Ici, nous présentons un protocole pour obtenir le vecteur d’expression pVAX1-PRRSV en introduisant des sites de restriction appropriés à l’extrémité 3′ des inserts. Nous pouvons linéariser le vecteur et joindre des fragments d’ADN au vecteur un par un grâce à la technologie de recombinaison homologue.
La construction de vecteurs d’expression génique est une composante importante des travaux de laboratoire en biologie expérimentale. Avec les progrès techniques tels que l’assemblage Gibson, la construction vectorielle devient relativement simple et efficace. Cependant, lorsque le génome complet du virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (SDRP) ne peut pas être facilement amplifié par une seule réaction en chaîne par polymérase (PCR) à partir de l’ADNc, ou qu’il est difficile d’acquérir un vecteur d’expression génique complet par recombinaison homologue de plusieurs inserts in vitro, la technique actuelle d’assemblage de Gibson ne parvient pas à atteindre cet objectif.
Par conséquent, nous avons cherché à diviser le génome du SDRP en plusieurs fragments et à introduire des sites de restriction appropriés dans l’amorce inverse pour obtenir des fragments amplifiés par PCR. Après avoir joint le fragment d’ADN précédent dans le vecteur par la technologie de recombinaison homologue, le nouveau vecteur a acquis le site de clivage de l’enzyme de restriction. Ainsi, nous pouvons linéariser le vecteur en utilisant le site de clivage enzymatique nouvellement ajouté et introduire le fragment d’ADN suivant en aval du fragment d’ADN en amont.
Le site de clivage de l’enzyme de restriction introduit à l’extrémité 3′ du fragment d’ADN en amont sera éliminé, et un nouveau site de clivage sera introduit à l’extrémité 3′ du fragment d’ADN en aval. De cette façon, nous pouvons joindre des fragments d’ADN au vecteur un par un. Cette méthode est applicable pour construire avec succès le vecteur d’expression du SDRP et constitue une méthode efficace pour assembler un grand nombre de fragments dans le vecteur d’expression.
En tant que technique essentielle pour construire des outils expérimentaux basés sur l’ADN pour l’expression dans les cellules procaryotes et eucaryotes, le clonage moléculaire est une composante très importante de la biologie expérimentale. Le clonage moléculaire implique quatre processus : l’acquisition de l’ADN de l’insert, la ligature de l’insert dans le vecteur approprié, la transformation du vecteur recombinant en Escherichia coli (E. coli) et l’identification des clones positifs1. Jusqu’à présent, plusieurs méthodes ont été adoptées pour assembler des molécules d’ADN en utilisant des enzymes de restriction 2,3 et une recombinaison médiée par PCR 4,5,6. La recombinaison homologue, connue sous le nom de technologie de clonage sans soudure, est le groupe de méthodes de clonage, qui permet l’insertion indépendante de la séquence et sans cicatrice d’un ou plusieurs fragments d’ADN dans un vecteur. Cette technologie comprend le clonage indépendant de la séquence et de la ligature (SLIC), l’extrait de clonage de ligature sans couture (SLiCE), l’infusion et l’assemblage Gibson. Il utilise une exonucléase pour dégrader un brin de l’insert et un vecteur pour générer des extrémités cohésives, et soit une réparation in vivo, soit une recombinaison in vitro pour joindre de manière covalente l’insert au vecteur en formant des liaisons phosphodiester. La possibilité de joindre un seul insert à un vecteur à n’importe quelle séquence sans aucune cicatrice est très attrayante. De plus, la technologie a la capacité de joindre 5 à 10 fragments dans un ordre prédéterminé sans restriction de séquence.
En tant que l’une des nombreuses techniques d’ADN recombinant, la technique d’assemblage Gibson, actuellement la méthode de clonage la plus efficace 7,8, est une méthode robuste et élégante basée sur l’exonucléase pour assembler un ou plusieurs fragments d’ADN linéarisés de manière transparente. La réaction d’assemblage de Gibson est réalisée dans des conditions isothermes à l’aide d’un mélange de trois enzymes, à savoir l’exonucléase 5′, la polymérase haute fidélité et une ADN ligase thermostable. Les surplombs monobrins de 3′ créés par l’exonucléase de 5′-3′ contribuent au recuit de fragments qui partagent la complémentarité à une extrémité. La polymérase haute fidélité comble efficacement les lacunes dans les régions monocaténaires recuites en ajoutant des dNTP, et l’ADN ligase thermostable scelle les entailles pour former des molécules d’ADN articulaires8. Par conséquent, cette méthode technique a été largement utilisée pour la construction de vecteurs d’expression génique.
Le syndrome dysgénésique et respiratoire porcin (SDRP) est une maladie virale qui entraîne des troubles de la reproduction et une insuffisance respiratoire chez les porcs causée par le SDRP à l’âge de9 ans. Le syndrome se manifeste par de la fièvre, de l’anorexie, une pneumonie, une léthargie, une dépression et une détresse respiratoire. De plus, des signes cliniques, notamment une décoloration rouge/bleue des oreilles, ont été observés dans certaines épidémies. En tant que membre de la famille des artérivirus, le SDRP est largement transmis aux pays producteurs de porc par contact direct et échange de liquides, notamment l’urine, le colostrum et la salive. En raison de la propagation du SDRP aux États-Unis, les pertes économiques totales de l’industrie porcine ont été estimées à environ 664 millions de dollars par an, sur la base de l’échelle de reproduction de 5,8 millions de truies et de 110 millions de porcs10,11. Le rapport du Service d’inspection de la santé animale et végétale montre que 49,8 % des porcs non vaccinés présentent la présence du SDRP dans le sérum12 et que de faibles niveaux de SDRP chez les porcs infectés sont excrétés par la salive, les sécrétions nasales, l’urine et les matières fécales13. De multiples stratégies ont été mises en œuvre pour contrôler la propagation du SDRP 14,15,16. En plus des procédures d’élimination visant à créer des populations complètement négatives pour le virus ou à améliorer la biosécurité et la gestion, l’administration de vaccins est un moyen efficace de contrôler le SDRP.
Le SDRP est un virus à ARN monocaténaire enveloppé de polarité positive d’une longueur d’environ 15 kilobases (kb). Le génome du SDRP se compose d’au moins 10 cadres de lecture ouverts (ORF), d’une courte région non traduite de 5′ (5′ UTR) et d’une queue poly(A) à l’extrémité 3′ (Figure 1A)17. Le génome d’un virus à ARN à brin négatif n’est pas infectieux, tandis que le génome d’un virus à ARN à brin positif est infectieux. Il existe deux stratégies principales pour la transfection de l’ARN et de l’ADN afin de générer la descendance du virus18. Cependant, le clonage du fragment complet correspondant au génome de l’ARN est crucial pour la construction de clones infectieux. En raison de la nature longue et complexe du génome du SDRP, il n’est pas facile d’obtenir le génome complet par PCR en une seule fois. De plus, bien que la synthèse artificielle des gènes du SDRP soit une solution efficace, la synthèse de longs fragments est souvent coûteuse. Par conséquent, pour obtenir le vecteur d’expression PRRSV pleine longueur, nous avons tenté de le créer par la méthode de recombinaison homologue à inserts multiples19,20. Malheureusement, nous n’avons pas été en mesure d’obtenir le vecteur d’expression génique complet. Par conséquent, dans cette étude, nous avons ajouté des sites de restriction appropriés à l’amorce inverse et avons réussi à obtenir le vecteur d’expression pVAX1-PRRSV par plusieurs séries de réactions de recombinaison homologues. De plus, cette méthode peut également réaliser la suppression ou la mutation de gènes cibles et joindre efficacement un grand nombre de fragments d’ADN au vecteur d’expression.
La technique d’assemblage Gibson est une méthode de clonage moléculaire basée sur la recombinaison in vitro pour l’assemblage de fragments d’ADN8. Cette méthode permet d’assembler plusieurs fragments d’ADN en un plasmide circulaire dans une réaction isotherme à tube unique. Cependant, l’un des obstacles à la technique d’assemblage Gibson est l’acquisition de longs fragments à partir d’ADNc. Les longs fragments sont difficiles à amplifier avec précision pour de …
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par le soutien financier des fonds d’initiation à la recherche doctorale fournis par l’Université normale de Chine Ouest (n° 20E059).
1 kb plus DNA Ladder | Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd | MD113-02 | |
2x Universal Green PCR Master Mix | Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd | A303-1 | |
Agarose | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | 9012-36-6 | |
Benchtop Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FRESCO17 | |
Clean Bench | Sujing Antai Air Technology Co., Ltd | VD-650-U | |
DNA Electrophoresis Equipment | Cleaver Scientific Co., Ltd | 170905117 | |
DNA Loading Buffer (6x) | Biosharp Biotechnology Co., Ltd | BL532A | |
E. Z. N. A. Gel Extraction kit | Omega Bio-Tek Co., Ltd | D2500-01 | |
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I | Omega Bio-Tek Co., Ltd | D6943-01 | |
Electro-heating Standing-temperature Cultivator | Shanghai Hengyi Scientific Instrument Co., Ltd | DHP-9082 | |
ExonArt Seamless Cloning and Assembly kit | Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd | A101-02 | |
ExonScript RT SuperMix with dsDNase | Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd | A502-1 | |
FastDigest Eco321 (EcoRV) | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0303 | |
FastDigest HindIII | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0504 | |
FastDigest NheI | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0974 | |
FastDigest NotI | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0596 | |
Gel Doc XR | Bio-Rad Laboratories Co., Ltd | 721BR07925 | |
Goldview Nucleic Acid Gel Stain | Shanghai Yubo Biotechnology Co., Ltd | YB10201ES03 | |
Ice Maker Machine | Shanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., Ltd | FMB100 | |
Invitrogen Platinum SuperFi II DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | 12361010 | |
LB Agar Plate (Kanamycin) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B530113-0010 | |
LB sterile liquid medium (Kanamycin) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113-0001 | |
Micropipettors | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | — | |
Microwave Oven | Panasonic Electric (China) Co., Ltd | NN-GM333W | |
Orbital Shakers | Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., Ltd | ZHWY-2102C | |
PRRSV virus | Sichuan Agricultural University | — | |
SnapGene | GSL Biotech, LLC | v5.1 | To design primers |
T100 PCR Gradient Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories Co., Ltd | T100 Thermal Cycler | |
TAE buffer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B040123-0010 | |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | 15596026 | RNA extraction reagent |