Summary

Isolement de mutants sans interaction/altérés à l’aide du test à deux hybrides de levure

Published: December 29, 2023
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Summary

Les interactions des biomolécules, telles que les interactions protéine-protéine, sont la base moléculaire des fonctions biologiques. Si des mutants sans interaction/altérés qui manquent spécifiquement de l’interaction pertinente peuvent être isolés, ils aideront grandement à comprendre la ou les fonctions de cette interaction. Cet article présente un moyen efficace d’isoler les mutants sans interaction/altérés.

Abstract

Les interactions protéine-protéine sont l’un des processus les plus fondamentaux qui sous-tendent les phénomènes biologiques. L’une des façons les plus simples et les meilleures de comprendre le(s) rôle(s) et la (les) fonction(s) d’une interaction protéine-protéine spécifique est de comparer le phénotype du type sauvage (avec l’interaction protéine-protéine pertinente) et ceux des mutants qui n’ont pas l’interaction pertinente. Par conséquent, si de tels mutants peuvent être isolés, ils aideront à élucider les processus biologiques associés. La procédure à deux hybrides de levure (Y2H) est une approche puissante non seulement pour détecter les interactions protéine-protéine, mais aussi pour isoler les mutants sans interaction/altérés. Dans cet article, un protocole est présenté pour isoler les mutants sans interaction/altérés à l’aide de la technologie Y2H. Tout d’abord, une banque de mutations est construite en combinant la réaction en chaîne par polymérase et une technologie de clonage sans couture efficace, qui exclut efficacement le vecteur vide de la bibliothèque. Deuxièmement, les mutants sans interaction/altérés sont criblés par le test Y2H. En raison d’une astuce dans le vecteur Y2H, les mutants indésirables, tels que ceux avec des mutations de décalage de cadre et non-sens, sont efficacement éliminés du processus de criblage. Cette stratégie est simple et peut donc être appliquée à toute combinaison de protéines dont l’interaction peut être détectée par le système à deux hybrides.

Introduction

Les interactions entre les biomolécules sont la partie la plus fondamentale des phénomènes biologiques. Les interactions protéine-protéine constituent une partie importante de ces interactions. Par conséquent, l’identification du ou des partenaires d’interaction d’une protéine d’intérêt est essentielle pour élucider davantage la fonction de la protéine/du gène d’intérêt. La méthode à deux hybrides de levure (Y2H) est une technique populaire pour identifier les interactions protéine-protéine in vivo1. Dans ce système, deux protéines (X et Y) dont l’interaction doit être testée sont fusionnées respectivement au domaine de liaison à l’ADN (DB) et au domaine d’activation transcriptionnelle (AD). La protéine de fusion DB-X se lie à une séquence de reconnaissance du domaine DB ; par conséquent, lorsque les protéines X et Y interagissent, la protéine de fusion AD-Y se rapproche de la séquence de reconnaissance. Par conséquent, la transcription du gène rapporteur en aval de la séquence de reconnaissance est activée. Par conséquent, la présence ou l’absence d’activité du gène rapporteur peut être utilisée pour déterminer la présence ou l’absence de l’interaction protéine-protéine1.

Une fois qu’un partenaire d’interaction spécifique de la protéine d’intérêt est identifié, d’autres analyses doivent être effectuées pour élucider la fonction biologique de l’interaction. À cette fin, si les mutants des protéines qui altèrent ou suppriment l’interaction protéine-protéine spécifique peuvent être isolés, ils serviront d’outils puissants. Le système Y2H peut être utilisé directement pour isoler de tels mutants en criblant des clones « à interaction négative », en commençant par le clone de type sauvage à « interaction positive ». Pour accélérer ce processus, des systèmes Y2H « inversés » (rY2H) ont été développés 2,3. Dans les systèmes rY2H, les souches de levure hôte hébergent des gènes marqueurs contre-sélectionnables en tant que gènes rapporteurs, ce qui signifie que les cellules de levure ne se développent que lorsque les protéines AD-Y et DB-X n’interagissent pas.

Bien que les systèmes Y2H et rY2H permettent d’isoler les mutants négatifs à interaction, le processus d’isolement des mutants est laborieux car tous les candidats obtenus par criblage ne portent pas le type de mutations souhaité (généralement des mutations faux-sens). Le problème le plus grave est qu’une fraction importante des candidats présentent des mutations de décalage de cadre ou non-sens, et qu’il est nécessaire d’effectuer un western blot pour exclure les clones indésirables. Pour pallier ce problème, de nouveaux vecteurs plasmidiques ont été développés4. Dans ces vecteurs, KanMX, un marqueur de résistance aux médicaments, est positionné hors cadre en aval du domaine DB ou AD. Le gène marqueur ne devient dans le cadre du domaine DB ou AD que lorsque le gène d’intérêt est inséré. Lorsqu’une ou plusieurs mutations aléatoires sont introduites dans le gène d’intérêt, les mutants indésirables, tels que ceux présentant des mutations décalées ou non-sens, peuvent être facilement éliminés en effectuant une sélection de résistance aux médicaments, et les candidats porteurs de mutations faux-sens souhaitables peuvent être facilement identifiés avec le crible Y2H4. Cet article présente un protocole permettant d’isoler les mutants sans interaction/altérés d’une protéine d’intérêt en utilisant cette stratégie.

Protocol

1. Construction de la bibliothèque mutante Mettre en place la réaction en chaîne par polymérase (PCR) (un exemple est présenté ci-dessous). En général, préparez 50 μL de la réaction, qui est divisée en dix aliquotes de 5 μL, et amplifiez le fragment de gène cible dans une machine PCR4.REMARQUE : Les utilisateurs doivent sélectionner une polymérase appropriée pour introduire efficacement les mutations. Si le fragment d’ADN à amplifier est court, un…

Representative Results

Récemment, il a été constaté que la moitié C-terminale de la protéine Pol2 (Pol2-C) interagit avec Mcm10. Les deux protéines sont essentielles à l’initiation de la réplication de l’ADN et, par conséquent, à la croissance cellulaire chez la levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae 13,14,15. Pour aider à comprendre la signification biologique de cette interaction, les mutants Pol2-C qui n’ont pas ou…

Discussion

Cet article décrit comment isoler des mutants sans interaction/altérés à l’aide du test Y2H. De tels mutants sont des outils puissants pour analyser la fonction d’une protéine d’intérêt. Pour isoler de tels mutants, des tests rY2H ont été développés précédemment en modifiant la souchehôte Y2H 2,3. Cependant, ils n’ont pas considérablement réduit la quantité de main-d’œuvre. En revanche, les mutants peuvent être isolés avec cette mét…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Y. Tanaka a réalisé l’amélioration technique de Y2H. Ce travail est soutenu par JSPS KAKENHI Grant Number JP22K06336 et l’Institut de fermentation d’Osaka.

Materials

0.5 M EDTA (8.0) Nacalai Tesque Inc. 14347-21
10% SDS Solution Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. 313-90275
2-mercaptoethanol Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. 135-07522
2-propanol Kishida Chemical Co. Ltd. 110-64785
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. 021-07852
Agar Formedium AGR60
Ampicillin Sodium Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. 68-52-3
Anti-HA-tag mAb-HRP-DirecT   Medical & Biological Laboratories Co. Ltd. M180-7
DNA from salmon testes Merck KGaA. D1626
Ethanol Merck KGaA. 9-0770-4-4L-J
Filter paper for colony lift (Grade 50) Whatman, Cytiva 1450-090
Filter paper for colony lift (No.4A) Advantec Toyo Kaisha, Ltd. 01411090
Filter paper for replicaplating (No.1) Advantec Toyo Kaisha, Ltd. 00011150
G-418 Sulfate Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. 075-05962
Hydrochloric acid Kishida Chemical Co. Ltd. 230-37585
KCl Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. 163-03545
Lithium Acetate Dihydrate Nacalai Tesque Inc. 20604-22
MgSO4•7H2O Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. 131-00405
Na2HPO4•12H2O Nacalai Tesque Inc. 10039-32-4
NaCl Nacalai Tesque Inc. 31319-45
NaH2PO4•2H2O Nacalai Tesque Inc. 31717-25
Paper towel AS ONE Corp. 7-6200-02
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 Nacalai Tesque Inc. 25970-56
Plasmid DNAs the National BioResource Project – yeast (https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml)
Plasmid isolation Kit Nippon Genetics Co. Ltd. FG-90502
Polyethylene Glycol #4,000 Nacalai Tesque Inc. 11574-15
SC double drop-out mix -Leu -Trp Formedium DSCK172
Seamless cloning kit (In-Fusion assembly ) Takara Bio Inc. #639648
Skim milk powder Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. 190-12865
Streptomycin Sulfate Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. 3810-74-0
Taq polymerase (GoTaq Green Master Mixes) Promega Corp. M7122
TRIS (hydroxymethyl) aminomethane Formedium TRIS01
Triton X-100 Nacalai Tesque Inc. 12967-45
Tryptone ThermoFisher scientific Inc. 211705
Tween 20 Nacalai Tesque Inc. 35624-15
Yeast Extract ThermoFisher scientific Inc. 212750
Yeast Nitrogen Base (YNB) Formedium CYN0210
Zymolyase 100T Nacalai Tesque Inc. 07665-55

References

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Citer Cet Article
Satake, Y., Gotouda, N., Tanaka, S. Isolating Interaction-Null/Impaired Mutants Using the Yeast Two-Hybrid Assay. J. Vis. Exp. (202), e66423, doi:10.3791/66423 (2023).

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