כימות מהיר של צורות מחומצנות ומופחתות של גלוטתיון באמצעות אורתו-פתאלדהיד בתאי יונקים בתרבית במבחנה
Summary
כימות של צורות מחומצנות ומופחתות של גלוטתיון (GSSG ו-GSH, בהתאמה) הושג באמצעות שימוש באורתו-פתאלדהיד (OPA). OPA הופך להיות פלואורסצנטי מאוד ברגע שהוא מצומד ל-GSH אך אינו מסוגל להצמיד GSSG עד שהוא מופחת. כאן, אנו מתארים בדיקה רב-פרמטרית לכימות שניהם באמצעות כימות חלבונים לנורמליזציה.
Abstract
גלוטתיון נחשב זה זמן רב לסמן ביולוגי מרכזי לקביעת התגובה נוגדת החמצון של התא. לפיכך, זהו סמן עיקרי למחקרים על מיני חמצן תגובתי. השיטה משתמשת באורתו-פתאלדהיד (OPA) כדי לכמת את הריכוז התאי של גלוטתיון. OPA מצומד עם גלוטתיון מופחת (GSH) באמצעות קשירת סולפידריל ליצירת איזואינדול לאחר מכן, והתוצאה היא צימוד פלואורסצנטי מאוד. כדי להגיע לתוצאה מדויקת הן של גלוטתיון מחומצן (GSSG) והן של GSH, נדרש שילוב של חומרי מיסוך וחומרים מחזרים, אשר יושמו בפרוטוקול זה. טיפולים עשויים גם להשפיע על הכדאיות התאית. לפיכך, נורמליזציה באמצעות בדיקת חלבון מוצגת בבדיקה רב-פרמטרית זו. הבדיקה מדגימה טווח זיהוי פסאודו-ליניארי של 0.234 – 30μM (R2=0.9932±0.007 (N=12)) ספציפי ל-GSH. הבדיקה המוצעת מאפשרת גם קביעה של גלוטתיון מחומצן עם תוספת של חומר המיסוך N-ethylmaleimide כדי לקשור גלוטתיון מופחת, ואת החומר המחזר tris(2-carboxyethyl) פוספין הוא הציג כדי לנתק את הקשר disulfide ב GSSG כדי לייצר שתי מולקולות של GSH. הבדיקה משמשת בשילוב עם בדיקת חומצה ביקינכונית מאומתת לכימות חלבונים ובדיקת אדנילט קינאז להערכת ציטוטוקסיות.
Introduction
מיני חמצן תגובתי (ROS) הם הגורם העיקרי לעקה חמצונית; עקה חמצונית הוכחה היטב ביצירת מוטציות DNA, הזדקנות / מוות תאי, סוגי סרטן שונים, סוכרת, מחלות נוירולוגיות (כגון פרקינסון ואלצהיימר), ועוד מספר מצבים מתישים חיים 1,2,3,4,5. הגנה מרכזית נגד ROS הם נוגדי חמצון תיאוליים, לא אנזימטיים, אשר מסוגלים להפחית מחמצנים או רדיקלים על ידי פעולה כתורמי פרוטונים 6,7. גלוטתיון (GSH) וציסטאין הם שני התיולים הנפוצים ביותר הנמצאים ביונקים8, בעוד שקיימים מספר תיול אחרים בעלי משקל מולקולרי נמוך (כגון ארגותיונין), GSH וציסטאין הם נוגדי החמצון הלא-אנזימטיים הנפוצים ביותר שנמדדו בספרות 9,10,11 והם בעלי הרלוונטיות הרבה ביותר למאבק ב-ROS 8,12,13,14.
כאשר GSH מנוצל כנוגד חמצון, שתי מולקולות של GSH מקושרות באופן קוולנטי יחד באמצעות קשר דיסולפיד כדי ליצור גלוטתיון דיסולפיד (GSSG). דלדול של GSH משמש לעתים קרובות כאינדיקטור של מתח חמצוני15,16. הערכה זו יכולה להיות משולבת גם עם זיהוי של GSSG, אם כי עלייה ב- GSSG בתאים מוגבלת לעתים קרובות על ידי תהליכי ייצוא פעילים, שכן GSSG יכול להיות תגובתי יחסית בתאים, מה שמוביל להיווצרות קשר דיסולפיד עם תיולים חלבונים אחרים16.
שיטות מסורתיות למדידת GSH ו- GSSG אינן תהליכים פשוטים ודורשות שלבים רבים, כולל מיצוי תאי באמצעות ריאגנטים ליטיים17,18. הפרוטוקול המתואר כאן מפשט שיטות אלה ומאפשר מדידה מדויקת של תיולים לא אנזימטיים ונורמליזציה באמצעות תכולת החלבון התאית או שחרור אדנילט קינאז. בנוסף, ניתן למדוד את הכדאיות התאית לפני מיצוי GSH/GSSG. מספר שיטות ניסו בעבר לכמת ולכמת תיולים לא אנזימטיים מופחתים ומחומצנים ביעילות; שיטות הכוללות שימוש ב-HPLC 19,20,21, בדיקת לוחות (ביוכימית)22,23,24,25, והמשתמשות בריאגנטים נפוצים לצמידות תיול, כגון 5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB/ Ellman’s reagent)19, Monochlorobimane (mBCI)26,27,28. מספר חברות הכינו גם ערכות קנייניות לזיהוי גלוטתיון; עם זאת, הם אינם מפרסמים חוסר תאימות ריאגנטים, אשר מציג בעיות התלויות בטיפולים המשמשים29.
פרוטוקול זה מתאר בדיקה רב-פרמטרית המזהה תיולים מופחתים (כגון GSH) באמצעות צימוד אורתו-פתאלדהיד (OPA) כדי לייצר אות פלואורסצנטי הניתן לזיהוי ב-340/450 Ex/Em, בהתאמה. בדיקה זו מאפשרת זיהוי של GSH ו- GSSG בו זמנית (בצלחת), באמצעות שימוש בסוכני מיסוך (N-ethylmaleimide) וחומרים מחזרים GSSG (tris(2-carboxyethyl) פוספין). פרוטוקול רב-סמנים ביולוגיים זה מספק גם הזדמנות בשלב השכיבה התאית לכמת חלבונים באמצעות בדיקת חומצה ביכוניסית לנורמליזציה של דגימות עם השלמת המדידה הסופית או באמצעות בדיקת אדנילט קינאז מהמדיה התאית. בדיקה זו יכולה להתבצע באמצעות מספר ריאגנטים הזמינים ברוב המעבדות ורק כמה כימיקלים נדירים נוספים לביצוע. התהליך פשוט, נגיש וניתן לבצע אותו ללא שלבים מייגעים בפחות משעתיים.
בפרוטוקול זה נבחרו ננו-חומרים שונים שהוכחו בעבר כגורמים ל-ROS או שנחשדו כגורמים לעקה חמצונית30,31. טווח ריכוזים נבדק כדי לראות את ההשפעות של חשיפה של ננו-חומרים אלה על קווי תאים שונים ואת היעילות של הבדיקה בכימות תיולים נוגדי חמצון.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאמור, הצורך להבין חמצון-חיזור תאי, לעקוב אחר מצבי עקה חמצונית והתגובה נוגדת החמצון תמיד היה חיוני להבנה ומניעה של מספר עצום של מחלות, כגון סרטן וניוון עצבי33,34. הדגמה כאן היא אמצעי לשיפור הנוף התרגומי על ידי הגברת הנגישות של זיהוי GSH מדויק: GSSG עם הכנה מהירה ומינימלית.
פרוטוקול זה מדגים רצף רב-פרמטרי של בדיקות לקביעת מיני גלוטתיון/תיול תוך-תאיים (מופחתים ומחומצנים), עם 2 אמצעי נורמליזציה באמצעות בדיקת חלבון BCA ו/או בדיקת AK. ניתן גם לשנות בדיקה זו כדי לזהות סמנים שונים אחרים באמצעות שלב המיצוי המתווך הראשוני וניתן לפשט אותה באופן שפשוט ייתן יחס תיול מחומצן/מופחת עם אי הכללת טווח הכיול.
כאשר בוחנים את הערכת האנליטים, הן mBCI והן OPA נחקרו והושוו לשימוש. בעוד mBCl הוכיח בתחילה פוטנציאל אות טוב, התגלו מגבלות משמעותיות בשימוש. בעיקר, השימוש בתאים חיים מדגים את השימוש הטוב ביותר של mBCl; עם זאת, לאחר ליזה סלולרית, האות נמצא מרווה, והוא בדרך כלל מופחת בפורמט multiwell לעומת OPA35. נושא נוסף הוא מדידת GSSG באמצעות mBCl, הספרות דלילה לגבי זה, ובאמצעות אופטימיזציה / חקר פרוטוקולים, זיהוי מדויק של GSSG באמצעות mBCl לא הושג.
הוכחנו כי בדיקת OPA מציגה טווחי כיול אמינים באופן משמעותי, עם ממוצע R2 של 0.9932 ± 0.007 (N=12) בטווח ריכוז GSH של 0.234 – 30 מיקרומטר. טווח זה נבחר בשל טווחי ייחוס קודמים שנמצאו בספרות35. תיאורטית ניתן לאתר גלוטתיון מחוץ לטווחים אלה, אך הדבר ידרוש שינוי בריכוז הריאגנטים, בזמן הדגירה ואולי גם בציוד המשמש לאיתור. יש לציין כי כל צלחת דורשת טווח סטנדרטי משלה לכימות; השונות הקלה ביותר בזמן בין לוחות המבוצעת בימים שונים יכולה להשפיע באופן משמעותי על הערכים המתקבלים במהלך המדידה.
השגת נתונים מדויקים ואמינים מפרוטוקול זה תלויה במספר צעדים מכריעים שיש להקפיד עליהם. בעת בניית המאגרים השונים הנדרשים בפרוטוקול, חשוב מאוד שה- pH יהיה מדויק. לפיכך, מאגרים הדורשים pH של 9 לא צריכים להיות סטייה מעבר ± 0.1 של ערך זה. זאת בשל הפוטנציאל של רכיבי חיץ לזרז מתוך הפתרון ב- pH הלא נכון; ביצוע פרוטוקול זה בדיוק ימנע בעיה זו.
הסרה מלאה של הטיפול ושטיפה מדויקת לפני שכיבה הם גם קריטיים כדי למנוע ממצאים וקבלת נתונים לא מדויקים בשלב קריאת הלוחות. לאחר לידינג התאים (שלב 4.8), הסרת הטיפול אינה אפשרית, והצלחת לא תהיה ניתנת להצלה. בשל נפחי המאגרים / ריאגנטים המתווספים לאורך הפרוטוקול המשתנים בין דגימות ותקנים, קריטי שהמשתמש יהיה מודע לנפחים המגוונים, בשלב 4.12 ו- 4.13. מפעיל הבדיקה מודע גם לנפחים מגוונים אלה ומונחה לוודא שכל הכרכים זהים כדי לאפשר מדידה מדויקת. מכיוון שהנפחים בין הדגימות לתקנים אינם משמעותיים באופן ניכר, זו יכולה להיות טעות קלה לעשות לגבי הימצאות תמיסה עודפת במדגם.
ישנן מגבלות לפרוטוקול זה הנשענות על שלבים מכריעים, שהם קריטיים להשגת נתונים מדויקים ומהימנים. המשתמשים המבצעים בדיקה זו צריכים להיות בעלי רמה סבירה של כישורי מעבדה כדי למנוע בעיות בלתי רצויות, כגון היווצרות בועות. להיווצרות בועות יש השפעה דרסטית הן על יכולת התגובות להתרחש בתוך המיקרו-צלחת והן על מדידת הפלואורסצנטיות. חומר הליסינג המשמש בפרוטוקול זה מכיל חומר ניקוי, המציג קושי לחוקר מתחיל שעלול להיאבק במניעת היווצרות בועות. צנטריפוגה מיידית עשויה להציל שגיאה זו. הפרוטוקול מוגבל גם לגבי סוג התא; קווי התאים A549, J774 ו- HepG2 שימשו הן לאופטימיזציה והן להפקת נתונים עבור פרוטוקול זה. קווי תאים אחרים עשויים לדרוש צפיפויות זריעה שונות ואופטימיזציה של הפרוטוקול כדי לקבל נתונים מדויקים.
פרוטוקול זה מציע יתרונות רבים על פני מספר בדיקות קיימות. בעוד שזיהוי תיולים באמצעות פתאלדהיד אינו רעיון חדש, שימוש בפורמט בדיקה משולב כגון זה, במיקרו-לוחית, עם חומרים וציוד נדרשים מוגבלים, מציע פוטנציאל גדול לכל המעבדות לגשת לפרוטוקול זה. רוב ערכות Thiol/GSH מספקים מסחריים אינן חושפות את הרכב הריאגנטים שלהן. לפיכך, זה יכול להיות קשה לחזות את הפוטנציאל של חוסר תאימות / הפרעות. כאן, אנו מציגים כל מרכיב של כל הריאגנטים המנוצלים כדי להגביל את הפוטנציאל הזה.
פרוטוקול זה מבוצע גם די מהר עם סיום תקופת הטיפול הראשונית. אם ניקח בחשבון את עיבוד המשתמש בין שלבי הדגירה, היבט כימות התיול של פרוטוקול זה יכול להתבצע תוך פחות משעה אחת. הדגימות עוברות ליזה בו זמנית וקשורות כדי למנוע חמצון אוטומטי של דגימות, שהוא אופטימלי עבור מיני תגובה אלה. למרות שלא צוין בפרוטוקול, דגימות יכולות טכנית להיות מונחות בצלחת ואטומות, מה שמאפשר להקפיא אותן לניתוח עתידי. עם זאת, שינוי זה בפרוטוקול לא נבדק.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי הפרויקטים האירופיים GRACIOUS (GA760840) ו- SUNSHINE (GA952924). המחברים רוצים גם להכיר במאמצים של כל אלה אשר, בדרך כלשהי, סייעו בפיתוח פרוטוקול זה.
Materials
| 0.22µm filter (optional-For lysis buffer) | Fisher scientific | 12561259 | |
| 100mL volumetric flask | Fisher scientific | 15290866 | |
| 1L Volumetric flask | Fisher scientific | 15230876 | |
| 250mL beaker (optional-For lysis buffer) | Fisher scientific | 15409083 | |
| 8-Channel micropipette (20-200µL) | SLS | FA10011D2 | |
| 8-Channel micropipette (2-20µL) | SLS | B2B06492 | |
| 96 well plates – black with clear bottom, TC treated | Fisher scientific | 10000631 | Preferred plate for seeding and fluoresence, use TC treated clear if unavailable |
| 96 well plates – clear (TC treated and untreated) | Fisher scientific | 10141161 | If black plates with clear bottom is not available/ suitable use TC treated clear |
| 96 well plates – white, Not TC treated | Fisher scientific | 11457009 | |
| A549 (lung carcinoma) cell line | ATCC | CCL-185 | |
| Absolute ethanol | Merck (Sigma-Aldrich) | 1.08543 | |
| Aluminium foil | Fisher scientific | 11779408 | For protecting plates from light |
| BCA Assay Kit | Thermo | 23225 | |
| Benchtop Centrifuge (with 96 plate rotor) | Eppendorf | 5804 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck (Sigma-Aldrich) | E9884 | |
| Glutathione (GSH) | Merck (Sigma-Aldrich) | G6013 | |
| Glutathione disulfide (GSSG) | Merck (Sigma-Aldrich) | G4501 | |
| Glycerol | Merck (Sigma-Aldrich) | G5516 | |
| HCl, 37% | Merck (Sigma-Aldrich) | 258148 | Dilute to 1mM for GSH stock, pH adjustment also |
| HepG2 (Hepatocarcinoma) cell line | ATCC | HB-8065 | |
| IGEPAL CA-630 | Merck (Sigma-Aldrich) | 18896 | Use either IGEPAL CA-630 or NP-40 for solution, not both |
| IP lysis buffer | Fisher scientific | 11825135 | |
| J774 (monocyte, macrophage) cell line | ATCC | TIB-67 | |
| KCl | Merck (Sigma-Aldrich) | P3911 | |
| KH2PO4 | Merck (Sigma-Aldrich) | P0662 | |
| Micropipette (20-200µL) | SLS | B2B06482 | |
| Micropipette (2-20µL) | SLS | B2B06478 | |
| Microplate shaker | VWR | 444-0041 | |
| Na2HPO4 | Merck (Sigma-Aldrich) | S9763 | |
| NaCl | Merck (Sigma-Aldrich) | S9888 | |
| NaOH, 10M | Merck (Sigma-Aldrich) | 72068 | For pH adjustment only |
| N-Ethylmaleimide (NEM) | Merck (Sigma-Aldrich) | E3876 | |
| NP-40 | Merck (Sigma-Aldrich) | 492016 | Use either IGEPAL CA-630 or NP-40 for solution, not both. NP-40 alternative suggested |
| Ortho -Phthaldialdehyde (OPA) | Merck (Sigma-Aldrich) | P1378 | |
| PBS 0.1M | Merck (Sigma-Aldrich) | P2272 | PBS can either be acquired pre-made or made in house, see notes |
| Plate reader (with fluoresence capacity) | Tecan | SPARK | |
| Stir bar (optional-For lysis buffer) | Fisher scientific | 16265731 | |
| Toxilight bioassay kit (AK assay) | Lonza | LT17-217 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) 0.5M in H2O | Alfa Aesar | H51864 | Can also be purchased crystalised and suspended |
| TRIS-HCl | Merck (Sigma-Aldrich) | 93363 | |
| X100 phosphatase and protease cocktail | Fisher scientific | 10025743 |
References
- Barnham, K. J., Masters, C. L., Bush, A. I. Neurodegenerative diseases and oxidative stress. Nat Rev Drug Discov. 3 (3), 205-214 (2004).
- Arfin, S., et al. Oxidative stress in cancer cell metabolism. Antioxidants. 10 (5), 642 (2021).
- Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. The FASEB Journal. 17 (10), 1195-1214 (2003).
- Ghezzi, P., Jaquet, V., Marcucci, F., Schmidt, H. H. H. W. The oxidative stress theory of disease: levels of evidence and epistemological aspects. Br J Pharmacol. 174 (12), 1784-1796 (2017).
- Bhattacharyya, A., Chattopadhyay, R., Mitra, S., Crowe, S. E. Oxidative stress: An essential factor in the pathogenesis of gastrointestinal mucosal diseases. Physiol Rev. 94 (2), 329-354 (2014).
- Yin, F., Sancheti, H., Cadenas, E. Mitochondrial thiols in the regulation of cell death pathways. Antioxi Redox Sig. 17 (12), 1714-1727 (2012).
- Balcerczyk, A., Bartosz, G. Thiols are main determinants of total antioxidant capacity of cellular homogenates. Free Rad Res. 37 (5), 537-541 (2003).
- McBean, G. J. Cysteine, glutathione, and thiol redox balance in astrocytes. Antioxidants. 6 (3), 62 (2017).
- Nimse, S. B., Pal, D. Free radicals, natural antioxidants, and their reaction mechanisms. RSC Adv. 5 (35), 27986-28006 (2015).
- Nordberg, J., Arnér, E. S. J. Reactive oxygen species, antioxidants, and the mammalian thioredoxin system1. Free Rad Biol Med. 31 (11), 1287-1312 (2001).
- Pham-Huy, L. A., He, H., Pham-Huy, C. Free radicals, antioxidants in disease and health. Int J Biomed Sci. 4 (2), 89 (2008).
- Harris, I. S., DeNicola, G. M. The complex interplay between antioxidants and ROS in cancer. Trend Cell Biol. 30 (6), 440-451 (2020).
- Traverso, N., et al. Role of glutathione in cancer progression and chemoresistance. Oxid Med Cell Longev. 2013, 972913 (2013).
- Day, R. M., Suzuki, Y. J. Cell proliferation, reactive oxygen and cellular glutathione. Dose-Resp. 3 (3), 425-442 (2005).
- Aquilano, K., Baldelli, S., Ciriolo, M. R. Glutathione: new roles in redox signaling for an old antioxidant. Front Pharmacol. 5, 196 (2014).
- Zitka, O., et al. Redox status expressed as GSH: GSSG ratio as a marker for oxidative stress in paediatric tumour patients. Onco Lett. 4 (6), 1247-1253 (2012).
- Childs, S., Haroune, N., Williams, L., Gronow, M. Determination of cellular glutathione: glutathione disulfide ratio in prostate cancer cells by high performance liquid chromatography with electrochemical detection. J Chrom A. 1437, 67-73 (2016).
- Giustarini, D., et al. glutathione disulfide, and S-glutathionylated proteins in cell cultures. Free Rad Biol Med. 89, 972-981 (2015).
- Özyürek, M., et al. Determination of biothiols by a novel on-line HPLC-DTNB assay with post-column detection. Analytica Chimica Acta. 750, 173-181 (2012).
- Zhang, L., Lu, B., Lu, C., Lin, J. Determination of cysteine, homocysteine, cystine, and homocystine in biological fluids by HPLC using fluorosurfactant-capped gold nanoparticles as postcolumn colorimetric reagents. J Sep Sci. 37 (1-2), 30-36 (2014).
- Tsiasioti, A., Georgiadou, E., Zacharis, C. K., Tzanavaras, P. D. Development and validation of a direct HPLC method for the determination of salivary glutathione disulphide using a core shell column and post column derivatization with o-phthalaldehyde. J Chromat B. 1197, 123216 (2022).
- Huang, D., Ou, B., Prior, R. L. The chemistry behind antioxidant capacity assays. J Agri Food Chem. 53 (6), 1841-1856 (2005).
- Berker, K. I., Güçlü, K., Tor, &. #. 3. 0. 4. ;., Demirata, B., Apak, R. Total antioxidant capacity assay using optimized ferricyanide/prussian blue method. Food Anal Meth. 3 (3), 154-168 (2010).
- Rahman, I., Kode, A., Biswas, S. K. Assay for quantitative determination of glutathione and glutathione disulfide levels using enzymatic recycling method. Nat Prot. 1 (6), 3159-3165 (2007).
- Kampa, M., et al. A new automated method for the determination of the Total Antioxidant Capacity (TAC) of human plasma, based on the crocin bleaching assay. BMC Clin Pathol. 2 (1), 3 (2002).
- Fernández-Checa, J. C., Kaplowitz, N. The use of monochlorobimane to determine hepatic GSH levels and synthesis. Anal Biochem. 190 (2), 212-219 (1990).
- Nauen, R., Stumpf, N. Fluorometric microplate assay to measure glutathione S-transferase activity in insects and mites using monochlorobimane. Anal Biochem. 303 (2), 194-198 (2002).
- Stevenson, D., Wokosin, D., Girkin, J., Grant, M. H. Measurement of the intracellular distribution of reduced glutathione in cultured rat hepatocytes using monochlorobimane and confocal laser scanning microscopy. Toxicol in vitro. 16 (5), 609-619 (2002).
- McBeth, C., Stott-Marshall, R. J. Interference of reversible redox compounds in enzyme catalysed assays–Electrochemical limitations. Anal Biochem. 662, 114972 (2023).
- Yu, Z., et al. Reactive oxygen species-related nanoparticle toxicity in the biomedical field. Nanoscale Res Lett. 15 (1), 115 (2020).
- Boyles, M., et al. Development of a standard operating procedure for the DCFH2-DA acellular assessment of reactive oxygen species produced by nanomaterials. Toxicol Mech Meth. 32 (6), 439-452 (2022).
- Segeritz, C. P., Vallier, L. Cell culture: Growing cells as model systems in vitro. Basic Sci Meth Clin Res. , 151-172 (2017).
- Ma, Q. Role of nrf2 in oxidative stress and toxicity. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 53, 401-426 (2013).
- Calabrese, V., Cornelius, C., Dinkova-Kostova, A. T., Calabrese, E. J., Mattson, M. P. Cellular stress responses, the hormesis paradigm, and vitagenes: novel targets for therapeutic intervention in neurodegenerative disorders. Antioxid redox Signal. 13 (11), 1763-1811 (2010).
- Ishkaeva, R. A., Zoughaib, M., Laikov, A. V., Angelova, P. R., Abdullin, T. I. Probing cell redox state and glutathione-modulating factors using a monochlorobimane-based microplate assay. Antioxidants. 11 (2), 391 (2022).
