Larvalardan Gençlik Dönemlerine Kadar Mikropsuz Zebra Balığı Modellerinin Üretimi, Bakımı ve Tanımlanması

Mikrobiyota (yani Arkeler, Bakteriler, Ökarya ve virüsler), bireylerde bağırsak bariyeri, epitel yüzeyi ve müsin fonksiyonları içindeki simbiyotik etkileşimler yoluyla fizyolojik ve patolojik süreçleri etkileyerek konak sağlığının korunmasında ve çeşitli hastalıkların gelişimine katkıda bulunmada çok önemli roller oynar ^1,2,3. Mikrobiyotanın bebeklikten gençliğe, yetişkinliğe ve yaşlanmaya kadar farklı yaşam evrelerindeki bileşimi ve ayrıca burun, ağız, cilt ve bağırsak bölgeleri gibi çeşitli yerlerdeki varlığı, çeşitli habitatlar ve ortamlar tarafından dinamik olarak şekillendirilir⁴. Organizmalardaki bağırsak mikrobiyotası, besin emilimi, bağışıklık tepkisi, patojen istilası, metabolik düzenleme vb.^{ile ilgilidir 5,6}. Hastalar üzerinde yapılan çalışmalar, bağırsak mikrobiyotasındaki bozulmaların insan obezitesi, uyku bozuklukları, depresyon, inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD), nörodejeneratif hastalıklar (Parkinson, Alzheimer), yaşlanma ve çeşitli kanserlerle ilişkili olduğunu göstermiştir ^7,8,9. Ayrıca, bağırsak mikrobiyotası ve konakçılar arasındaki etkileşimli yollar, fareler ve balık modelleri kullanılarak yapılan önceki araştırmalarda gözlemlendiği gibi, inflamatuar faktörleri, nörotransmiterleri, metabolitleri, bağırsak bariyerini ve oksidatif stresi içerir^10,11.

Son zamanlarda, potansiyel probiyotikler ve fekal mikrobiyota transplantasyonu (FMT) dahil olmak üzere çoklu bakteri ile ilgili yaklaşımlar veya tedaviler, klinik ve hayvan modellerinde bu bozukluklar için araştırılmıştır. Bu keşifler, mikrobiyota-bağırsak-beyin/karaciğer/böbrek ekseni, mikrobiyota türevi ürünler ve değiştirilmiş reseptör aktivitesi^12,13 ile ilgili keşiflere dayanmaktadır. Bununla birlikte, mikrobiyota konak sisteminin gelişimi, çeşitli işlevleri ve mekanizmaları, mikrobiyal topluluğun karmaşıklığı ve güçlü insan benzeri hastalık modelleri üretmenin zorluğu nedeniyle hala tam olarak anlaşılmamış ve tanımlanmamıştır.

Bu sorunları ele almak için, mikropsuz (GF) hayvan modelleri 19^{. yüzyılın} ortalarında acilen önerildi ve öncelikle 20^{. yüzyılda geliştirildi}. Mikrobiyal tespit ve gözlem teknolojilerindeki gelişmelerin yanı sıra antibiyotikle tedavi edilmiş ve gnotobiyotik modeller de dahil olmak üzere müteakip iyileştirmeler, bu modelleri daha da mükemmelleştirdi 14,15,16. Kendi geçmişlerini silerek ve çevresel mikroplardan kaçınarak yaratılan GF hayvanları, mikroorganizmalar ve konakçıları arasındaki etkileşimleri keşfetmek için mükemmel bir strateji sunar¹⁷. Hayvan modellerinin ve rafine protokollerin uygulanmasıyla, araştırmacılar GF farelerinde ve balıklarda hastalarda bulunan benzer mikrobiyal bileşimleri başarıyla kopyaladılar. Ek olarak, köpekler, tavuklar ve domuzlar gibi diğer GF hayvan modelleri, araştırma konuları olarak çeşitli seçenekler sunar 18,19,20,21. Bu yaklaşım, kommensal mikrobiyomların insanlarda kanser immünoterapisi de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar üzerindeki potansiyel terapötik etkilerinin araştırılmasını sağlamıştır ^16,18. GF modelleri, konakçılar içindeki spesifik bakteri kolonizasyonu, göçü, çoğalması ve etkileşiminin özellikleri ve mekanizmaları hakkında daha doğru bilgiler sunar. Bu, mikrobiyota ile ilgili hastalıkların ortaya çıkışı ve gelişimi hakkında çok önemli yeni bilgiler sağlar^22,23. Mikrobiyal araştırmalarda GF zebra balığının kurulması ve uygulanmasının tarihi, 2004’te Rawls ve ark. ve 2006’da Bates ve ark.’nın raporlarından 2017’de^Melancon ve ark.’nın protokolüne kadar gelişmiştir ^16,24,25. Bununla birlikte, yetişkin veya üreyen GF modellerinin fizibilitesi, değişken uzun ömür, başarı oranları ve sağlık sorunlarının eşlik ettiği uzun bir süreçtir.

Çeşitli hayvan modelleri arasında zebra balığı (Danio rerio), insan organlarına ve genomiklere avantajlı benzerliği, kısa gelişim döngüsü, yüksek doğurganlığı ve şeffaf embriyoları nedeniyle hem temel hem de biyomedikal araştırmalar için kritik bir araç olarak öne çıkmaktadır^19,26. Güvenilir insan hastalığı modelleri olarak hizmet veren zebra balığı, in vivo fizyolojik ve patolojik süreçlerin görsel bir temsilini sunarak, konakçı-mikrop etkileşimlerinin çekici özellikleri hakkında fikir verir. Özellikle, zebra balığı, bağırsak fizyolojisi, mikrobiyal dinamikler, gonadlar ve üreme gelişimi, konakçı bağışıklık sisteminin olgunlaşması, davranış ve metabolizmanın görüntülenmesine izin veren farklı hücre soyları sergiler²⁷. Zebra balığı embriyoları, yumurtadan çıkana kadar koruyucu koryonlar içinde gelişir ve döllenmeden 3 gün sonra (dpf) larva haline gelir. Aktif olarak 5 dpf’de yiyecek avlarlar ve döllenmeden yaklaşık 3 ay sonra (mpf) cinsel olgunluğa ^{ulaşırlar28}. Rawls ve ^ark.24 tarafından bildirilen ilk başarılı mikropsuz (GF) zebra balığı, yumurta sarısı emiliminden sonra otoklavlanmış yemle beslenen larvaların 8 dpf’den doku nekrozu ve 20 dpf’de toplam ölüm sergilediğini gösterdi. Bu, diyetin etkilerini veya uzun süreli (>7 dpf) GF balıklarını içeren deneylerde dışsal besin tedarikini dikkate almanın önemini gösterdi²⁹. Daha sonraki çalışmalar, steril gıda ve farklı balık modellerinde mükemmelleştirilen yöntemler kullanarak GF balıklarının üretim protokolünü geliştirdi¹⁶.

Bununla birlikte, GF zebra balığı modelleri üzerine yapılan araştırmaların çoğu, deneylerin sonunda 24 ila 48 saat boyunca 5 dpf’de bakteriyel enfeksiyonu içeren erken yaşam evrelerine odaklanmıştır^{ve deneylerin} sonunda 7 dpf’den önce toplanan örnekler ^25,30,31. İnsanlar ve zebra balıkları da dahil olmak üzere organizmalardaki mikrobiyotanın yaşamın başlangıcında kolonize olduğu ve büyüme ve gelişme sırasında şekillendiği yaygın olarak kabul edilmektedir. Bileşim yetişkin aşamalarında stabil kalır, konakçıdaki mikrobiyotanın rolleri, özellikle yaşlanma, nörodejeneratif, metabolik ilişkili obezite ve bağırsak hastalığı yönlerinde yaşam boyunca çok önemlidir³. Bu nedenle, daha uzun sağkalıma sahip GF hayvanlarından elde edilen bakış açıları, balık larvalarının erken yaşamdaki olgunlaşmamış bağışıklık ve üreme sistemlerini göz önünde bulundurarak, konakçı organ gelişimi ve işlevlerindeki mikrobiyal rollerin mekanizmaları hakkında fikir verebilir. Zebra balığı bağırsaklarındaki bakteri suşları önceki çalışmalarda izole edilmiş ve tanımlanmış olsa da, GF hayvan modellerini probiyotikleri seçmek veya konakçıdaki bakteri fonksiyonlarını araştırmak için enfekte etme potansiyeli sunarken^19,25, GF balık modellerinin üretimi ve uygulanması öncelikle erken yaşam evreleriyle sınırlandırılmıştır. Karmaşık üretim sürecine, yüksek bakım maliyetlerine ve gıda ve bağışıklıkla ilgili sorunlara atfedilen bu sınırlama, konakçıdaki mikrobiyotanın gelişimsel ve kronik etkilerini araştırmayı amaçlayan araştırma çabalarını engellemektedir.

Balıkların hayatta kalma oranı, davranışı, büyümesi, olgunlaşması ve genel sağlığı, özellikle mikropsuz (GF) modellerde, erken larvalardan yavrulara kadar ağız açık döneminde besin alımını ve emilimini kapsayan beslenme uygulamalarından önemli ölçüde etkilenir^32,33. Bununla birlikte, GF balık yetiştiriciliğindeki zorluklardan biri, larvaların büyümesini ve hayatta kalmasını sürdürmek için beslenme desteğinin etkinliğini sınırlayan uygun steril diyetlerin kıtlığıdır. Bu sorunu çözmek, gelişimsel savunma mekanizmaları ve bağırsak mikrobiyomunun olmaması nedeniyle zayıf sindirim yetenekleri göz önüne alındığında, GF balıklarının yaşamını eski haline getirmek için çok önemlidir. Gıda açısından canlı salamura karides (Artemia sp.) ağzı açık larvalar ve yavru balıklar için en uygun diyet olarak karşımıza çıkmaktadır. Canlı salamura karides ile beslenen balıkların, pişmiş yumurta sarısı veya diğer doğal ve sentetik yemlerle beslenenlere göre daha yüksek büyüme ve hayatta kalma oranları sergilediği görülmüştür³⁴. GF balıklarının erken yaşam modelleri yumurta sarısı desteği ile hayatta kalabilirken ve GF larva modelleri steril besleme ile korunabilirken, larvalardan yavrulara kadar uzun vadeli modeller oluşturmak ve cinsel olgunluğa ulaşmak zor olmaya devam etmektedir. Ek olarak, pul veya toz gıdalar eşit olmayan besin bileşimi ile sınırlıdır ve su kalitesini etkileyebilir. Buna karşılık, canlı Artemia’nın hem tuzlu hem de tatlı suda hayatta kalması, larvalar için yetişkinlere uygun küçük boyut, harmanlama kolaylığı ve daha yüksek kuluçka kalitesi gibi avantajları vardır³⁵. Önceki yöntemlere (^16,24,30) dayanarak, karmaşık tedavi sürecini basitleştirdik ve erken yaştaki GF balıklarından daha uzun süre steril bir yem olarak kolayca kuluçkaya yatırılan GF live Artemia sp. oluşturarak diyet zorluğunu ele aldık.

Bu çalışma, mikropsuz (GF) zebra balıklarının embriyolardan larvalara ve gençlik aşamalarına kadar büyümesini sağlamak için (1) nesil, (2) bakım, (3) steril oranın belirlenmesi ve (4) bakım ve beslemeyi kapsayan optimize edilmiş bir protokol sunmaktadır. Sonuçlar, GF zebra balığının yumurtadan çıkması, hayatta kalması, büyümesi ve kısırlığı hakkında ön kanıtların yanı sıra GF Artemia sp. steril gıda olarak. Model oluşturma ve steril canlı mamaların hazırlanmasındaki ayrıntılı adımlar, mikrobiyota-konak etkileşimi araştırmalarında GF Artemia sp.’nin yanı sıra uzun vadeli GF balık modellerinin oluşturulması ve uygulanması için çok önemli teknik destek sağlar. Protokol, GF balık modellerinde bakteriyel izolasyon, tanımlama ve enfeksiyonu ele alarak, bakteriyel floresan etiketleme yöntemlerini ana hatlarıyla belirtir ve mikroskop altında balık bağırsaklarında kolonizasyonlarını gözlemler. GF balıkları, bakteriyel enfeksiyonu olan gnotobiyotik balıklar veya transfer edilen insan mikrobiyota modelleri, işlevlerini ve konakçı bağışıklığı, sindirim, davranış, transkriptomik düzenleme ve metabolik yönler üzerindeki etkilerini aydınlatmak için çeşitli tespitlere tabi tutulacaktır. Uzun vadede, bu protokol deniz medaka gibi farklı vahşi tip balık türlerine ve potansiyel olarak belirli dokular veya hastalıklarla ilişkili diğer seçilmiş transgenik zebra balığı hatlarına genişletilebilir.