Summary

Une approche de clonage sans couture pour la construction de vecteurs d’expression du virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin

Published: May 17, 2024
doi:

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour obtenir le vecteur d’expression pVAX1-PRRSV en introduisant des sites de restriction appropriés à l’extrémité 3′ des inserts. Nous pouvons linéariser le vecteur et joindre des fragments d’ADN au vecteur un par un grâce à la technologie de recombinaison homologue.

Abstract

La construction de vecteurs d’expression génique est une composante importante des travaux de laboratoire en biologie expérimentale. Avec les progrès techniques tels que l’assemblage Gibson, la construction vectorielle devient relativement simple et efficace. Cependant, lorsque le génome complet du virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (SDRP) ne peut pas être facilement amplifié par une seule réaction en chaîne par polymérase (PCR) à partir de l’ADNc, ou qu’il est difficile d’acquérir un vecteur d’expression génique complet par recombinaison homologue de plusieurs inserts in vitro, la technique actuelle d’assemblage de Gibson ne parvient pas à atteindre cet objectif.

Par conséquent, nous avons cherché à diviser le génome du SDRP en plusieurs fragments et à introduire des sites de restriction appropriés dans l’amorce inverse pour obtenir des fragments amplifiés par PCR. Après avoir joint le fragment d’ADN précédent dans le vecteur par la technologie de recombinaison homologue, le nouveau vecteur a acquis le site de clivage de l’enzyme de restriction. Ainsi, nous pouvons linéariser le vecteur en utilisant le site de clivage enzymatique nouvellement ajouté et introduire le fragment d’ADN suivant en aval du fragment d’ADN en amont.

Le site de clivage de l’enzyme de restriction introduit à l’extrémité 3′ du fragment d’ADN en amont sera éliminé, et un nouveau site de clivage sera introduit à l’extrémité 3′ du fragment d’ADN en aval. De cette façon, nous pouvons joindre des fragments d’ADN au vecteur un par un. Cette méthode est applicable pour construire avec succès le vecteur d’expression du SDRP et constitue une méthode efficace pour assembler un grand nombre de fragments dans le vecteur d’expression.

Introduction

En tant que technique essentielle pour construire des outils expérimentaux basés sur l’ADN pour l’expression dans les cellules procaryotes et eucaryotes, le clonage moléculaire est une composante très importante de la biologie expérimentale. Le clonage moléculaire implique quatre processus : l’acquisition de l’ADN de l’insert, la ligature de l’insert dans le vecteur approprié, la transformation du vecteur recombinant en Escherichia coli (E. coli) et l’identification des clones positifs1. Jusqu’à présent, plusieurs méthodes ont été adoptées pour assembler des molécules d’ADN en utilisant des enzymes de restriction 2,3 et une recombinaison médiée par PCR 4,5,6. La recombinaison homologue, connue sous le nom de technologie de clonage sans soudure, est le groupe de méthodes de clonage, qui permet l’insertion indépendante de la séquence et sans cicatrice d’un ou plusieurs fragments d’ADN dans un vecteur. Cette technologie comprend le clonage indépendant de la séquence et de la ligature (SLIC), l’extrait de clonage de ligature sans couture (SLiCE), l’infusion et l’assemblage Gibson. Il utilise une exonucléase pour dégrader un brin de l’insert et un vecteur pour générer des extrémités cohésives, et soit une réparation in vivo, soit une recombinaison in vitro pour joindre de manière covalente l’insert au vecteur en formant des liaisons phosphodiester. La possibilité de joindre un seul insert à un vecteur à n’importe quelle séquence sans aucune cicatrice est très attrayante. De plus, la technologie a la capacité de joindre 5 à 10 fragments dans un ordre prédéterminé sans restriction de séquence.

En tant que l’une des nombreuses techniques d’ADN recombinant, la technique d’assemblage Gibson, actuellement la méthode de clonage la plus efficace 7,8, est une méthode robuste et élégante basée sur l’exonucléase pour assembler un ou plusieurs fragments d’ADN linéarisés de manière transparente. La réaction d’assemblage de Gibson est réalisée dans des conditions isothermes à l’aide d’un mélange de trois enzymes, à savoir l’exonucléase 5′, la polymérase haute fidélité et une ADN ligase thermostable. Les surplombs monobrins de 3′ créés par l’exonucléase de 5′-3′ contribuent au recuit de fragments qui partagent la complémentarité à une extrémité. La polymérase haute fidélité comble efficacement les lacunes dans les régions monocaténaires recuites en ajoutant des dNTP, et l’ADN ligase thermostable scelle les entailles pour former des molécules d’ADN articulaires8. Par conséquent, cette méthode technique a été largement utilisée pour la construction de vecteurs d’expression génique.

Le syndrome dysgénésique et respiratoire porcin (SDRP) est une maladie virale qui entraîne des troubles de la reproduction et une insuffisance respiratoire chez les porcs causée par le SDRP à l’âge de9 ans. Le syndrome se manifeste par de la fièvre, de l’anorexie, une pneumonie, une léthargie, une dépression et une détresse respiratoire. De plus, des signes cliniques, notamment une décoloration rouge/bleue des oreilles, ont été observés dans certaines épidémies. En tant que membre de la famille des artérivirus, le SDRP est largement transmis aux pays producteurs de porc par contact direct et échange de liquides, notamment l’urine, le colostrum et la salive. En raison de la propagation du SDRP aux États-Unis, les pertes économiques totales de l’industrie porcine ont été estimées à environ 664 millions de dollars par an, sur la base de l’échelle de reproduction de 5,8 millions de truies et de 110 millions de porcs10,11. Le rapport du Service d’inspection de la santé animale et végétale montre que 49,8 % des porcs non vaccinés présentent la présence du SDRP dans le sérum12 et que de faibles niveaux de SDRP chez les porcs infectés sont excrétés par la salive, les sécrétions nasales, l’urine et les matières fécales13. De multiples stratégies ont été mises en œuvre pour contrôler la propagation du SDRP 14,15,16. En plus des procédures d’élimination visant à créer des populations complètement négatives pour le virus ou à améliorer la biosécurité et la gestion, l’administration de vaccins est un moyen efficace de contrôler le SDRP.

Le SDRP est un virus à ARN monocaténaire enveloppé de polarité positive d’une longueur d’environ 15 kilobases (kb). Le génome du SDRP se compose d’au moins 10 cadres de lecture ouverts (ORF), d’une courte région non traduite de 5′ (5′ UTR) et d’une queue poly(A) à l’extrémité 3′ (Figure 1A)17. Le génome d’un virus à ARN à brin négatif n’est pas infectieux, tandis que le génome d’un virus à ARN à brin positif est infectieux. Il existe deux stratégies principales pour la transfection de l’ARN et de l’ADN afin de générer la descendance du virus18. Cependant, le clonage du fragment complet correspondant au génome de l’ARN est crucial pour la construction de clones infectieux. En raison de la nature longue et complexe du génome du SDRP, il n’est pas facile d’obtenir le génome complet par PCR en une seule fois. De plus, bien que la synthèse artificielle des gènes du SDRP soit une solution efficace, la synthèse de longs fragments est souvent coûteuse. Par conséquent, pour obtenir le vecteur d’expression PRRSV pleine longueur, nous avons tenté de le créer par la méthode de recombinaison homologue à inserts multiples19,20. Malheureusement, nous n’avons pas été en mesure d’obtenir le vecteur d’expression génique complet. Par conséquent, dans cette étude, nous avons ajouté des sites de restriction appropriés à l’amorce inverse et avons réussi à obtenir le vecteur d’expression pVAX1-PRRSV par plusieurs séries de réactions de recombinaison homologues. De plus, cette méthode peut également réaliser la suppression ou la mutation de gènes cibles et joindre efficacement un grand nombre de fragments d’ADN au vecteur d’expression.

Protocol

1. Préparation du modèle du gène du SDRP Décongeler le stock viral dans 1 mL de réactif d’extraction d’ARN (voir le tableau des matières). Ajouter 0,2 mL de chloroforme et bien mélanger. Incuber pendant 3 min. Centrifuger le mélange pendant 15 min à 12 000 × g à 4 °C.REMARQUE : Le mélange est divisé en trois phases, à savoir, une phase aqueuse incolore, une interphase et une phase phénol-chloroforme rouge. Pipetez la phase aqueuse incolore et transférez-la dans un nouveau tube. Bien mélanger la phase aqueuse avec 0,5 mL d’isopropanol et incuber pendant 10 min à 4 °C. Centrifuger pendant 10 min à 12 000 × g à 4 °C.REMARQUE : Le fond du tube a un précipité d’ARN blanc. À l’aide d’une micropipette, jette le surnageant du tube. Ajoutez 1 ml d’éthanol à 75 % pour remettre la pastille en suspension et agitez brièvement. Centrifuger pendant 5 min à 7 500 × g à 4 °C. À l’aide d’une micropipette, jette le surnageant du tube. Faites sécher l’ARN pendant 5 min, ajoutez 20 à 50 μL d’eau exempte de RNase pour remettre l’ARN en suspension et mélangez soigneusement. Procédez à la transcription inverse ; configurez les réactions pour effectuer la transcription inverse comme indiqué dans le tableau 1.REMARQUE : Pour assurer une transcription inverse réussie, utilisez des matrices d’ARN de haute qualité. Utilisez l’ADNc obtenu pour la PCR ou stockez-le à -20 °C. 2. Conception de l’amorce PCR Conception de l’amorce avantOuvrez le logiciel et choisissez Nouveau fichier ADN. Collez la séquence du gène PRRSV (GenBank : FJ548852.1) de NCBI dans le logiciel. Cliquez sur OK pour générer les fichiers de séquence. Analysez la séquence et marquez les jonctions de fragments. Concevez l’amorce de séquence spécifique des fragments. Dans la plupart des cas, la température de fusion préférable (Tm) est comprise entre 55 °C et 62 °C, et la teneur en GC est de 40 à 60 %. Cliquez sur Primers et choisissez Add Primer. Collez la séquence spécifique et ajoutez des séquences de chevauchement du vecteur au premier nucléotide 5′ de l’amorce de la séquence spécifique. Près de chaque jonction, choisissez 20-40 pb pour servir de région de chevauchement entre les deux fragments adjacents. Nommez l’amorce avant contenant les porte-à-faux et la séquence spécifique (voir la figure supplémentaire S1). Cliquez sur Ajouter une introduction au modèle. Conception de l’amorce inverséeAnalysez la séquence et marquez les jonctions de fragments dans le logiciel. Concevez l’amorce de séquence spécifique inverse des fragments. Cliquez sur Primers et choisissez Add Primer. Collez la séquence spécifique et ajoutez le site de restriction au premier nucléotide 5′ de l’amorce de séquence spécifique.REMARQUE : Les sites de restriction ajoutés doivent être absents du fragment d’insertion et du vecteur, à l’exception des sites de clonage multiples. Ajoutez des séquences de vecteurs en surplomb de 20 à 40 pb au premier nucléotide 5′ du site de restriction. Nommez l’amorce inverse contenant les surplombs et la séquence spécifique (voir la figure supplémentaire S1). Cliquez sur Ajouter une introduction au modèle. 3. La PCR pour amplifier les fragments Mettre en place six réactions PCR individuelles (tableau 2) : pour le fragment 1, utiliser les amorces P1 et P2 (voir la figure supplémentaire S2) ; pour le fragment 2, utiliser les amorces P3 et P4 (voir la figure supplémentaire S2) ; pour le fragment 3, utiliser les amorces P5 et P6 (voir la figure supplémentaire S2) ; pour le fragment 4, utiliser les amorces P7 et P8 (voir la figure supplémentaire S2) ; pour le fragment 5, utilisez les amorces P9 et P10 ; et utiliser les amorces P11 et P12 pour amplifier le fragment 6 (voir la figure supplémentaire S2).REMARQUE : Décongelez, mélangez et centrifugez brièvement chaque composant avant utilisation. Exécutez la PCR à l’aide du protocole en trois étapes du Tableau 2. Ajoutez 1 μL de tampon de charge d’ADN 6x à 5 μL de produit PCR, mélangez et centrifugez brièvement le contenu. Analysez les échantillons à l’aide de l’électrophorèse sur gel d’agarose à 1 %. 4. Purification des fragments de PCR REMARQUE : La purification des produits PCR à partir d’un gel à l’aide d’un kit d’extraction de gel (voir le tableau des matériaux) est importante pour la construction vectorielle. Ajoutez 9 μL de tampon de charge d’ADN 6x à 45 μL de produits PCR, mélangez et centrifugez brièvement le contenu. Effectuez une électrophorèse sur gel d’agarose à 1 % pour séparer les fragments d’ADN.REMARQUE : Ne réutilisez pas le tampon de fonctionnement TAE car sa valeur de pH affectera la récupération des fragments d’ADN. Une fois les bandes correctement séparées, utilisez un scalpel bien aiguisé pour exciser soigneusement les bandes d’ADN.REMARQUE : Minimisez la taille de la tranche de gel en coupant l’excès d’agarose. Pesez la tranche de gel dans un tube de microcentrifugation propre de 1,5 ml, ajoutez un volume égal de tampon de liaison à la tranche de gel (p. ex., de 0,3 mL à une tranche de 0,3 g) et laissez incuber à 60 °C pendant 7 min. Insérez une mini-colonne dans un tube de prélèvement de 2 ml. Ajouter 700 μL de solution d’ADN/agarose de l’étape 4.4 dans la mini-colonne. Centrifuger à 10 000 × g pendant 1 min à température ambiante. Jetez le filtrat et réutilisez le tube de prélèvement. Ajouter 300 μL de tampon de liaison et centrifuger à 13 000 × g pendant 1 min à température ambiante. Jetez le filtrat et réutilisez le tube de prélèvement. Ajouter 700 μL de tampon de lavage et centrifuger à 13 000 × g pendant 1 min à température ambiante. Jetez le filtrat et réutilisez le tube de prélèvement. Faites tourner la mini-colonne vide pendant 2 min à vitesse maximale pour sécher la matrice de la colonne. Placez la mini-colonne dans un tube de microcentrifugation propre de 1,5 ml. Ajouter 20 μL d’eau déminéralisée directement au centre de la membrane de la colonne et laisser reposer à température ambiante pendant 2 min. Centrifugeuse à 13 000 × g pendant 1 min. Stockez l’ADN à -20 °C. 5. Préparation d’un vecteur linéarisé REMARQUE : Après avoir préparé le plasmide, les enzymes sélectionnées peuvent être utilisées pour le couper. La digestion longue ou la digestion à double enzyme est cruciale pour assurer la digestion de tout l’ADN. Cela réduira le nombre de clones faussement positifs dans les expériences ultérieures. Linéarisation pVAX1 Préparez le mélange réactionnel à température ambiante dans l’ordre indiqué (tableau 3).REMARQUE : Le volume d’eau doit être ajouté pour conserver le volume total de réaction indiqué. Ici, 1 μg du plasmide a été digéré avec des enzymes dans le mélange réactionnel. En fonction de la concentration du plasmide, le volume du plasmide peut être ajusté dans le mélange réactionnel. Mélanger délicatement ; puis tournez. Incuber à 37 °C dans un bloc chauffant ou un thermostat d’eau pendant 60 min. Effectuer une purification sur gel similaire à la purification des fragments de PCR dans la section 4 à l’aide du kit d’extraction de gel (voir Tableau des matériaux). Linéarisation pVAX1-F1NOTE : pVAX1-F1 est le vecteur obtenu à partir du premier tour de recombinaison de pVAX1 (NdeI et HindIII) et du fragment 1. pVAX1-F2 est le vecteur obtenu à partir de la recombinaison du cycle de pVAX1-F1 (NdeI) et du fragment 2. pVAX1-F3 est le vecteur obtenu à partir de la recombinaison du cycle de pVAX1-F2 (NdeI) et du fragment 3. pVAX1-F4 est le vecteur obtenu à partir de la recombinaison du cycle de pVAX1-F3 (NdeI) et du fragment 4. pVAX1-F5 est le vecteur obtenu à partir de la recombinaison du cycle de pVAX1-F4 (EcoRV et NtoI) et du fragment 5.Pour chaque vecteur, préparer le mélange réactionnel séparément à température ambiante dans l’ordre indiqué (tableau 3). Mélanger délicatement ; puis tournez. Incuber à 37 °C dans un bloc chauffant ou un thermostat d’eau pendant 60 min. Effectuer une purification sur gel similaire à la purification des fragments de PCR dans la section 4 à l’aide du kit d’extraction de gel (voir Tableau des matériaux). 6. Sous-clonage vers un nouveau vecteur REMARQUE : Une bonne efficacité de clonage peut être obtenue en utilisant 50 à 200 ng de vecteur et d’inserts. Configurez la réaction de clonage et d’assemblage sans couture ExonArt (Tableau 4). Ajustez le volume total de réaction à 10 μL à l’aide deH2O désionisé stérilisé et mélangez. Incuber la réaction dans un thermocycleur pendant 15 à 60 min à 50 °C. Conservez les échantillons sur de la glace.REMARQUE : Prolonger l’incubation jusqu’à 60 min peut améliorer l’efficacité de l’assemblage. Décongeler des cellules DH5α chimiquement compétentes sur de la glace. Ajouter 10 μL du produit d’assemblage dans les cellules compétentes ; Ensuite, mélangez doucement en pipetant de haut en bas. Placez le mélange sur de la glace pendant 30 min. Choc thermique à 45 °C pendant 45 s et transfert des tubes sur de la glace pendant 3 min. Ajouter 900 μL de fluide SOC dans le tube. Agitez le tube à 225 tr/min pendant 1 h dans un incubateur à 37 °C. Centrifuger la réaction de transformation à 6 000 × g pendant 2 min. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 100 μL de milieu SOC frais. Étalez la suspension cellulaire transformée sur une plaque LB séparée avec 50 μg/mL de kanamycine. Incuber toutes les assiettes pendant la nuit à 37 °C. Choisissez des colonies isolées individuelles dans chaque plaque expérimentale. 7. Analyse des transformants Prélever huit colonies dans 20 μL de milieu LB contenant 50 μg/mL de kanamycine. Configurez la réaction PCR de la colonie et exécutez la PCR (Tableau 5).REMARQUE : Pour la réaction de PCR de la colonie pour le fragment 1, utilisez les amorces P1 et P2 (voir le fichier supplémentaire 1) ; pour le fragment 2, utilisez les amorces P3 et P4 (voir le fichier supplémentaire 1) ; pour le fragment 3, utilisez les amorces P5 et P6 (voir le fichier supplémentaire 1) ; pour le fragment 4, utiliser les amorces P7 et P8 (voir la figure supplémentaire S2) ; pour le fragment 5, utilisez les amorces P9 et P10 ; et utiliser les amorces P11 et P12 pour détecter le fragment 6 (voir la figure supplémentaire S2). Ajoutez 1 μL de tampon de charge d’ADN 6x à 5 μL de produit PCR, mélangez et centrifugez brièvement le contenu. Analysez les résultats à l’aide de l’électrophorèse sur gel d’agarose à 1 %. Sélectionner une colonie positive dans 5 mL de milieu LB contenant 50 μg/mL de kanamycine et faire pousser toute la nuit à 37 °C. Obtenez le plasmide à l’aide d’une mini-trousse d’ADN plasmidique (voir le tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant. Visualisez les résultats à l’aide de l’électrophorèse sur gel d’agarose à 1 %.

Representative Results

Dans cet article, nous présentons un système de recombinaison in vitro permettant d’assembler et de réparer des molécules d’ADN qui se chevauchent à l’aide de l’amorce inverse via des sites de restriction introduits en permanence (Figure 1B). Ce système est une procédure simple et efficace comprenant la préparation du vecteur linéaire et des fragments d’insert contenant des surplombs introduits par PCR avec des amorces ayant des séquences d’extension 5′ appropr…

Discussion

La technique d’assemblage Gibson est une méthode de clonage moléculaire basée sur la recombinaison in vitro pour l’assemblage de fragments d’ADN8. Cette méthode permet d’assembler plusieurs fragments d’ADN en un plasmide circulaire dans une réaction isotherme à tube unique. Cependant, l’un des obstacles à la technique d’assemblage Gibson est l’acquisition de longs fragments à partir d’ADNc. Les longs fragments sont difficiles à amplifier avec précision pour de …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le soutien financier des fonds d’initiation à la recherche doctorale fournis par l’Université normale de Chine Ouest (n° 20E059).

Materials

1 kb plus DNA Ladder Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd MD113-02
2x Universal Green PCR Master Mix Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd A303-1
Agarose Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. 9012-36-6
Benchtop Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd FRESCO17
Clean Bench Sujing Antai Air Technology  Co., Ltd VD-650-U
DNA Electrophoresis Equipment Cleaver Scientific  Co., Ltd 170905117
DNA Loading Buffer (6x) Biosharp Biotechnology Co., Ltd BL532A
E. Z. N. A. Gel Extraction kit Omega Bio-Tek Co., Ltd D2500-01
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I Omega Bio-Tek Co., Ltd D6943-01
Electro-heating Standing-temperature Cultivator Shanghai Hengyi Scientific Instrument Co., Ltd DHP-9082
ExonArt Seamless Cloning and Assembly kit Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd A101-02
ExonScript RT SuperMix with dsDNase Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd A502-1
FastDigest Eco321 (EcoRV) Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd FD0303
FastDigest HindIII Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd FD0504
FastDigest NheI Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd FD0974
FastDigest NotI Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd FD0596
Gel Doc XR Bio-Rad Laboratories Co., Ltd 721BR07925
Goldview Nucleic Acid Gel Stain Shanghai Yubo Biotechnology Co., Ltd YB10201ES03
Ice Maker Machine Shanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., Ltd FMB100
Invitrogen Platinum SuperFi II DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd 12361010
LB Agar Plate (Kanamycin) Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. B530113-0010
LB sterile liquid medium (Kanamycin) Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. B540113-0001
Micropipettors Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd
Microwave Oven Panasonic Electric (China) Co., Ltd NN-GM333W
Orbital Shakers Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., Ltd ZHWY-2102C
PRRSV virus Sichuan Agricultural University
SnapGene GSL Biotech, LLC v5.1 To design primers
T100 PCR Gradient Thermal Cycler Bio-Rad Laboratories  Co., Ltd T100 Thermal Cycler
TAE buffer Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. B040123-0010
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd 15596026 RNA extraction reagent

References

  1. Lessard, J. C. Molecular cloning. Methods Enzymol. 529, 85-98 (2013).
  2. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J. Biol. Eng. 2, 5 (2008).
  3. Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
  4. Horton, R. M. PCR-mediated recombination and mutagenesis. SOEing together tailor-made genes. Mol Biotechnol. 3 (2), 93-99 (1995).
  5. Bang, D., Church, G. M. Gene synthesis by circular assembly amplification. Nat. Methods. 5 (1), 37-39 (2008).
  6. Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products. Nucleic Acids Res. 35 (7), e55 (2007).
  7. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).
  8. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  9. Cho, J. G., Dee, S. A. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Theriogenology. 66 (3), 655-662 (2006).
  10. Holtkamp, D. J., et al. Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on United States pork producers. J. Swine Health Prod. 21, 72-84 (2013).
  11. Thomann, B., Rushton, J., Schuepbach-Regula, G., Nathues, H. Modeling economic effects of vaccination against porcine reproductive and respiratory syndrome: Impact of vaccination effectiveness, vaccine price, and vaccination coverage. Front Vet Sci. 7, 500 (2020).
  12. Dwivedi, V., et al. Evaluation of immune responses to porcine reproductive and respiratory syndrome virus in pigs during early stage of infection under farm conditions. Virol J. 9, 45 (2012).
  13. Mengeling, W. L., Lager, K. M., Vorwald, A. C. Clinical consequences of exposing pregnant gilts to strains of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus isolated from field cases of "atypical&#34 PRRS. Am. J. Vet. Res. 59 (12), 1540-1544 (1998).
  14. Dee, S. A., Joo, H. S. Prevention of the spread of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in endemically infected pig herds by nursery depopulation. Vet Rec. 135 (1), 6-9 (1994).
  15. Dee, S. A., Joo, H. Strategies to control PRRS: a summary of field and research experiences. Vet Microbiol. 55 (1-4), 347-343 (1997).
  16. Renukaradhya, G. J., Meng, X. J., Calvert, J. G., Roof, M., Lager, K. M. Live porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines: Current status and future direction. Vaccine. 33 (33), 4069-4080 (2015).
  17. Conzelmann, K. K., Visser, N., Woensel, P. V., Thiel, H. J. Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the arterivirus group. Virology. 193 (1), 329-339 (1993).
  18. Han, M. Y., Yoo, D. W. Engineering the PRRS virus genome: Updates and perspectives. Vet Microbiol. 174 (3), 279-295 (2014).
  19. Bryksin, A. V., Matsumura, I. Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids. Biotechniques. 48 (6), 463-465 (2010).
  20. Wang, S., et al. Restriction-based multiple-fragment assembly strategy to avoid random mutation during long cDNA cloning. J Cancer. 6 (7), 632-635 (2015).
  21. Zhang, Z. D., et al. The economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome outbreak in four Chinese farms: Based on cost and revenue analysis. Front Vet Sci. 9, 1024720 (2022).
  22. Chen, N. H., et al. High genetic diversity of Chinese porcine reproductive and respiratory syndrome viruses from 2016 to 2019. Res Vet Sci. 131, 38-42 (2020).
  23. Wang, X. B., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).
  24. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
  25. Zhang, S. R., et al. Generation of an infectious clone of HuN4-F112, an attenuated live vaccine strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus high copy plasmid. Virol J. 8, 410 (2011).
  26. Ni, Y. Y., Huang, Y. W., Cao, D. J., Opriessnig, T., Meng, X. J. Establishment of a DNA-launched infectious clone for a highly pneumovirulent strain of type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus: identification and in vitro and in vivo characterization of a large spontaneous deletion in the nsp2 region. Virus Res. 160 (1-2), 264-273 (2011).

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Citer Cet Article
Yang, M., Cui, L., Liu, X. A Seamless Cloning Approach for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Expression Vector Construction. J. Vis. Exp. (207), e66320, doi:10.3791/66320 (2024).

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