유충에서 유년기까지 무균 제브라피시 모델의 생성, 유지 관리 및 식별
Summary
이 프로토콜은 무균(GF) 어류 배아를 얻고 유충에서 유년기까지 유지하기 위한 주요 단계를 간략하게 설명하며, 여기에는 불임 상태 샘플링 및 감지가 포함됩니다. 감염과 함께 GF 모델을 사용하는 것은 숙주 건강에서 미생물의 역할을 이해하는 데 중요합니다.
Abstract
제브라피쉬는 포유류와의 게놈적 유사성, 상대적으로 깨끗한 융모막 환경에서 발달한 투명한 배아, 설치류 모델에 비해 매우 빠른 유충 발달로 인해 성장, 면역 및 장내 미생물군에 대한 연구에 귀중한 모델 역할을 합니다. 무균(GF) 제브라피시(Danio rerio)는 오염 물질 독성을 평가하고 미생물 기능과 관련된 인간과 유사한 질병 모델을 확립하는 데 중요합니다. Conventionally Raised (CR) 모델 (일반 양식의 물고기)과 비교하여 GF 제브라피쉬는 숙주 미생물군을 보다 정확하게 조작할 수 있어 미생물과 숙주 간의 인과 관계를 결정하는 데 도움이 됩니다. 결과적으로, 그들은 이러한 관계에 대한 우리의 이해를 발전시키는 데 중요한 역할을 합니다. 그러나 GF 제브라피시 모델은 일반적으로 면역 기능과 영양소 흡수의 제한으로 인해 초기 생애 단계(배아에서 유충까지)에서 생성 및 연구됩니다. 이 연구는 GF 식품( 예: Artemia sp., 염수 새우)을 사용하여 먹이를 주지 않고 장기간 먹이를 주는 초기 GF 제브라피시 모델의 생성, 유지 관리 및 식별을 최적화합니다. 프로세스 전반에 걸쳐 일일 샘플링 및 배양이 수행되었으며 플레이트 및 16S rRNA 염기서열분석을 포함한 여러 검출을 통해 식별되었습니다. GF 제브라피쉬의 무균 속도, 생존 및 발달 지수를 기록하여 생성된 모델의 품질과 수량을 보장했습니다. 중요한 것은 이 연구가 GF 물고기에 대한 박테리아 분리 및 감염 기술에 대한 세부 정보를 제공하여 GF 식품 지원을 통해 유충에서 유년기까지 GF 물고기 모델을 효율적으로 생성할 수 있다는 것입니다. 이러한 절차를 생물 의학 연구에 적용함으로써 과학자들은 장내 박테리아 기능과 숙주 건강 간의 관계를 더 잘 이해할 수 있습니다.
Introduction
미생물군(즉, 고세균, 박테리아, 진핵생물 및 바이러스)은 개인의 장 장벽, 상피 표면 및 점액 기능 내에서 공생적 상호 작용을 통해 생리학적 및 병리학적 과정에 영향을 미침으로써 숙주의 건강을 유지하고 다양한 질병의 발병에 기여하는 데 중요한 역할을 합니다 1,2,3. 유아기에서 청소년기, 성인기, 노화기에 이르기까지 다양한 생애 단계에 걸친 미생물군의 구성과 비강, 구강, 피부 및 장 부위와 같은 다양한 위치에 존재하는 미생물총은 다양한 서식지와 환경에 의해 동적으로 형성됩니다4. 유기체의 장내 미생물군은 영양소 흡수, 면역 반응, 병원체 침입, 대사 조절 등에 관여합니다 5,6. 환자에 대한 연구에 따르면 장내 미생물군의 교란은 인간의 비만, 수면 장애, 우울증, 염증성 장 질환(IBD), 신경 퇴행성 질환(파킨슨병, 알츠하이머병), 노화 및 다양한 암과 관련이 있습니다 7,8,9. 또한, 장내 미생물군과 숙주 사이의 상호 작용 경로에는 염증 요인, 신경 전달 물질, 대사 산물, 장 장벽 및 산화 스트레스가 포함되며, 이는 생쥐와 어류 모델을 사용한 이전 연구에서 관찰되었습니다10,11.
최근에는 임상 및 동물 모델에서 이러한 질환에 대한 잠재적인 프로바이오틱스 및 분변 미생물군 이식(FMT)을 포함한 여러 박테리아 관련 접근법 또는 치료법이 탐구되었습니다. 이러한 탐색은 미생물군-장-뇌/간/신장 축, 미생물군 유래 산물 및 변형된 수용체 활성과 관련된 발견을 기반으로 합니다12,13. 그러나 미생물군 숙주 시스템의 개발, 다양한 기능 및 메커니즘은 미생물 군집의 복잡성과 강력한 인간과 유사한 질병 모델을 생성해야 하는 과제로 인해 여전히 완전히 이해되고 식별되지 않습니다.
이러한 문제를 해결하기 위해 19세기 중반에 무균(GF) 동물 모델이 긴급히 제안되었으며 주로 20세기에 개발되었습니다. 미생물 검출 및 관찰 기술의 발전과 함께 항생제 처리 및 gnotobiotic 모델을 포함한 후속 개선은 이러한 모델을 더욱 완성했습니다 14,15,16. 자신의 배경을 지우고 환경 미생물을 피함으로써 만들어진 GF 동물은 미생물과 숙주 사이의 상호 작용을 탐구하기 위한 훌륭한 전략을 제공한다17. 동물 모델과 정제된 프로토콜의 적용을 통해 연구원들은 GF 마우스와 어류의 환자에서 발견되는 유사한 미생물 구성을 성공적으로 복제했습니다. 또한, 개, 닭, 돼지와 같은 다른 GF 동물 모델은 연구 대상(18,19,20,21)으로서 다양한 옵션을 제공한다. 이 접근법은 인간의 암 면역 요법을 포함하여 다양한 질병에 대한 공생 마이크로바이옴의 잠재적 치료 효과에 대한 연구를 가능하게 했습니다16,18. GF 모델은 숙주 내 특정 박테리아 집락화, 이동, 증식 및 상호 작용의 특성과 메커니즘에 대한 보다 정확한 통찰력을 제공합니다. 이는 미생물총(microbiota) 관련 질병의 발생 및 발병에 대한 중요한 새로운 통찰력을 제공합니다22,23. 미생물 연구에서 GF 제브라피시를 확립하고 적용하는 역사는 2004년 Rawls et al.과 2006년 Bates et al.의 보고서에서 2017년 Melancon et al.의 프로토콜(16,24,25)로 발전했습니다. 그러나 성체 또는 번식 GF 모델의 실현 가능성은 여전히 장기간의 과정이며 다양한 수명, 성공률 및 건강 문제를 수반합니다.
다양한 동물 모델 중에서 제브라피시(Danio rerio)는 인간 장기 및 유전체학과의 유리한 유사성, 짧은 발달 주기, 높은 번식력 및 투명한 배아로 인해 기초 및 생물 의학 연구 모두에 중요한 도구로 두드러집니다19,26. 제브라피쉬는 신뢰할 수 있는 인간 질병 모델 역할을 하며, 생체 내에서 생리학적 및 병리학적 과정을 시각적으로 표현하여 숙주-미생물 상호 작용의 매력적인 특징에 대한 통찰력을 제공합니다. 특히, 제브라피쉬는 뚜렷한 세포 계통을 나타내어 장 생리학, 미생물 역학, 생식선 및 생식 발달, 숙주 면역 체계의 성숙, 행동 및 신진대사를 이미징할 수 있습니다27. 제브라피시 배아는 부화할 때까지 보호 융모막 내에서 발달하여 수정 후 3일(dpf)에 유충이 됩니다. 그들은 5 dpf에서 적극적으로 먹이를 사냥하고 수정 후 약 3 개월 (mpf) 28 성적 성숙에 도달합니다. Rawls et al.24에 의해 보고된 최초의 성공적인 무균(GF) 제브라피쉬는 난황 흡수 후 오토클레이브 사료를 먹인 유충이 8 dpf에서 조직 괴사와 20 dpf에서 총 폐사를 나타냈다는 것을 보여주었습니다. 이는 장기(>7 dpf) GF 물고기를 대상으로 한 실험에서 식이요법의 효과 또는 외인성 영양소 공급을 고려하는 것의 중요성을 나타냈다29. 후속 연구는 다양한 물고기 모델에서 완성된 멸균 식품과 방법을 사용하여 GF 물고기의 생성 프로토콜을 개선했습니다16.
그러나 GF 제브라피시 모델에 대한 대부분의 연구는 24시간에서 48시간 동안 5dpf에서 세균 감염을 포함하는 초기 생애 단계에 초점을 맞추었으며, 실험 종료 시 7dpf 이전에 수집된 샘플은 25,30,31입니다. 인간과 제브라피시를 포함한 유기체의 미생물총(microbiota)은 생명이 시작될 때 군락을 이루고 성장과 발달 과정에서 형성된다는 것은 널리 알려진 사실입니다. 이 조성은 성인 단계에서 안정적으로 유지되며, 숙주에서 미생물군의 역할은 특히 노화, 신경 퇴행성, 대사 관련 비만 및 장 질환 측면에서 일생 동안 매우 중요합니다3. 따라서 생존 기간이 더 긴 GF 동물의 관점은 어린 시절 어류 유충의 미성숙한 면역 및 생식 시스템을 고려할 때 숙주 기관 발달 및 기능에서 미생물 역할의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 제브라피쉬 장의 박테리아 균주는 이전 연구에서 분리 및 확인되어 GF 동물 모델을 감염시켜 프로바이오틱스를 선택하거나 숙주19,25에서 박테리아 기능을 연구할 수 있는 가능성을 제공했지만, GF 피쉬 모델의 생성 및 적용은 주로 초기 생애 단계로 제한되어 왔습니다. 복잡한 생산 공정, 높은 유지 보수 비용, 식품 및 면역과 관련된 문제로 인한 이러한 한계는 숙주에서 미생물군의 발달 및 만성 영향을 조사하기 위한 연구 노력을 방해합니다.
특히 무균(GF) 모델에서 어류의 생존율, 행동, 성장, 성숙 및 전반적인 건강은 초기 유충에서 유년기에 이르기까지 입을 벌리고 있는 기간 동안의 영양 섭취 및 흡수를 포함하는 먹이 관행에 의해 크게 영향을 받는다32,33. 그러나 GF 어류 사육의 과제 중 하나는 적절한 멸균 식단이 부족하여 유충의 성장과 생존을 유지하기 위한 영양 지원의 효과를 제한한다는 것입니다. 이 문제를 해결하는 것은 장내 미생물군집의 부재로 인한 발달 방어 메커니즘과 약한 소화 능력을 고려할 때 GF 물고기의 생명을 회복하는 데 매우 중요합니다. 먹이 측면에서 살아있는 소금물 새우 (Artemia sp.)는 어린 물고기에게 입을 벌리고 있는 유충에게 가장 적합한 식단으로 부상하고 있습니다. 살아있는 소금물 새우를 먹인 물고기는 조리된 달걀 노른자 또는 기타 천연 및 합성 미끼를 먹인 물고기에 비해 더 높은 성장률과 생존율을 보이는 것으로 관찰되었습니다34. GF 물고기의 초기 모델은 노른자 지원으로 생존할 수 있고 GF 유충 모델은 멸균 공급으로 유지할 수 있지만 유충에서 유년기에 이르기까지 장기적인 모델을 생성하고 성적 성숙에 도달하는 것은 여전히 어려운 일입니다. 또한 플레이크 또는 분말 식품은 불균등한 영양 구성으로 인해 제한되며 수질에 영향을 미칠 수 있습니다. 대조적으로, 살아있는 쑥은 바닷물과 담수 모두에서 생존하고, 유충에서 성충까지 적합한 작은 크기, 배치의 용이성, 더 높은 부화 품질 등의 장점이 있습니다35. 이전 방법 16,24,30을 기반으로 우리는 복잡한 처리 과정을 단순화하고 쉽게 배양할 수 있는 GF 살아있는 Artemia sp.를 초기 생전 GF 물고기보다 더 오랜 기간 동안 멸균 식품으로 설정함으로써 다이어트 문제를 해결했습니다.
이 연구는 (1) 생성, (2) 유지, (3) 멸균 속도 식별, (4) 무균(GF) 제브라피쉬의 배아에서 유충 및 유년기 성장까지 보장하기 위한 유지 관리 및 먹이를 포괄하는 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이 결과는 GF 제브라피쉬의 부화, 생존, 성장 및 불임에 대한 예비 증거와 함께 GF Artemia sp.에 대한 필수 지표를 제공합니다. 멸균 생식품의 모델 생성 및 준비에 대한 자세한 단계는 장기 GF 물고기 모델을 구성하고 적용하는 데 중요한 기술 지원을 제공할 뿐만 아니라 미생물군-숙주 상호 작용 연구에서 GF Artemia sp.를 제공합니다. 이 프로토콜은 GF 물고기 모델에 대한 박테리아 분리, 식별 및 감염을 다루고, 박테리아 형광 라벨링 방법을 설명하고, 현미경으로 물고기 내장에서 집락을 관찰합니다. GF 물고기, 박테리아 감염이 있는 gnotobiotic 물고기 또는 이식된 인간 미생물군 모델은 숙주 면역, 소화, 행동, 전사체 조절 및 대사 측면에 대한 기능과 효과를 설명하기 위해 다양한 검출을 거칩니다. 장기적으로 이 프로토콜은 해양 메다카와 같은 다양한 야생형 어종으로 확장될 수 있으며, 잠재적으로 특정 조직이나 질병과 관련이 있는 다른 선택된 형질전환 제브라피시 계통으로 확장될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
GF fish 및 GF 식품 준비 프로토콜 내의 중요한 단계
GF 물고기 모델을 생성하는 동안 멸균 물질 준비, 배아 멸균, GZM의 일일 갱신, 다양한 샘플 채취 및 여러 방법을 사용한 각 샘플의 멸균 검사를 포함하여 몇 가지 중요한 단계가 포함되었습니다. 이러한 단계 중 배아의 초기 치료는 GF 모델의 성공에 기본적이고 결정적인 역할을 합니다. 제제, 농도 및 처리 시간을 제어하는 것은 최적?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
충칭 의과대학 인재 프로젝트(R4014 – DSP, R4020 – PPJ), 중국 국가자연과학재단(NSFC, No.32200386 – PPJ), 충칭 박사후 과정 혁신 멘토 스튜디오(X7928 DSP) 및 중국과학원(CAS)/중국-스리랑카 교육 연구 공동 센터(CAS)의 중국-스리랑카 수자원 기술 연구 및 시연 프로그램 프로그램의 지원에 진심으로 감사드립니다.
Materials
| AB-GZM | Amphotericin:Solarbio; kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio. | Amphotericin:CAS:1397-89-3; kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313. |
49.6 mL GZM, 50 µL amphotericin stock solution (250 µg/mL), 25 µL kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 µL ampicillin stock solution (20 mg/mL). |
| 1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes | biosharp | BS-15-M | To collect samples, and hold agents |
| 2.4 g/L NaClO | XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd. | CAS: 7681-52-9 | Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution. |
| 6-well plates, 24-, 48- well plates | LABSELECT | 11112 | To culture fish |
| Aeronomas | NCBI database | No.MK178499 | 2019-JPP-ESN |
| Anaerobic TSA plates | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx. |
tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0. |
The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system. |
| Anaerobic work station | GENE SCIENCE | E200G | Bacterial isolation, sterile testing |
| Analysis | GraphPad Prism 5 | v6.07 | To analysis the data |
| API 20 E kits | BioMerieux SA, France | No.1005915090 | Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism |
| Artemia (Brine shrimp) | Shangjia Aquarium Co., Ltd. | Aquamaster brand | Artemia cysts, and brine shrimp eggs |
| Auto cycle system for fish culture | Ningbo Hairui Technology Co., Ltd | No Cat | Maintain the fish |
| Autoclave | Zeal Way | G154DWS | Prepare the materials |
| BHI Aerobic | Coolaber | Cat#PM0640 | BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder. |
| BHI Anaerobic | Coolaber | Cat#PM0640 | BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system. |
| Biochemical incubator | LongYue Co., Ltd | SPX | For fish and plates |
| Biosafety cabinet | Haier | HR40-IIA2 | Sterile treatment and testing |
| Bleaching agent of 0.02 g/L NaClO | XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd. | CAS: 7681-52-9 | Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water. |
| Blood plates | sheep blood:Solarbio | Cat. NO. TX0030 | Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates. |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | To culture fish |
| CM-Dil dyes | Molecular Probes | Cat#C7000 | To label the bacteria |
| Constant temperature shaking incubator | Peiving Co., Ltd | HZQ-X100 | Bacterial culture |
| Database | NCBI | Bacteria and Archaea database | Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/ |
| Disposable Pasteur pipette | biosharp | bs-xh-03l | Used to change water, and transfer eggs |
| Disposable petri dish | biosharp | BS-90-D | To culture fish |
| DNA kits | Solaribio | Cat#D1600 | Bacterial genomic DNA extraction kits |
| Electric pipette | SCILOGEX | Levo me | Change water |
| Exiguobacterium | NCBI database | No.MK178504 | 2019-JPP-ESN |
| GZM | Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd. | No Cat | Composed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L. |
| Laboratory pure water system | Hitech Co., Ltd | Prima-S15 | Prepare the agents |
| Microscope | Nikon | SMZ18 | With fluorescent light to observe fish larvae |
| PCR kits | TIANGEN | Cat#ET101 | Taq DNA Polymerase kit |
| Pipette | LABSELECT | sp-013-10 | Change water |
| Povidone iodine (PVP-I) | Aladdin | Lot#H1217005 | Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water. |
| Timing converter | PinYi Co., Ltd | AL-06 | To regulate the light |
| TSA plates | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx. |
tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0. |
TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder. |
| TSB Aerobic | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; |
tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; |
TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl. |
| TSB Anaerobic | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; |
tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; |
TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system. |
| Ultra-clean workbench | Airtech | SW-CJ-2FD | Sterile treatment and testing |
| Ultra-pure flow system for fish culture | Marine Biological Equipment company | No Cat | Produce water for fish |
| Vibrio | NCBI database | No.MK178501 | 2019-JPP-ESN |
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