Cet article décrit un protocole de création d’un dispositif de culture microfluidique de vagin sur puce (Vagina Chip) qui permet d’étudier les interactions de l’hôte humain avec un microbiome vaginal vivant dans des conditions microaérophiles. Cette puce peut être utilisée comme outil pour étudier les maladies vaginales ainsi que pour développer et tester des contre-mesures thérapeutiques potentielles.
La santé des femmes, et en particulier les maladies de l’appareil reproducteur féminin, n’a pas reçu l’attention qu’elle mérite, même si un système reproducteur malsain peut entraîner des maladies potentiellement mortelles, l’infertilité ou des résultats défavorables pendant la grossesse. L’un des obstacles dans le domaine est qu’il y a eu une pénurie de modèles précliniques et expérimentaux qui imitent fidèlement la physiologie et la physiopathologie de la TRF. Les modèles in vitro et animaux actuels ne récapitulent pas entièrement les changements hormonaux, les conditions microaérobies et les interactions avec le microbiome vaginal. L’avènement de la technologie de culture microfluidique Organ-on-a-Chip (Organ Chip) qui peut imiter les interfaces tissu-tissu, la perfusion vasculaire, les flux de liquide interstitiel et le microenvironnement physique d’une sous-unité majeure d’organes humains peut potentiellement servir de solution à ce problème. Récemment, une puce vaginale humaine qui soutient la co-culture de consortiums microbiens vaginaux humains avec un épithélium vaginal humain primaire qui est également interfacé avec le stroma vaginal et connaît un flux de fluide dynamique a été développée. Cette puce reproduit les réponses physiologiques du vagin humain aux microbiomes sains et dysbiotiques. Un protocole détaillé pour la création de puces vaginales humaines a été décrit dans cet article.
Un microbiome vaginal dominé par Lactobacillus spp. qui aide à maintenir un microenvironnement acide joue un rôle important dans le maintien de la santé reproductive féminine1. Cependant, il peut parfois y avoir un changement dans la composition des communautés microbiennes qui composent le microbiome, ce qui entraîne une augmentation de la diversité des bactéries vaginales. Ces changements dysbiotiques, qui entraînent souvent le passage d’un état dominé par les Lactobacillus à un état dominé par des espèces bactériennes anaérobies plus diversifiées (par exemple, Gardnerella vaginalis), sont associés à diverses maladies du système reproducteur, telles que la vaginose bactérienne, la vaginite atrophique, l’infection des voies urinaires, la candidose vulvovaginale, l’urétrite et la chorioamnionite 2,3,4,5 . Ces maladies, à leur tour, augmentent les chances d’une femme de contracter des maladies sexuellement transmissibles et des maladies inflammatoires pelviennes 6,7,8,9. Ils présentent également un risque plus élevé d’accouchement prématuré et de fausses couches chez les femmes enceintes 10,11,12 et ont également été impliqués dans l’infertilité 13,14,15,16.
Bien que des efforts aient été faits pour modéliser la dysbiose vaginale à l’aide de cellules épithéliales vaginales cultivées dans des systèmes de culture statiques et bidimensionnels (2D)17,18, elles n’imitent pas efficacement la physiologie et la complexité du microenvironnement vaginal19. Des modèles animaux ont également été utilisés pour étudier la dysbiose vaginale ; Cependant, leurs phases menstruelles et leurs interactions hôte-microbiome diffèrent considérablement de celles chez l’homme, et par conséquent, la pertinence physiologique des résultats de ces études reste incertaine 19,20,21. Pour contrer ces problèmes, des modèles d’organoïdes et d’inserts Transwell de tissu vaginal humain ont également été utilisés pour étudier les interactions hôte-pathogène dans le FRT 19,22,23,24. Mais parce qu’il s’agit de cultures statiques, elles ne peuvent soutenir la co-culture de cellules humaines avec des microbes vivants que pendant une courte période de temps (<16-24 h), et elles manquent de nombreuses autres caractéristiques physiques potentiellement importantes du microenvironnement vaginal humain, telles que la production de mucus et l’écoulement des fluides22.
Les puces d’organe sont des systèmes de culture microfluidique tridimensionnels (3D) qui contiennent un ou plusieurs microcanaux creux parallèles tapissés de cellules vivantes cultivées sous un écoulement de fluide dynamique. Les puces à deux canaux permettent de recréer des interfaces tissu-tissu au niveau des organes en cultivant différents types de cellules (par exemple, l’épithélium et les fibroblastes stromaux ou l’épithélium et l’endothélium vasculaire) sur les côtés opposés d’une membrane poreuse qui sépare les deux canaux parallèles (Figure 1). Les deux tissus peuvent être exposés indépendamment à l’écoulement des fluides, et ils peuvent également connaître des conditions microaérobies pour permettre la co-culture avec un microbiome complexe 25,26,27,28. Cette approche a récemment été mise à profit pour développer une puce vaginale humaine tapissée d’un épithélium vaginal primaire sensible aux hormones, interfacé avec des fibroblastes stromaux sous-jacents, qui maintient une faible concentration physiologique d’oxygène dans la lumière épithéliale et permet la co-culture avec des microbiomes sains et dysbiotiques pendant au moins 3 jours in vitro29. Il a été démontré que la puce vaginale pouvait être utilisée pour étudier la colonisation par des consortiums optimaux (sains) de L. crispatus et détecter l’inflammation et les lésions causées par des consortiums non optimaux (non sains) contenant G. vaginalis. Ici, nous décrivons en détail les méthodes utilisées pour créer la puce vaginale humaine ainsi que pour établir des communautés bactériennes saines et dysbiotiques sur la puce.
Les modèles in vitro antérieurs du vagin humain ne reproduisent pas fidèlement les structures des tissus vaginaux, le flux de fluides et les interactions hôte-pathogène19,22. Les modèles animaux sont également limités par les variations inter-espèces du microbiome et les différences dans le cycle œstral ou menstruel19,22. Ce manuscrit décrit un protocole permettant de créer un modèl…
The authors have nothing to disclose.
Cette recherche a été financée par la Fondation Bill et Melinda Gates (INV-035977) et le Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering de l’Université Harvard. Nous remercions également Gwenn E. Merry, de l’Institut Wyss, pour l’édition de ce manuscrit. Le diagramme de la figure 1 a été créé avec BioRender.
0.22 µm Steriflip | Millipore | SCGP00525 | To degas media |
2 channel chip | Emulate | BRK-S1-WER-24 | Part of the two-channel Chip kit |
200 μL barrier tips (or filter tips) | Thomas Scientific, SHARP | 1159M40 | Tips used for chip seeding |
Activation Reagent 1 (or ER-1 powder) | Emulate | Chip S1 Basic Research kit-24PK | Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature -20 °C |
Activation Reagent 2 (or ER-2 solution) | Emulate | Chip S1 Basic Research kit-24PK | Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature 4 °C |
Adenine | Sigma Aldrich | A2786 | Component of the Differentiation media |
Brucella blood agar plates | VWR International Inc. | 89405-032 | with Hemin and Vitamin K; For the enumeration of Gardnerella vaginalis |
Ca2+ and Mg2+ free DPBS (DPBS (-/-) | ScienCell | 303 | For washing cells |
Calcium Chloride | Sigma Aldrich | C5670 | Component of the Differentiation media |
Calcium chloride (anhyd.) | Sigma Aldrich | 499609 | Component of HBSS (LB/+G) |
Collagen I | Corning | 354236 | For the coating solution for HVEC |
Collagen IV | Sigma Aldrich | C7521 | For the coating solution for HVEC |
Collagenase IV | Gibco | 17104019 | For the dissociation of cells from the Vagina Chips |
Complete fibroblast medium | ScienCell | 2301 | Media for the culture of HUF |
Complete vaginal epithelium medium | Lifeline | LL-0068 | Media for the culture of HVEC |
D-Glucose (dextrose) | Sigma Aldrich | 158968 | Component of HBSS (LB/+G) |
DMEM (Low Glucose) | Thermofisher | 12320-032 | Component of the Differentiation media |
Dynamic Flow Module (or Zoë) | Emulate | Zoë-CM1 | Regulates the flow rate of the chips |
Ham's F12 | Thermofisher | 11765-054 | Component of the Differentiation media |
Heat inactivated FBS | Thermofisher | 10438018 | Component of the Differentiation media |
Human uterine fibroblasts | ScienCell | 7040 | HUF |
Human vaginal epithelial cells | Lifeline | FC-0083 | HVEC |
Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0396 | Component of the Differentiation media |
ITES | Lonza | 17-839Z | Component of the Differentiation media |
L-glutamine | Thermofisher | 25030081 | Component of the Differentiation media |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | M2393 | Component of HBSS (LB/+G) |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | M1880 | Component of HBSS (LB/+G) |
MRS agar plates | VWR International Inc. | 89407-214 | For enumeration of Lactobacillus |
O-phosphorylethanolamine | Sigma Aldrich | P0503 | Component of the Differentiation media |
Pen/Strep | Thermofisher | 15070063 | Component of the Differentiation media |
pH strips | Fischer-Scientific | 13-640-520 | For measurement of pH |
Pods (1/chip) | Emulate | BRK-S1-WER-24 | Part of the two-channel Chip kit |
Poly-L-lysine | ScienCell | 403 | For the coating solution for HUFs |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | P3911 | Component of HBSS (LB/+G) |
Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P0662 | Component of HBSS (LB/+G) |
Sterile 80% glycerol | MP Biomedicals | 113055034 | For freezing bacterial samples |
Triiodothyronine | Sigma Aldrich | T6397 | Component of the Differentiation media |
Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma Aldrich | T8154 | For counting live/dead cells |
TrypLE Express | Thermofisher | 12605010 | For the dissociation of cells from the Vagina Chips |
Trypsin Neutralizing Solution (TNS) | ScienCell | 113 | For neutralization of Trypsin |
Trypsin/EDTA Solutiom (0.25%) | ScienCell | 103 | For cell dissociation |
β-estradiol | Sigma Aldrich | E2257 | Hormone for differentiation media |