Les injections intrafémorales permettent la greffe d’un petit nombre de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC), en plaçant les cellules directement dans la cavité de la moelle osseuse. Nous décrivons ici un protocole expérimental d’injection intrafémorale de HSPC humaines chez des souris immunodéficientes.
Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont définies par leur capacité à produire tous les types de cellules sanguines tout au long de leur vie. Ceci est testé opérationnellement en transplantant des populations cellulaires contenant des CSH dans des souris syngéniques ou immunodéprimées. La taille et la composition multilignage du greffon sont ensuite mesurées au fil du temps, généralement par cytométrie en flux. Classiquement, une population contenant des CSH est injectée dans la circulation de l’animal, après quoi les CSH abritent la moelle osseuse, où elles se logent et commencent la production de sang. Alternativement, les CSH et/ou les cellules progénitrices (HSPC) peuvent être placées directement dans la cavité de la moelle osseuse.
Cet article décrit un protocole d’injection intrafémorale de HSPC humaines chez des souris immunodéficientes. En bref, les souris préconditionnées sont anesthésiées et un petit trou est percé à travers le genou dans le fémur à l’aide d’une aiguille. À l’aide d’une aiguille à insuline plus petite, les cellules sont ensuite injectées directement dans le même conduit créé par la première aiguille. Cette méthode de transplantation peut être appliquée dans des conceptions expérimentales variées, en utilisant des cellules de souris ou humaines comme cellules donneuses. Il a été le plus largement utilisé pour la xénotransplantation, car dans ce contexte, on pense qu’il permet une meilleure prise de greffe par rapport aux injections intraveineuses, améliorant ainsi la puissance statistique et réduisant le nombre de souris à utiliser.
Le sang a l’un des taux de régénération les plus élevés du corps humain, produisant 1 ×10 12 cellules par jour dans la moelle osseuse humaine adulte1. Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) garantissent la production de sang tout au long de la vie par le processus d’hématopoïèse et sont définies par leur capacité à produire tous les types de cellules sanguines (multipotentialité) tout en se maintenant (auto-renouvellement). Historiquement, l’étalon-or pour tester la fonction d’une CSH a toujours reposé sur la transplantation, testant la capacité d’une population de donneurs à reconstituer toutes les lignées sanguines d’une souris à long terme (généralement définie comme un minimum de 20 semaines)2. Un vaste corpus de travaux fonctionnels s’étendant sur plusieurs décennies a démontré que le compartiment HSC est hétérogène à la fois dans la production de lignées et dans la reconstitution à long terme. La boîte à outils pour étudier l’hématopoïèse s’est considérablement élargie au fil des ans, avec de nombreuses nouvelles techniques, notamment des tests fonctionnels unicellulaires in vitro , des approches unicellulaires -omiques et le traçage de la lignée3. Ces derniers ont démontré de manière concluante que les contributions des CSH et des progéniteurs multipotents diffèrent largement dans l’hématopoïèse native et sous le stress imposé par la transplantation. Toutes ces techniques complètent les tests de transplantation, qui restent importants pour évaluer la capacité de repeuplement à long terme des CSH. Dans le contexte de l’étude de l’hématopoïèse humaine, la xénotransplantation constitue la seule méthode permettant d’évaluer expérimentalement l’auto-renouvellement dans un cadre d’organisme entier.
La xénotransplantation de CSH est couramment réalisée par injection intraveineuse de cellules chez des souris immunodéprimées. Cependant, les CSH sont rares4 et l’accès aux échantillons humains contenant des CSH est limité. En 2003, le groupe de John Dick a adapté un protocole de ponction de moelle osseuse et d’injection intraféorale de cellules de sang de cordon ombilical (CB) non obèses chez des souris non obèses atteintes de diabète de cordon ombilical (CB)5. À notre connaissance, il n’y a pas eu de comparaison formelle entre les injections intraveineuses et intrafémorales dans les résultats à long terme et en série des transplantations. Cependant, par rapport aux injections intraveineuses directes, les injections intrafémorales permettent d’obtenir des greffons de plus grande taille avec le même nombre de cellules transplantées6, du moins à court terme. De plus, la greffe peut être détectée avec beaucoup moins de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) transplantées. On pense que cela est dû au fait que l’administration intrafémorale contourne la nécessité pour les CSH de se loger dans la moelle osseuse, ce qui, dans le contexte de la xénogreffe, est limitatif en raison d’un manque de réactivité inter-espèces pour un certain nombre de récepteurs et de cytokines. Grâce à l’utilisation d’injections intrafémorales, Notta et ses collègues ont été les premiers à transplanter des CSH7 humaines uniques, bien que des considérations supplémentaires doivent être prises, comme décrit dans leurs méthodes. L’administration intrafémorale de HSPC présente également des limites. L’injection elle-même perturbe et détruit une partie de la moelle osseuse et n’est donc pas indiquée pour les études de diaphonie entre les CSH et leur microenvironnement de moelle osseuse. De plus, le nombre maximum de cellules est limité par le volume de cette cavité osseuse et cela peut être trop peu pour certaines applications. Comme pour toute technique, son application dans une expérience spécifique doit être évaluée en fonction des avantages/inconvénients et de la question posée. Dans le contexte de la xénotransplantation, si le but de l’expérience est de tester la greffe d’un petit nombre de HSPC humaines sans évaluation du microenvironnement, l’administration intrafémorale est généralement préférée à l’injection intraveineuse.
Les injections intrafémorales sont un outil utile dans la xénotransplantation lorsque seul un petit nombre de HSPC sont disponibles, offrant une meilleure prise de greffe par rapport aux injections intraveineuses. Cependant, la technique demande de la dextérité et de l’entraînement. Lors de la pratique, nous recommandons d’utiliser des cadavres frais de la bonne gamme de poids (voir ci-dessous) et d’injecter un colorant coloré (comme le bleu trypan) afin qu’après la dissec…
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient le groupe du Dr John Dick pour ses travaux antérieurs sur cette méthode, et Monica Doedens pour sa formation. Nous sommes reconnaissants envers la Cambridge Blood and Stem Cell Biobank (CBSB), en particulier la Dre Joanna Baxter et l’équipe d’infirmières de la CBSB qui ont consenti et prélevé des échantillons de sang de cordon ; nos donateurs échantillons ; le service biomédical de l’université, en particulier Nicolas Lumley et le personnel de l’édifice Anne McLaren pour l’entretien de nos souches de souris et le soutien de nos expériences in vivo ; Shaaezmeen Basheer pour l’édition du manuscrit.
E.L. est financé par une bourse Sir Henry Dale financée conjointement par le Wellcome Trust et la Royal Society (107630/Z/15/A). L.M. est soutenu par Sofinter – Programme de bien-être des ressources humaines. Cette recherche a été financée en tout ou en partie par le Wellcome Trust (203151/Z/16/Z, 203151/A/16/Z, 215116/Z/18/Z) et le Conseil de la recherche médicale de l’UKRI (MC_PC_17230). Dans le but du libre accès, l’auteur a appliqué une licence de droit d’auteur publique CC BY à toute version du manuscrit acceptée par l’auteur découlant de cette soumission.
0.5 mL Insulin Syringe with 29 G x 12.7 mm Needle | BD | 324892 | |
1 mL Insulin Syringe with 29 G x 0.5" Needle | BD | 324827 | |
1.5 mL tube | Fisherbrand | 509-GRD-PFB | |
3 mL syringe | HENKE SASS WOLF GMBH | 4020.000V0 | |
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm | Falcon | 352235 | FACS tube |
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Snap Cap 12 x 75 mm | Falcon | 352058 | FACS tube |
27 G 1/2" needle | BD | 300635 | |
40 µm cell strainer for 50 mL tube | Greiner Bio-one | 542040 | |
50 mL tube | Sarstedt Ltd | 62.547.254 | |
96 well round-bottom plate | Falcon | 351177 | |
Alcohol Swab | VITREX MEDICAL A/S | 520213 | |
BD LSR Fortessa X-20 Cell Analyzer | BD | flow cytometer | |
Buphrenorphine | Animalcare | XVD190 | |
CD14/PECy7 (Clone M5E2) | biolegend | 301814 | Used at 1 in 1000 |
CD19/Alexa 700 (Clone HIB19) | biolegend | 302226 | Used at 1 in 300 |
CD19/FITC (Clone HIB19) | biolegend | 302206 | Used at 1 in 200 |
CD3/APCCy7 (Clone HIT3a) | biolegend | 300318 | Used at 1 in 100 |
CD33/APC (Clone P67.6) | BD | 345800 | Used at 1 in 200 |
CD45/BV510 (Clone HI30) | biolegend | 304036 | Used at 1 in 500 |
CD45/PECy5 (Clone 2D1) | biolegend | 368526 | Used at 1 in 300 |
CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | |
Dnase 1 | Worthington Biochemical | LS002139 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | PAN-Biotech | P40-37500 | |
Glycophorin A (GlyA)/PE (Clone GA-R2) | BD | 340947 | Used at 1 in 1000 |
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | PAN-Biotech | P04-20250 | |
Isoflurane (IsoFlo 100% w/w Inhalation Vapor, liquid) | Zoetis | 115095 | |
Microvette 300 Lithium heparin LH, 300 µL | Sarstedt Ltd | 20.1309 | Mouse blood collection tube |
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | Charles River | ||
Pancoll human, Density: 1.077 g/mL | PAN-Biotech | P04-60500 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190169 |