Ácido retinóico encapsulado em nanoemulsão catiônica como adjuvante para promover respostas sistêmicas e mucosas específicas do OVA
Summary
Neste protocolo, desenvolvemos um ácido retinóico (AR) encapsulado em nanoemulsão catiônica para ser usado como adjuvante para promover respostas sistêmicas e mucosas específicas do antígeno. Ao adicionar o RA aprovado pela FDA à nanoemulsão, a sIgA específica do antígeno foi promovida na vagina e no intestino delgado após a injeção intramuscular da nanoemulsão.
Abstract
As nanoestruturas catiônicas surgiram como um adjuvante e sistema de entrega de antígenos que aumenta a maturação das células dendríticas, a geração de ROS e a captação de antígenos e, em seguida, promove respostas imunes específicas do antígeno. Nos últimos anos, o ácido retinóico (AR) tem recebido atenção crescente devido ao seu efeito na ativação da resposta imune da mucosa; no entanto, para usar a AR como adjuvante da mucosa, é necessário resolver o problema de sua dissolução, carregamento e entrega. Aqui, descrevemos um sistema de entrega de ácido retinóico encapsulado em nanoemulsão catiônica (CNE-RA) composto pelo lipídio catiônico 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOTAP), ácido retinóico, esqualeno como fase oleosa, polissorbato 80 como surfactante e trioleato de sorbitano 85 como co-surfactante. Suas propriedades físicas e químicas foram caracterizadas usando espalhamento dinâmico de luz e um espectrofotômetro. A imunização de camundongos com a mistura de antígeno (ovalbumina, OVA) e CNE-RA elevou significativamente os níveis de imunoglobulina A secretora anti-OVA (sIgA) no fluido de lavagem vaginal e no fluido de lavagem do intestino delgado de camundongos em comparação com OVA sozinho. Este protocolo descreve um método detalhado para a preparação, caracterização e avaliação do efeito adjuvante do CNE-RA.
Introduction
Os adjuvantes são frequentemente usados para aumentar a eficácia de uma vacina, estimulando o sistema imunológico a responder mais fortemente à vacina, aumentando assim a imunidade a um patógeno específico1. O adjuvante de nanoemulsão (NE) refere-se a um sistema de dispersão coloidal com estabilidade termodinâmica, emulsificando uma certa proporção da fase oleosa e da fase aquosa para produzir uma emulsão na forma de água em óleo (A/O) ou óleo em água (O/A)2. O adjuvante de nanoemulsão O/A pode produzir citocinas e quimiocinas no local da injeção, induzir a rápida agregação e proliferação de células imunes importantes, como monócitos, neutrófilos e eosinófilos, e aumentar a resposta imune e melhorar a imunogenicidade dos antígenos3. Atualmente, três adjuvantes de nanoemulsão (MF59, AS03 e AF03) foram licenciados para uso em vacinas e têm demonstrado boa segurança e eficácia4.
No entanto, a imunidade da mucosa tem sido pouco abordada pelas formulações adjuvantes atualmente licenciadas na vacinação parenteral convencional5. Foi relatado que o ácido retinóico (AR) induz o homing intestinal das células imunes, mas sua baixa polaridade, baixa solubilidade em água e baixa estabilidade térmica e luminosa limitam seu uso para vacinação entérica robusta. As nanoemulsões oferecem oportunidades para aumentar a biodisponibilidade de medicamentos altamente lipofílicos, e o núcleo de óleo dos adjuvantes de emulsão O/A é adequado para dissolver substâncias apolares, como o RA6. Portanto, as nanoemulsões podem ser usadas como carreadores para AR, a fim de alcançar o efeito de resposta dupla da imunidade sistêmica e da imunidade da mucosa.
Em comparação com os sistemas de entrega neutros ou aniônicos, os sistemas de entrega catiônica têm capacidades relativamente eficientes de encapsulamento e entrega de antígenos, o que pode aumentar a imunogenicidade dos antígenos 7,8,9. A carga de superfície catiônica de uma variedade de sistemas adjuvantes é importante para seus efeitos adjuvantes 10,11,12. A carga catiônica é um fator importante no prolongamento da retenção da vacina no local da injeção, aumentando a apresentação do antígeno e prolongando a estimulação da imunidade celular no organismo12.
Com base nas considerações acima, desenvolvemos uma nanoemulsão catiônica para co-fornecer efetivamente RA e antígenos. O tamanho de partícula e o potencial zeta da nanoemulsão foram determinados usando espalhamento dinâmico de luz (DLS), e as respostas imunes sistêmicas e mucosas da nanoemulsão combinada com OVA foram avaliadas por injeção intramuscular13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, desenvolvemos um ácido retinóico encapsulado em nanoemulsão catiônica para ser usado como adjuvante para promover respostas sistêmicas e mucosas específicas do antígeno. Comparado aos adjuvantes NE tradicionais, tem as duas vantagens a seguir. Em primeiro lugar, em geral, a superfície das EN O/A tem uma carga negativa elevada, o que dificulta a carga direta dos antigénios. As EN catiônicas podem efetivamente adsorver antígenos peptídicos ou proteicos e aumentar a imunogenicidade específica. …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi financiado pelo Programa-Chave da Fundação de Ciências Naturais de Chongqing (nº cstc2020jcyj-zdxmX0027) e pelo Projeto da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 32270988).
Materials
| 1640 medium | GIBCO, USA | C11875500BT | |
| 450 nm Stop Solution for TMB Substrate | Abcam | ab171529-1000 mL | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
| DOTAP | CordenPharma, Switzerland | O02002 | |
| ELISpot Plus: Mouse IFN-gamma (ALP) | mabtech | ab205719 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1(HRP) | Abcam | ab97240-1mg | |
| Goat Anti-Mouse IgA alpha chain (HRP) | Abcam | ab97235-1mg | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | Ab205720-500ug | |
| Goat Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP) | Abcam | ab97245-1mg | |
| High pressure homogenizer | ATS | ||
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| OVA257–264 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | NA | |
| OVA323-339 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | NA | |
| Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| retinoic acid | TCI, Japan | TCI-R0064-5G | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| T10 basic Ultra-Turrax | IKA, Germany | ||
| TMB ELISA Substrate | Abcam | ab171523-1000ml | |
| trypsin inhibitor | Diamond | A003570-0100 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 |
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