Summary

Etude comparative des matrices de membrane basale pour l’entretien des cellules souches humaines et la génération d’organoïdes intestinaux

Published: March 15, 2024
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Summary

Les organoïdes sont devenus des outils précieux pour la modélisation des maladies. La matrice extracellulaire (MEC) guide le destin cellulaire pendant la génération d’organoïdes, et l’utilisation d’un système qui ressemble au tissu natif peut améliorer la précision du modèle. Cette étude compare la génération d’organoïdes intestinaux humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites dans des ECM d’origine animale et des hydrogels sans xéno.

Abstract

La matrice extracellulaire (MEC) joue un rôle essentiel dans le comportement et le développement cellulaires. Les organoïdes générés à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) sont sous les feux de la rampe dans de nombreux domaines de recherche. Cependant, l’absence de repères physiologiques dans les matériaux de culture cellulaire classiques entrave la différenciation efficace des iPSC. L’incorporation de la MEC disponible dans le commerce dans la culture de cellules souches fournit des indices physiques et chimiques bénéfiques pour la maintenance cellulaire. Les produits de membrane basale d’origine animale disponibles dans le commerce sont composés de protéines ECM et de facteurs de croissance qui soutiennent le maintien des cellules. Étant donné que l’ECM possède des propriétés spécifiques aux tissus qui peuvent moduler le destin cellulaire, des matrices sans xéno sont utilisées pour diffuser la traduction vers les études cliniques. Bien que les matrices disponibles dans le commerce soient largement utilisées dans les travaux sur les hiPSC et les organoïdes, l’équivalence de ces matrices n’a pas encore été évaluée. Ici, une étude comparative de l’entretien des hiPSC et de la génération d’organoïdes intestinaux humains (hIO) dans quatre matrices différentes : Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB) et VitroGel (Matrix 4-XF) a été menée. Bien que les colonies n’aient pas une forme parfaitement ronde, il y avait une différenciation spontanée minimale, avec plus de 85% des cellules exprimant le marqueur de cellules souches SSEA-4. La matrice 4-XF a conduit à la formation de touffes rondes en 3D. De plus, l’augmentation de la concentration du supplément et des facteurs de croissance dans les milieux utilisés pour fabriquer la solution d’hydrogel Matrix 4-XF a amélioré l’expression de SSEA-4 par 1,3. La différenciation de l’hiPSC maintenue par la matrice 2-AB a entraîné moins de libérations de sphéroïdes au cours du stade de l’intestin moyen/postérieur par rapport aux autres membranes basales d’origine animale. Par rapport à d’autres, la matrice d’organoïdes sans xéno (matrice 4-O3) conduit à des hIO plus grands et plus matures, ce qui suggère que les propriétés physiques des hydrogels sans xénogrammes peuvent être exploitées pour optimiser la génération d’organoïdes. Dans l’ensemble, les résultats suggèrent que les variations dans la composition des différentes matrices affectent les étapes de différenciation des IO. Cette étude sensibilise aux différences entre les matrices disponibles dans le commerce et fournit un guide pour l’optimisation des matrices lors des travaux iPSC et IO.

Introduction

La matrice extracellulaire (MEC) est un composant dynamique et multifonctionnel des tissus qui joue un rôle central dans la régulation du comportement et du développement cellulaires. En tant que réseau complexe, il fournit un support structurel, des ligands adhésifs cellulaires1 et le stockage de facteurs de croissance et de cytokines qui régulent la signalisation cellulaire. Par exemple, lors de la cicatrisation des plaies, l’ECM sert d’échafaudage pour les cellules migrantes et de réservoir de facteurs de croissance impliqués dans la réparation tissulaire2. De même, la dérégulation de l’ECM peut entraîner une augmentation de la gravité de diverses maladies telles que la fibrose et le cancer 3,4. Au cours du développement embryonnaire, la MEC guide la morphogenèse des tissus. Par exemple, dans le développement du cœur, les composants de l’ECM jouent un rôle dans la création de l’architecture et de la fonction correctes du tissu cardiaque5. Plus d’une décennie de recherche a montré que la rigidité du microenvironnement à elle seulepeut contrôler la spécification de la lignée des cellules souches. Par conséquent, il n’est pas surprenant qu’au cours de la différenciation cellulaire in vitro, l’ECM influence le destin des cellules souches en fournissant des signaux de différenciation.

Les organoïdes peuvent être générés à partir de cellules souches pluripotentes induites (iPSC). Il est nécessaire de commencer par une lignée d’iPSC correctement caractérisée pour générer des organoïdes avec succès. Cependant, l’absence de signaux physiologiques dans les matériaux de culture cellulaire classiques entrave la différenciation efficace des iPSC et la génération d’organoïdes. De plus, des recherches récentes ont souligné l’importance de la composition de la matrice extracellulaire (MEC), des interactions entre les cellules et la MEC8, ainsi que des indices mécaniques et géométriques 9,10,11 dans le contexte de l’expansion et de la différenciation des organoïdes12. Pour faire progresser la technologie des organoïdes en améliorant la reproductibilité, il faudra incorporer des indices physiques et chimiques spécifiques aux tissus.

Les organoïdes visent à récapituler le tissu natif dans un microenvironnement physiologiquement similaire. Le choix d’un système ECM qui imite étroitement l’ECM des tissus natifs est crucial pour obtenir une pertinence physiologique concernant le comportement cellulaire, la fonction et la réponse aux stimuli13. Le choix des composants de la MEC peut influencer la différenciation des cellules souches en types de cellules spécifiques au sein de l’organoïde. Différentes protéines ECM et leurs combinaisons peuvent fournir des indices qui guident le destin cellulaire14. Par exemple, des études ont montré que l’utilisation de composants ECM spécifiques peut favoriser la différenciation des cellules souches intestinales en types de cellules intestinales matures, ce qui permet d’obtenir des organoïdes intestinaux physiologiquement pertinents15. Bien que les organoïdes soient un outil précieux lors de la modélisation des maladies et des tests de médicaments, le choix d’un système ECM approprié est essentiel à cette application. Un système ECM approprié peut améliorer la précision de la modélisation de la maladie en créant un microenvironnement qui ressemble au tissu affecté16. De plus, la MEC spécifique aux tissus peut aider à générer des organoïdes qui récapitulent mieux les phénotypes associés à la maladie et les réponses aux médicaments17. L’optimisation du système ECM utilisé dans la différenciation des organoïdes est essentielle pour obtenir les résultats de différenciation souhaités.

Les systèmes de membrane basale disponibles dans le commerce dérivés de sources ECM animales (par exemple, Matrigel, Cultrex) et d’hydrogel sans xénogrammes (par exemple, VitroGel) sont largement utilisés dans la recherche sur les iPSC et les organoïdes. Les entreprises qui les commercialisent et les chercheurs qui les utilisent ont élaboré de nombreuses instructions pour leurs produits et applications spécifiques au fil des ans. Beaucoup de ces instructions ont servi de guide pour la génération de ce protocole. De plus, les avantages et les inconvénients associés à leurs propriétés intrinsèques ont été notés individuellement par de nombreux 18,19,20,21. Cependant, il n’existe pas de flux de travail systématique pour guider la sélection des systèmes optimaux pour le travail des iPSC et des organoïdes. Ici, un flux de travail permettant d’évaluer systématiquement l’équivalence des systèmes ECM provenant de diverses sources pour le travail sur les iPSC et les organoïdes est fourni. Il s’agit d’une étude comparative du maintien de la génération de deux lignées différentes d’iPSC humaines (hiPSC) et d’organoïdes intestinaux humains (hIO) dans quatre matrices différentes : Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB) et VitroGel (Matrix 4-XF). Pour la culture d’organoïdes, quatre versions de la matrice sans xéno-xéno-VitroGel qui avaient été préalablement optimisées pour la culture d’organoïdes ont été utilisées : ORGANOID 1 (matrice 4-O1), ORGANOID 2 (matrice 4-O2), ORGANOID 3 (matrice 4-O3), ORGANOID 4 (matrice 4-O4). De plus, des matrices d’origine animale optimisées pour les organoïdes ont été utilisées : Matrigel High Concentration (Matrix 1-ABO) et Cultrex Type 2 (Matrix 3-ABO). Des milieux de culture de cellules souches disponibles dans le commerce (mTeSR Plus) et un kit de différenciation des organoïdes (STEMdiff intestinal organoïdes kit) ont été utilisés. Ce protocole combine les instructions individuelles des fabricants de produits avec des expériences de laboratoire pour guider le lecteur vers une optimisation réussie de l’ECM pour leur travail spécifique sur les iPSC et les organoïdes. Dans l’ensemble, ce protocole et les résultats représentatifs soulignent l’importance de sélectionner le microenvironnement optimal pour le travail sur les cellules souches et la différenciation des organoïdes.

Protocol

1. Maintenance des hiPSC ATTENTION : Tous les travaux sont effectués dans une enceinte de biosécurité (BSC) selon des techniques aseptiques standard. Doit suivre les normes de sécurité de l’OSHA pour les laboratoires, y compris l’utilisation appropriée d’équipements de protection individuelle tels que des blouses de laboratoire, des gants et des lunettes de protection. Préparation de matrices, d’aliquotes et de milieux de culture cellulairePou…

Representative Results

Selon ce protocole, des membranes basales disponibles dans le commerce et un système d’hydrogel sans xénogène ont été utilisés avec succès pour cultiver des cellules hiPSC et les différencier en hIO. L’objectif principal de ces expériences était d’évaluer systématiquement l’équivalence de matrices provenant de diverses sources pour les travaux hiPSC et hIO. La première section de ce protocole s’est concentrée sur le maintien et la caractérisation d’une culture d’iPSC saine qui produit une g?…

Discussion

La sélection du microenvironnement optimal pour le travail sur les cellules souches et les organoïdes est une première étape cruciale lors de l’utilisation de ces plateformes pour un large éventail d’applications. Nos résultats représentatifs montrent que la matrice 4-XFO3, en combinaison avec une concentration plus élevée de facteurs de croissance, conduit à des organoïdes plus grands, ce qui suggère que les propriétés physiques des hydrogels sans xénogrammes peuvent être exploitées pour optimiser l…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs reconnaissent la formation antérieure et les recommandations générales concernant le début du travail sur les hiPSC et les organoïdes des Drs Christina Pacak, Silveli Susuki-Hatano et Russell D’Souza. Ils remercient la Dre Chelsey Simmons pour ses conseils dans l’utilisation des systèmes d’hydrogel pour les travaux de culture cellulaire in vitro . De plus, les auteurs tiennent à remercier les Drs Christine Rodriguez et Thomas Allison de STEMCELL Technologies pour leurs conseils sur la culture hiPSC. Les auteurs remercient également TheWell Bioscience d’avoir couvert les frais de publication.

Materials

24-Well Plate (Culture treated, sterile) Falcon 353504
37 °C water bath VWR
96-well plate  Fisher Scientific FB012931
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634
Anti-adherence Rinsing Solutio STEMCELL Technologies 7010
Biological safety cabinet (BSC) Labconco  Logic
Brightfield Microscope Echo Rebel REB-01-E2
BXS0116 ATCC ACS-1030
Centrifuge with temperature control (4 °C capabilities) ThermoScientific 75002441
Conical tubes, 15 mL, sterile Thermo Fisher Scientific 339650
Conical tubes, 50 mL, sterile Thermo Fisher Scientific 339652
Cultrex RGF BME, Type 2 Bio-techne 3533-005-02
Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME  Bio-techne 3434-010-02
D-PBS (Without Ca++ and Mg++) Thermo Fisher Scientific 14190144
GeltrexLDEV-Free, hESC-Qualified Reduce Growth Factor Gibco  A14133-02
GlutaMAX Supplement Thermo Fischer Scientific 35050-061
Guava Muse Cell Analyzer or another flow cytometry equipment (optional) Luminex 0500-3115
HEPES buffer solution Thermo Fischer Scientific 15630-056
Heralcell Vios Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2) Thermo Scientific  51033775
JMP Software SAS Institute JMP 16
MATLAB MathWorks, Inc R2022b
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix LDEV free Corning  356231
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Growth Factor Reduced (GFR) LDEV-free Corning  354263
mTeSR Plus Medium STEMCELL Technologies 100-0276
Nunclon Delta surface treated 24-well plate Thermo Scientific 144530
PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM) BD Pharmingen 566841
PE Mouse Anti-human CDX2  BD Pharmingen 563428
PE Mouse Anti-human FOXA2 BD Pharmingen 561589
PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-human SSEA4  BD Pharmingen 561565
ReLeSR STEMCELL 5872
SCTi003-A STEMCELL Technologies 200-0510
Serological pipettes (10 mL)  Fisher Scientific 13-678-11E
Serological pipettes (5 mL)  Fisher Scientific 13-678-11D
STEMdiff Intestinal Organoid Growth Medium STEMCELL Technologies 5145
STEMdiff Intestinal Organoid Kit STEMCELL Technologies 5140
Vitrogel Hydrogel Matrix TheWell Bioscience VHM01
VitroGel ORGANOID Discovery Kit TheWell Bioscience VHM04-K

References

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Citer Cet Article
Pineiro-Llanes, J., da Silva, L., Huang, J., Cristofoletti, R. Comparative Study of Basement-Membrane Matrices for Human Stem Cell Maintenance and Intestinal Organoid Generation. J. Vis. Exp. (205), e66277, doi:10.3791/66277 (2024).

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