从幼虫到幼虫阶段的无菌斑马鱼模型的生成、维持和鉴定

微生物群（即古细菌、细菌、真核菌和病毒）在维持宿主健康方面发挥着至关重要的作用，并通过在肠道屏障、上皮表面和个体粘蛋白功能内的共生相互作用影响生理和病理过程，从而促进各种疾病的发展 ^1,2,3.从婴儿期到少年期、成年期和衰老等不同生命阶段的微生物群组成，以及其在鼻孔、口腔、皮肤和肠道部位等不同部位的存在，是由不同的栖息地和环境动态塑造的⁴.生物体中的肠道菌群参与营养吸收、免疫反应、病原体入侵、代谢调节等 ^5,6.对患者的研究表明，肠道菌群的破坏与人类肥胖、睡眠障碍、抑郁症、炎症性肠病 （IBD）、神经退行性疾病（帕金森氏症、阿尔茨海默氏症）、衰老和各种癌症有关 ^7,8,9。此外，肠道微生物群和宿主之间的相互作用途径涉及炎症因子、神经递质、代谢物、肠道屏障和氧化应激，正如之前使用小鼠和鱼类模型的研究中观察到的那样^10,11。

最近，在临床和动物模型中，已经探索了多种与细菌相关的方法或疗法，包括潜在的益生菌和粪便微生物群移植 （FMT），用于治疗这些疾病。这些探索基于与微生物群-肠-脑/肝/肾轴、微生物群衍生产物和受体活性改变相关的发现^12,13。然而，由于微生物群落的复杂性和生成强大的类人疾病模型的挑战，微生物群-宿主系统的发育、各种功能和机制仍未完全理解和识别。

为了解决这些问题，无菌（GF）动物模型在19^世纪中叶被紧急提出，并在20^世纪主要发展起来。随后的改进，包括抗生素处理和gnotobiotic模型，以及微生物检测和观察技术的进步，进一步完善了这些模型14,15,16。GF动物通过消除自身背景和避免环境微生物而产生，为探索微生物与其宿主之间的相互作用提供了一种极好的策略¹⁷。通过应用动物模型和精细的方案，研究人员成功地复制了在GF小鼠和鱼类患者中发现的相似微生物组成。此外，其他GF动物模型，如狗、鸡和猪，作为研究对象提供了多样化的选择18,19,20,21。这种方法使人们能够研究共生微生物组对各种疾病的潜在治疗效果，包括人类癌症免疫疗法^16,18。GF模型为特定细菌在宿主内定植、迁移、繁殖和相互作用的特征和机制提供了更准确的见解。这为微生物群相关疾病的发生和发展提供了重要的新见解^22,23。GF斑马鱼在微生物研究中的建立和应用的历史从2004年Rawls等人的报告和2006年Bates等人的报告发展到2017年Melancon等人的方案16,24,25。然而，成年或繁殖GF模型的可行性仍然是一个漫长的过程，伴随着可变的寿命、成功率和健康挑战。

在各种动物模型中，斑马鱼（Danio rerio）因其与人体器官和基因组学的有利相似性、发育周期短、繁殖力高和胚胎透明等优点，成为基础和生物医学研究的重要工具^19,26。斑马鱼作为可靠的人类疾病模型，提供了体内生理和病理过程的视觉表示，提供了对宿主-微生物相互作用的吸引人特征的见解。值得注意的是，斑马鱼表现出独特的细胞谱系，可以对肠道生理学、微生物动力学、性腺和生殖发育、宿主免疫系统的成熟、行为和新陈代谢进行成像²⁷。斑马鱼胚胎在保护性绒毛膜内发育，直到孵化，在受精后 3 天 （dpf） 成为幼虫。它们在 5 dpf 时积极寻找食物，并在受精后 （mpf） 3 个月左右达到性成熟 ²⁸。Rawls 等人 ²⁴ 报道的首次成功的无菌 （GF） 斑马鱼表明，在卵黄吸收后用高压灭菌饲料喂养的幼虫表现出 8 dpf 的组织坏死和 20 dpf 时的总死亡。这表明了饮食的影响或在涉及长期（>7 dpf）GF鱼的实验中考虑外源性营养供应的重要性²⁹。随后的研究改进了GF鱼的生成方案，采用了在不同鱼类模型中完善的无菌食品和方法¹⁶。

然而，对 GF 斑马鱼模型的大多数研究都集中在早期生命阶段，涉及细菌感染在 5 dpf 下持续 24 小时至 48 小时，在实验结束时在 7 dpf 之前收集样本 25,30,31。人们普遍认为，包括人类和斑马鱼在内的生物体中的微生物群在生命开始时就被定植，并在生长和发育过程中形成。该成分在成虫阶段保持稳定，宿主体内微生物群的作用在整个生命过程中都至关重要，尤其是在衰老、神经退行性、代谢相关肥胖和肠道疾病方面³.因此，考虑到鱼类幼虫在早期生命中的免疫和生殖系统不成熟，来自存活时间较长的GF动物的观点可以深入了解微生物在宿主器官发育和功能中的作用机制。虽然斑马鱼肠道中的细菌菌株在以前的研究中已被分离和鉴定，为感染 GF 动物模型以选择益生菌或研究宿主中的细菌功能提供了潜力^19,25，^但 GF 鱼模型的生成和应用主要局限于早期生命阶段。这种局限性归因于复杂的生产过程、高昂的维护成本以及与食物和免疫力相关的问题，阻碍了旨在调查宿主中微生物群的发育和慢性影响的研究工作。

鱼类的存活率、行为、生长、成熟和整体健康状况，尤其是在无菌 （GF） 模型中，受到摄食方式的显着影响，包括从早期幼虫到幼鱼张口期间的营养摄入和吸收^32,33。然而，GF鱼类养殖业面临的挑战之一是缺乏合适的不育日粮，这限制了维持幼鱼生长和存活的营养支持的有效性。考虑到GF鱼的发育防御机制和由于缺乏肠道微生物组而导致的消化能力薄弱，解决这个问题对于恢复GF鱼的生命至关重要。在食物方面，活盐水虾（卤虫属）是张口幼鱼到幼鱼最合适的食物。据观察，与用煮熟的蛋黄或其他天然和合成饵料喂养的鱼相比，用活盐水喂养的鱼表现出更高的生长率和成活率³⁴。虽然GF鱼的早期生活模型可以在卵黄支持下生存，而GF幼虫模型可以通过无菌喂养来维持，但从幼虫到幼鱼并达到性成熟的长期模型仍然具有挑战性。此外，片状或粉状食物受到营养成分不均的限制，并可能影响水质。相比之下，活卤虫具有在盐水和淡水中都能存活、体型小、适合幼虫到成虫、易于配料和更高的孵化质量等优点³⁵.在先前方法^16、24、30 的基础上，我们简化了复杂的处理过程，并通过建立易于孵育的 GF 活卤虫作为无菌食品，其持续时间比早期 GF 鱼更长，从而解决了饮食挑战。

本研究提出了一个优化的方案，涵盖 （1） 代、（2） 维持、（3） 确定不育率以及 （4） 维持和饲喂，以确保无菌 （GF） 斑马鱼从胚胎生长到幼虫和幼年阶段。研究结果为GF斑马鱼的孵化、存活、生长和不育提供了初步证据，并为GF 卤虫 属作为不育食品提供了重要指标。无菌活食模型生成和制备的详细步骤为构建和应用长期GF鱼模型以及 GF卤虫 属在微生物群-宿主相互作用研究中提供了重要的技术支持。该协议解决了GF鱼模型上的细菌分离，鉴定和感染，概述了细菌荧光标记的方法，并在显微镜下观察它们在鱼肠道中的定植。GF鱼、细菌感染的gnotobiotic鱼或转移的人类微生物群模型将进行各种检测，以阐明其功能和对宿主免疫、消化、行为、转录组调控和代谢方面的影响。从长远来看，该协议可以扩展到不同的野生型鱼类，例如海洋青鳉鱼，并可能扩展到与特定组织或疾病相关的其他选定的转基因斑马鱼品系。