Summary

Surveillance des oscillations circadiennes à l’aide d’un rapporteur de bioluminescence dans les organoïdes

Published: February 16, 2024
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Summary

Les rythmes circadiens, qui existent dans la plupart des organismes, régulent l’organisation temporelle des processus biologiques. Les organoïdes 3D sont récemment apparus comme un modèle in vitro physiologiquement pertinent. Ce protocole décrit l’utilisation de rapporteurs bioluminescents pour observer les rythmes circadiens dans les organoïdes, permettant ainsi d’étudier in vitro les rythmes circadiens dans les systèmes multicellulaires.

Abstract

La plupart des organismes vivants possèdent des rythmes circadiens, qui sont des processus biologiques qui se produisent sur une période d’environ 24 heures et régulent un répertoire varié de processus cellulaires et physiologiques allant des cycles veille-sommeil au métabolisme. Ce mécanisme d’horloge entraîne l’organisme en fonction des changements environnementaux et coordonne la régulation temporelle des événements moléculaires et physiologiques. Auparavant, il a été démontré que les rythmes circadiens autonomes sont maintenus même au niveau de la cellule unique en utilisant des lignées cellulaires telles que les fibroblastes NIH3T3, qui ont joué un rôle déterminant dans la découverte des mécanismes des rythmes circadiens. Cependant, ces lignées cellulaires sont des cultures homogènes dépourvues de multicellularité et de communications intercellulaires robustes. Au cours de la dernière décennie, des travaux approfondis ont été réalisés sur le développement, la caractérisation et l’application d’organoïdes 3D, qui sont des systèmes multicellulaires in vitro qui ressemblent à des structures et des fonctions morphologiques in vivo . Cet article décrit un protocole de détection des rythmes circadiens à l’aide d’un rapporteur bioluminescent dans les entéroïdes intestinaux humains, ce qui permet d’étudier les rythmes circadiens dans les systèmes multicellulaires in vitro.

Introduction

Horloge circadienne
Tous les organismes, des bactéries aux mammifères, ont une relation complexe et dynamique avec leur environnement. Dans cette relation, l’adaptation aux changements environnementaux est essentielle à la survie des organismes. La plupart des organismes possèdent des rythmes circadiens qui leur permettent d’adapter et d’optimiser leurs fonctions aux cycles diurnes d’environ 24 h. L’horloge circadienne est un réseau hiérarchique d’horloges centrales et périphériques qui travaillent en coopération pour maintenir l’homéostasie physiologique et maintenir les organismes synchronisés avec les changements quotidiens 1,2. Chez les mammifères, l’horloge centrale ou maîtresse située dans le noyau suprachiasmatique (SCN) reçoit des signaux externes, tels que la lumière, et transmet l’information aux horloges périphériques via une interaction avancée de voies de signalisation neuronales et humorales3. En plus de l’horloge centrale, les tissus périphériques possèdent leur propre mécanisme d’horloge circadienne autonome cellulaire, maintenu par une boucle de rétroaction négative transcriptionnelle-traductionnelle (TTFL) régulant les gènes contrôlés par l’horloge (CCG) spécifiques aux tissus4,5. Cette machinerie moléculaire produit une rythmicité d’environ 24 heures dans les événements cellulaires et physiologiques, tels que les expressions géniques, les voies de signalisation, les réponses immunitaires et la digestion. L’horloge circadienne est présente dans presque toutes les cellules de mammifères, et il a été démontré que jusqu’à 50% des modèles d’expression des gènes présentent une rythmicité circadienne6. Compte tenu de l’abondance des CCG, la perturbation de ce mécanisme d’horloge peut entraîner des problèmes physiologiques critiques. Par conséquent, des recherches sur les rythmes circadiens sont nécessaires pour élucider les mécanismes biologiques essentiels et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Système de rapporteur luciférase
Dans les études circadiennes, la surveillance en temps réel est essentielle pour une meilleure compréhension des comportements et des réponses cellulaires, car elle permet de suivre les changements temporels dans l’expression des gènes et/ou les niveaux de protéines, fournissant ainsi des informations sur les mécanismes moléculaires régulés par l’horloge circadienne. De plus, la surveillance en temps réel permet aux chercheurs d’étudier les effets des changements environnementaux sur les mécanismes moléculaires 7,8. Il existe de nombreuses techniques pour les études de surveillance en temps réel, y compris le test de bioluminescence, qui est largement utilisé pour suivre l’expression des gènes ou les niveaux de protéines au fil du temps. Le test de bioluminescence est une méthode de détection des processus biologiques en utilisant la production de lumière comme lecture. Dans cet essai, une enzyme oxydative qui produit une bioluminescence (par exemple, la luciférase) est transfectée de manière transitoire ou stable dans les cellules d’intérêt, et la lecture de la bioluminescence est mesurée en présence d’un substrat (par exemple, la luciférine) au fil du temps. Par exemple, l’enzyme luciférase produit une bioluminescence en oxydant le substrat luciférine en présence d’ATP9. En raison de sa courte demi-vie, 3-4 h10, la luciférase de luciole est un outil puissant pour les études circadiennes en termes de surveillance dynamique en temps réel avec un bruit de fond minimal 11,12,13. Pour l’insertion d’ADN avec un promoteur marqué à la luciférase ou un cadre de lecture ouvert (ORF), le système d’administration de gènes lentiviraux est une méthode fiable qui offre une efficacité de transduction élevée, une intégration stable et une faible immunogénicité. La transduction stable d’un rapporteur bioluminescent fournit une expression robuste dans les cellules en division et non divisées, générant des données cohérentes pour les études circadiennes14.

Organoïde comme modèle
Les lignées cellulaires bidimensionnelles immortalisées traditionnelles ont joué un rôle déterminant dans les études biologiques, allant de la découverte des mécanismes moléculaires fondamentaux des rythmes circadiens au criblage de médicaments. Malgré la commodité de l’utilisation de lignées cellulaires homogénéisées, elles manquent de structures multicellulaires et d’interactions intercellulaires. En revanche, les organoïdes sont des structures multicellulaires in vitro 3D « semblables à des organes » qui imitent la structure d’un organe dans une boîte en présentant une similitude avec l’architecture tissulaire in vivo et la multicellularité, y compris les types de cellules dérivées, progénitrices et différenciées15,16. Possédant des caractéristiques d’auto-organisation, de multicellularité et de fonctionnalité fait des organoïdes un modèle in vitro remarquable représentant les processus cellulaires et physiologiques se produisant dans les tissus réels17. Différents types d’organoïdes peuvent être dérivés de cellules souches pluripotentes par différenciation dirigée ou de cellules souches adultes prélevées dans divers organes, notamment l’intestin grêle, le cerveau, le foie, les poumons et les reins18,19. Étant donné que les structures organoïdes possèdent une architecture et une fonction réelles de type tissulaire avec une multicellularité et une interaction dynamique de cellule à cellule, elles sont supérieures aux lignées cellulaires homogénéisées pour comprendre les événements cellulaires qui se produisent dans les tissus in vivo. Les organoïdes sont également facilement manipulables et peuvent être cultivés dans des conditions contrôlées, ce qui les rend utiles pour les études circadiennes20.

L’objectif principal de ce travail est d’introduire une méthode de surveillance en temps réel utilisant un test de bioluminescence spécifiquement conçu pour l’étude des rythmes circadiens dans les organoïdes 3D multicellulaires. La surveillance en temps réel des événements cellulaires à l’aide d’une technique de test de bioluminescence a été largement réalisée pour des cultures cellulaires dépourvues de la complexité multicellulaire et des communications intercellulaires qui existent dans les tissus réels. Les organoïdes 3D offrent des opportunités uniques pour étudier les fonctions des rythmes circadiens dans les systèmes multicellulaires in vitro. Par exemple, on pourrait étudier les rythmes circadiens dans les organoïdes dont la composition cellulaire est modifiée ou les organoïdes dérivés des tissus malades des patients. Ce protocole permet l’utilisation d’un test de bioluminescence pour étudier différents aspects des rythmes circadiens dans un modèle in vitro plus pertinent sur le plan physiologique, les organoïdes, ce qui nous aidera à mieux comprendre les rôles des rythmes circadiens dans les organes périphériques.

Protocol

Toutes les expériences utilisant des tissus humains pour la génération d’EIH ont été approuvées par un CEE du CCHMC (IRB#2014-0427). Voir le Tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux utilisés dans ce protocole. REMARQUE : Pour illustrer la procédure décrite dans ce protocole, nous avons utilisé des entéroïdes intestinaux humains (HIE) Bmal1-luc . Ces entéroïdes ont subi une transduction lentivirale stable22<…

Representative Results

L’enregistrement par bioluminescence a été effectué pour évaluer la rythmicité circadienne des entéroïdes intestinaux humains (HIE) dans deux conditions distinctes : des conditions enrichies en cellules souches à l’aide d’un milieu de croissance organoïde intestinal (Figure 3) et des conditions induisant la différenciation, ce qui a été réalisé en remplaçant le milieu de croissance organoïde intestinal par un milieu de différenciation. Le jour de l’expérience, nous …

Discussion

Le test de bioluminescence offre plusieurs avantages pour l’étude des rythmes circadiens, ce qui nécessite la collecte de données à partir d’expériences à long terme. Tout d’abord, il permet aux chercheurs de surveiller l’expression génique ou la protéine d’intérêt au fur et à mesure que les cellules se déplacent et prolifèrent. Sans faire d’ajustements inutiles ni perturber les fonctions des cellules, les événements cellulaires intéressés ou l’expression des gènes peuvent être enregistr?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les entéroïdes intestinaux humains ont été obtenus dans le laboratoire du Dr Michael Helmrath au Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (CCHMC). Ce travail a été soutenu par R01 DK11005 (CIH) et le financement pilote du Centre de cancérologie de l’Université de Cincinnati. Nous sommes reconnaissants du soutien en imagerie de l’Université de Cincinnati Live Microscopy Core (NIH S10OD030402).

Materials

35 x 10 Falcon tissue culture dishes Fisher Scientific 08-772A
A 83-01 Sigma Aldrich SML0788
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634-028
B-27 Supplement (50x) Gibco 17504-044
BD Micro-Fine IV Insulin Syringes Fisher Scientific 14-829-1Bb Mfrn: BD 329424
CHIR99021 Cayman Chemical 13122 GSK-3 inhibitor
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902-500MG
D-Luciferin (potassium salt) Cayman Chemical 14681
Gastrin I Human Sigma Aldrich G9020
GlutaMAX Gibco 35050061
Growth Factor reduced (GFR) Matrigel Corning CB-40230C
HEPES Gibco 15630080
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) Stemcell Technologies 06010 Consist of IntestiCult OGM Human Basal Medium, 50 mL and Organoid Supplement, 50 mL. Mix both as 1:1 ratio to use as intestinal organoid growth medium
Kronos Dio Luminometer Machine ATTO Corporation AB-2550
N-2 Supplement (100x) Gibco 17502-048
N-Acetyl-L-cysteine Sigma Aldrich A9165
pABpuro-BluF reporter plasmid Addgene 46824
PBS without Calcium and Magnesium Corning 21-040-CV
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Recombinant murine EGF PeproTech 315-09
Y-27632 R&D Systems 1254/10 ROCK inhibitor

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Citer Cet Article
Goker, S., Lee, S., Hong, C. I. Monitoring Circadian Oscillations with a Bioluminescence Reporter in Organoids. J. Vis. Exp. (204), e66381, doi:10.3791/66381 (2024).

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