université, Nantes, Francia) e la struttura centrale IBISA Therassay (Nantes, Francia) per la loro assistenza e supporto tecnico.

Materials

1 mL syringe TERUMO MDSS01SE
2.5 mL syringe TERUMO SS*02SE1
20 mL syringe TERUMO MDSS20ESE
Anesthesia induction chamber TEMSEGA HUBBIV4
BD Microlance 3 23 G needle Becton Dickinson 300800
BD Microlance 3 26 G needle Becton Dickinson 304300
Blood pressure transducer emka TECHNOLOGIES BP_T
Buprecare Axience N/A 1 mL vial, buprenorphine 0.3 mg/mL
DE BAKEY, Atraumatic Vascular Forceps ALLGAIER instrumente medical 09-543-150
Dermal Betadine 10% Mylan N/A 125 mL bottle
Fine Forceps – Curved / Serrated Fine Science Tools 11065-07
GraphPad Prism 8 GraphPad by Dotmatics –
Heating mats TEMSEGA OPT/THERM_MATELASSTEREORATS
Heparin sodium PANPHARMA  N/A 5 mL bottle, 5,000 UI/mL
IOX2 software emka TECHNOLOGIES IOX_BASE_4c + IOX_FULLCARDIO_4a
Iris Scissors – ToughCut Fine Science Tools 14058-11
Lidocaine Fresenius N/A 10 mL bootle, 8.11 mg, lidocaine hydrochloride
MiniHub-V3.2 TEMSEGA PF006
Moria 201/A Vessel Clamp – Straight Fine Science Tools 18320-11
Non sterile compresses Raffin 70189
Non sterile drape Dutscher  30786
Olsen-Hegar Needle Holder with Scissors  Fine Science Tools 12002-12
Polyethylene tubing PE10 PHYMEP BTPE-10
Polyethylene tubing PE50 PHYMEP BTPE-50
Rats Charles Rivers – Male WISTAR HAN (10 weeks)
Rectal probe TEMSEGA SONDE_TEMP_RATS
Ringer Lactates Fresenius Kabi 964175
Scrub Betadine 4% Mylan N/A 125 mL bottle
Sevoflurane Abbott N/A 250 mL bottle, gas 100%
Sevoflurane Vaporizer TEMSEGA SEVOTEC3NSELEC
StatStrip lactate test strips Nova Biomedical 47486
StatStrip Xpress lactate Meter Nova Biomedical 47486
Sterile compresses Laboratoire SYLAMED 211S05-50
Sterile drape Mölnlycke 800330
Steriles gloves MEDLINE MSG7275
Suture Optilene 3097141
Suture for vessels SMI 8150046
Syringe pump Vial médical 16010
usbAMP emka TECHNOLOGIES –
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-00
Vaseline Cooper N/A 10 mL vial
Vitamin A Dulcis (ALLERGAN) Allergan N/A 10 g tube, Retinol
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Dupas, T., Aillerie, V., Vergnaud, A., Pelé, T., Persello, A., Blangy-Letheule, A., Erraud, A., Erfanian, M., Hivonnait, A., Maillard, A., Lecomte, J., Bigot-Corbel, E., Leroux, A. A., Denis, M., Rozec, B., Lauzier, B. Developing a Clinically Relevant Hemorrhagic Shock Model in Rats. J. Vis. Exp. (205), e66523, doi:10.3791/66523 (2024).
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