Summary

Test d’aspiration par micropipette à fluorescence pour étudier la mécanodétection des globules rouges

Published: January 12, 2024
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Summary

L’exploration du comportement cellulaire sous stress mécanique est essentielle pour les progrès de la mécanique cellulaire et de la mécanobiologie. Nous introduisons la technique d’aspiration par micropipette de fluorescence (fMPA), une nouvelle méthode combinant une stimulation mécanique contrôlée avec une analyse complète de la signalisation intracellulaire dans des cellules individuelles. Cette technique étudie de nouvelles études approfondies de la mécanobiologie des cellules vivantes.

Abstract

Les tests d’aspiration par micropipette ont longtemps été la pierre angulaire de l’étude de la mécanique des cellules vivantes, offrant des informations sur les réponses cellulaires au stress mécanique. Cet article détaille une adaptation innovante du test d’aspiration par micropipette couplée à la fluorescence (fMPA). Le test fMPA introduit la capacité d’administrer des forces mécaniques précises tout en surveillant simultanément les processus de mécanotransduction des cellules vivantes médiés par les canaux ioniques. L’installation sophistiquée intègre une micropipette en verre borosilicaté de précision connectée à un réservoir d’eau finement régulé et à un système d’aspiration pneumatique, facilitant l’application d’une pression contrôlée avec des incréments allant jusqu’± 1 mmHg. Une amélioration significative est l’intégration de l’imagerie par épifluorescence, permettant l’observation et la quantification simultanées des changements morphologiques cellulaires et des flux de calcium intracellulaires pendant l’aspiration. Le test fMPA, grâce à sa combinaison synergique d’imagerie par épifluorescence et d’aspiration par micropipette, établit une nouvelle norme pour l’étude de la mécanodétection cellulaire dans des environnements mécaniquement difficiles. Cette approche multidimensionnelle est adaptable à diverses configurations expérimentales, fournissant des informations essentielles sur les mécanismes de mécanodétection unicellulaires.

Introduction

Les découvertes en cours dans le monde des comportements cellulaires ont accentué le rôle des stimuli mécaniques, tels que la tension, la contrainte de cisaillement des fluides, la compression et la rigidité du substrat, dans la dictature des activités cellulaires dynamiques telles que l’adhésion, la migration et la différenciation. Ces aspects mécanobiologiques sont d’une importance capitale pour élucider comment les cellules interagissent avec leur environnement physiologique et y répondent, ce qui a un impact sur divers processus biologiques 1,2.

Au cours de la dernière décennie, les tests d’aspiration à base de micropipettes se sont imposés comme un outil polyvalent dans l’étude de diverses réponses cellulaires aux stimuli mécaniques. Cette technique offre des informations précieuses sur les propriétés mécaniques intrinsèques des cellules vivantes au niveau de la cellule unique, y compris le module d’élasticité cellulaire, la rigidité et la tension corticale. Ces tests permettent de mesurer divers paramètres mécaniques, tels que la tension de la membrane cellulaire, la pression exercée sur la membrane cellulaire et la tension corticale (résumée dans le tableau 1). L’étude des forces aspirationnelles a enrichi notre compréhension de la façon dont elles influencent les fonctions et les processus cellulaires, en particulier dans le domaine de la dynamique membranaire, y compris la fragmentation, l’élongation et le bourgeonnement 3,4.

Paramètre mécanique Description Approches fondamentales
Rigidité cellulaire Mesure de la rigidité mécanique et de l’élasticité d’une cellule. Aspiration de la membrane cellulaire et analyse de la réponse de déformation à la pression négative20,21.
Force d’adhérence Évaluation de la force d’adhérence des cellules aux surfaces. Application d’une aspiration contrôlée pour détacher les cellules collées d’un substrat2,22.
Membrane Tension Évaluation de la tension ou du stress au sein des membranes cellulaires. Mesure de la déformation de la membrane en réponse à la pression appliquée23,24.
Propriétés viscoélastiques Caractérisation du comportement visqueux et élastique combiné d’une cellule. Analyse de la réponse de déformation à l’aspiration en fonction du temps23,25.
Déformabilité Détermination de la facilité avec laquelle une cellule peut changer de forme. Évaluation de l’étendue de la déformation sous aspiration contrôlée20,24.
Tension superficielle Mesure de la tension à la surface de la cellule. Évaluation de la pression nécessaire pour former une saillie de la membrane de la micropipette26.
Interaction cellule-matériau Etude des interactions entre les cellules et les matériaux ou substrats. Aspiration de cellules en contact avec différents matériaux et observation des interactions2,24.
Interaction cellule-cellule Examen des interactions entre cellules voisines. Aspiration d’un groupe de cellules et analyse de leurs forces intercellulaires27.

Tableau 1 : Paramètres mécaniques caractérisés par le test d’aspiration par micropipette.

La technique d’aspiration à base de micropipettes a été largement utilisée pour étudier les globules rouges (GR), en évaluant la déformabilité et diverses caractéristiques mécaniques des globules rouges, ce qui est essentiel pour comprendre leur fonction dans le système circulatoire. Les globules rouges présentent une adaptabilité remarquable, préservant leur polyvalence mécanique contre la déformation lors de la navigation dans le réseau capillaire complexe et les fentes inter-endothéliales 5,6. Au cours de ce voyage, les globules rouges doivent traverser des passages aussi étroits que 0,5 à 1,0 μm, se soumettant à une multitude de forces mécaniques, y compris la tension et la compression 7,8,9. Ils ont également une grande sensibilité à la contrainte de cisaillement générée par le flux sanguin pendant la circulation10. Ces processus favorisent l’activation de mécanismes de régulation impliquant l’afflux de calcium, un événement de signalisation crucial dont le rôle est bien établi dans les réponses cellulaires aux stimuli mécaniques11,12. Les mécanismes complexes régissant la mécanodétection médiée par le calcium restent des sujets de recherche convaincants.

Dans ce contexte, le fMPA est une approche efficace pour révéler l’étendue de la mobilisation du calcium sous des forces mécaniques contrôlées avec précision, permettant l’application simultanée de la modulation mécanique (à l’aide du système d’aspiration par micropipette) et de la visualisation de l’intensité du calcium (à l’aide d’indicateurs fluorescents). Il imite particulièrement le scénario physiologique lorsque le GR se déplace à travers des vaisseaux sanguins rétrécis. Il convient de noter que le système d’AMPf que nous avons développé peut générer de la pression avec une résolution de 1 mmHg. La caméra haute vitesse mise en œuvre peut atteindre une résolution temporelle de 100 ms et une résolution spatiale au niveau du mètre submicronique. Ces configurations assurent l’application précise des forces mécaniques aux cellules vivantes et capturent simultanément la signalisation cellulaire résultante. De plus, en raison de la nature technique intégrative de cette configuration, le test d’aspiration par micropipette peut être facilement adapté pour compléter d’autres équipements ou techniques, permettant une exploration plus approfondie des subtilités de la mécanique cellulaire. Cette polyvalence constitue un avantage supplémentaire de cette approche.

Protocol

Ce protocole suit les directives du Comité d’éthique de la recherche sur l’être humain de l’Université de Sydney et a été approuvé par celui-ci. Le consentement éclairé des donateurs a été obtenu pour cette étude. 1. Isolement des globules rouges humains REMARQUE : L’étape 1.1 doit être effectuée par un phlébotomiste formé selon un protocole approuvé par le comité d’examen institutionnel. Prélevez 5 ml de sang…

Representative Results

Pour établir des tests d’aspiration par micropipette, nous avons d’abord construit une chambre cellulaire sur mesure comprenant deux carrés métalliques (cuivre/aluminium) reliés par une poignée. Deux lamelles de verre de troisième taille (40 mm × 7 mm × 0,17 mm) ont été apposées pour créer une chambre remplie de 200 μL de globules rouges en suspension dans le tampon de Tyrode. Après avoir introduit des globules rouges dans la chambre, une micropipette en borosilicate sur mesure a été fixée sur un sup…

Discussion

Les tests d’aspiration par micropipette incarnent une méthodologie raffinée, déployant une modulation de pression substantielle, une orchestration spatiale exacte et un discernement temporel fiable pour sonder les subtilités profondes de la biomécanique cellulaire. Cette étude met particulièrement l’accent sur l’application de la MPMf en tant qu’outil crucial pour dévoiler les réponses mécanosensibles nuancées mises en évidence par les globules rouges sous divers stimuli. L’utilisation simultanée d…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Nurul Aisha Zainal Abidin et Laura Moldovan pour le recrutement de donneurs, la collecte de sang et le soutien en matière de phlébotomie. Nous remercions Tomas Anderson et Arian Nasser pour l’organisation de l’équipement et des réactifs. Cette recherche a été financée par le projet de découverte du Conseil australien de la recherche (ARC) (DP200101970-L. A.J.) ; la subvention Ideas du National Health and Medical Research Council (NHMRC) d’Australie (APP2003904-L. A.J.) ; Subvention d’équipement du NHMRC-L.A.J. ; Programme de renforcement des capacités cardiovasculaires de la Nouvelle-Galles du Sud (subvention de chercheur en début et milieu de carrière) ; Subvention d’innovation en recherche CVRN-VCCRI de la Nouvelle-Galles du Sud ; Bureau de l’engagement mondial et de la recherche (Sydney-Glasgow Partnership Collaboration Award-L.A.J.) ; L.A.J. est membre de la National Heart Foundation Future Leader Fellow de niveau 2 (105863) et de la Snow Medical Research Foundation (2022SF176).

Materials

µManager Micro-Manager Version 2.0.0
1 mL Syringe  Terumo 210320D Cooperate with the Microfil 
200 µL Pipette  Eppendorf  3123000055 Red clood cell preparation
22 x 40 mm Cover Slips Knittel Glass  MS0014 Cell chamber assembly
50 mL Syringe  Terumo 220617E Connect to the water tower
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C1016 Tryode's  buffer preparation – 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Centrifuge 5425 Eppendorf  5405000280 Red clood cell preparation
Clexane Sigma-Aldrich 1235820 To prevent clotting of the collected blood. 10,000 U/mL
DAQami Diligent
Fluorescence light source CoolLED pE-300 Micropipette aspiration hardware system
Glass capillary Narishige G-1 Micropipette manufacture
Glucose Sigma-Aldrich G8270 Tryode's  buffer preparation – 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Hepes Thermo Fisher 15630080 Tryode's  buffer preparation – 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
High speed GigE camera Manta G-040B Micropipette aspiration hardware system
High speed pressure clamp Scientific Instrument HSPC-2-SB Cooperate with the pressure pump
High speed pressure clamp head stage  Scientific Instrument HSPC-2-SB Cooperate with the pressure pump
Imaris Oxford Instruments
Inverted Microscopy  Olympus  Olympus IX83 Micropipette aspiration hardware system
Microfil  World Precision Instruments  MF34G-5 34 G (67 mm Long)
Revome air bubble in the cut micropipette and test the opening of the pipette tip 
Micropipette Puller  Sutter instrument P1000 Micropipette manufacture 
Milli Q EQ 7000 Ultrapure Water Purification System Merck Millipore ZEQ7000T0C Carbonate/bicarbonate buffer & Tryode's buffer preparation
Pipette microforge  Narishige MF-900 Micropipette manufacture
Potassium Chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541 Tryode's  buffer preparation – 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Pressue Pump  Scientific Instrument PV-PUMP Induce controlled pressure during experiment
Prime 95B Camera  Photometrics Prime 95B sCMOS Flourscent imaging
Rotary wheel remote unit  Sensapex  uM-RM3 Control panel for micropipette position adjustment 
Scepter 3.0 Handheld Cell Counter Merck Millipore PHCC340KIT Automatic cell counter
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761 Carbonate/bicarbonate buffer preparation – 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water – Final pH = 8-9.
Sodium Carbonate (Na2CO3) Sigma-Aldrich S2127 Carbonate/bicarbonate buffer preparation – 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water – Final pH = 8-9.
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653 Tryode's  buffer preparation – 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Sodium Phosphate Monobasic
Monohydrate (NaH2PO4 • H2O)
Sigma-Aldrich S9638 Tryode's  buffer preparation – 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Touch screen control unit  Sensapex  uM-TSC Control panel for micropipette position adjustment 
X dry Objective  Olympus  Olympus 60x/0.70 LUCPlanFL Micropipette aspiration hardware system

References

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Citer Cet Article
Jin, J., Wang, H. J., Chen, Y. C., Russell, B., Sun, A., Wang, Y., Ju, L. A. Fluorescence Micropipette Aspiration Assay to Investigate Red Blood Cell Mechanosensing. J. Vis. Exp. (203), e66265, doi:10.3791/66265 (2024).

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