Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour isoler les cellules gliales rétiniennes de Müller des yeux de souris. Le protocole commence par l’énucléation et la dissection des yeux de souris, suivies de l’isolement, de l’ensemencement et de la culture des cellules de Müller.
La principale cellule de soutien de la rétine est la cellule gliale de Müller. Ils couvrent toute la surface de la rétine et se trouvent à proximité des vaisseaux sanguins de la rétine et des neurones rétiniens. En raison de leur croissance, les cellules de Müller effectuent plusieurs tâches cruciales dans une rétine saine, notamment l’absorption et le recyclage des neurotransmetteurs, des composés de l’acide rétinoïque et des ions (comme le potassium K+). En plus de réguler le flux sanguin et de maintenir la barrière hémato-rétinienne, ils régulent également le métabolisme et l’apport de nutriments à la rétine. Une procédure établie pour isoler les cellules primaires de Müller de souris est présentée dans ce manuscrit. Pour mieux comprendre les processus moléculaires sous-jacents impliqués dans les différents modèles murins de troubles oculaires, l’isolement cellulaire de Müller est une excellente approche. Ce manuscrit décrit une procédure détaillée pour l’isolement des cellules de Müller chez la souris. De l’énucléation à l’ensemencement, l’ensemble du processus dure environ quelques heures. Pendant 5 à 7 jours après l’ensemencement, le substrat ne doit pas être changé afin de permettre aux cellules isolées de se développer sans entrave. La caractérisation cellulaire à l’aide de la morphologie et de marqueurs immunofluorescents distincts vient ensuite dans le processus. Le nombre maximum de passages pour les cellules est de 3 à 4 fois.
Les cellules de Müller (MC) sont les cellules gliales principales et les plus abondantes présentes dans le tissu rétinien. Ils sont les acteurs clés de l’intégrité structurelle et des fonctions métaboliques au sein de la rétine1. La structure stratégique des MC est répartie sur toute l’épaisseur de la rétine, fournissant ainsi un soutien à la rétine. En plus de leurs propriétés d’échafaudage, ils ont des fonctions métaboliques pour les neurones rétiniens, leur fournissant des substrats énergétiques, notamment le glucose et le lactate. Ces fonctions sont cruciales pour maintenir une fonction neuronale saine. Il a été rapporté que les MC altérés contribuent à diverses maladies rétiniennes, notamment la dégénérescence maculaire liée à l’âge, la rétinopathie diabétique et le glaucome 2,3. Les MC peuvent être des sources cellulaires endogènes pour la thérapie régénérative dans la rétine1. Elles comprennent également une partie importante de la rétine, et des preuves solides suggèrent que chez plusieurs espèces, ces cellules peuvent être stimulées pour remplacer les neurones manquants2. Ils collaborent avantageusement avec les neurones, et les extrémités des cellules de Müller à ramification conique dégainent densément les vaisseaux sanguins et relient les composants neuronaux de la rétine. Afin de maintenir le développement neuronal et la plasticité neuronale, les cellules de Müller agissent comme un substrat mou pour les neurones, les protégeant des traumatismes mécaniques3. De plus, dans des circonstances pathologiques, les cellules de Müller peuvent se différencier en progéniteurs neuraux ou en cellules souches qui répliquent ou régénèrent les photorécepteurs et les neurones perdus 2,3,4. Les cellules de Müller conservent les caractéristiques des cellules souches rétiniennes, y compris différents niveaux de potentiel d’auto-renouvellement et de différenciation 5,6. La cellule gliale de Müller possède une lignée rétinienne significative qui produit des facteurs neurotrophiques, absorbe et recycle les neurotransmetteurs, tamponne spatialement les ions et maintient la barrière hémato-rétinienne afin de maintenir la rétine en homéostasie 7,8,9. Cela met en évidence le potentiel des cellules de Müller en tant qu’outil prometteur dans les thérapies cellulaires pour traiter les maladies liées à la dégénérescence rétinienne. Les cellules de Müller sont les cellules gliales primaires réparties dans toute la rétine, se connectant à la fois aux neurones et aux vaisseaux sanguins. Ils jouent un rôle protecteur crucial, fournissant un soutien structurel et métabolique essentiel pour maintenir la viabilité et la stabilité des cellules rétiniennes. Malheureusement, très peu de protocoles sont trouvés dans la littérature pour l’isolement des cellules primaires de Müller de la rétine10,11.
Nous présentons une approche améliorée pour isoler et cultiver de manière fiable des cellules primaires de Müller de souris. Ce protocole a été utilisé dans notre groupe pour isoler les cellules de Müller des souris C57BL/6 de type sauvage et des souris transgéniques 12,13. Des souris âgées de 5 à 11 jours, sans préférence sexuelle, sont utilisées pour ce protocole. Les cellules ont été traversées jusqu’à 4 fois ; cependant, à P4, ils cessent d’adhérer au ballon et il devient difficile de cultiver une culture saine. La culture est souvent contaminée par des cellules épithéliales pigmentées rétiniennes (EPR), de sorte que les cellules doivent être passées au moins une fois avant d’effectuer des expériences supplémentaires sur la lignée cellulaire. Le passage permet une meilleure isolation des contaminants. Par conséquent, le protocole présenté offre un moyen rapide et efficace d’isoler les cellules de Müller de souris, qui peuvent ensuite être utilisées comme une plate-forme fiable pour rechercher des cibles thérapeutiques et évaluer des traitements potentiels pour les maladies de la rétine14.
L’isolement de l’épithélium pigmenté rétinien primaire (EPR) chez la souris a déjà été documenté par notre laboratoire. Ce manuscrit décrit un protocole de démonstration détaillé pour l’isolement des cellules primaires de Müller. Cette procédure implique l’énucléation, le traitement, la dissection, la collecte, l’ensemencement, la culture et la caractérisation de cellules de Müller isolées dans des yeux de souris. Il est basé sur un protocole précédemment couronné de succès trouvé dans…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par le National Eye Institute (NEI), le fonds R01 EY029751-04 du National Eye Institute (NEI). Nous tenons à remercier la Dre Sylvia B. Smith, car ce protocole a été modifié sur la base de son protocole d’isolement des cellules de Müller.
Beaker : 100mL | KIMAX | 14000 | |
Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile | 13-711-20 | ||
DMEM (1X) | Thermo Scientific | 11885084 | Media to grow Müller cells |
Fetal Bovine Serum (FBS) | gibco | 26140079 | For complete Muller cell culture media |
Glutamine synthase | Cell signalling | 80636 | |
Heracell VISO 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL | B-D | 309577 | |
Micro Centrifuge Tube: 2 mL | Grainger | 11L819 | |
Pen Strep | gibco | 15140-122 | For complete Müller cell culture media |
Phosphate Buffer saline (PBS) | Thermo Scientific | J62851.AP | |
Positive Action Tweezers, Style 5/45 | Dumont | 72703-DZ | |
Scissors Iris Standard Straight 11.5cm | GARANA INDUSTRIES | 2595 | |
Sorvall St8 Centrifuge | ThermoScientific | 75007200 | |
Stemi 305 Microscope | Zeiss | n/a | |
Surgical Blade, #11, Stainless Steel | Bard-Parker | 371211 | |
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style | Corning | 430589 | |
Tissue Culture Dish : 100x20mm style | Corning | 353003 | |
Tornado Tubes: 15mL | Midsci | C15B | |
Tornado Tubes: 50mL | Midsci | C50R | |
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09×0.05mm Tips | Dumont | 501764 | |
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL | Electron Microscopy Sciences Dumont | 50-241-57 | |
Underpads, Moderate : 23" X 36" | McKesson | 4033 | |
Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | FST | 15000-08 | |
Vimentin | invitrogen | MA5-11883 | |
Zeiss AxioImager Z2 | Zeiss | n/a | |
Zeiss Zen Blue 2.6 | Zeiss | n/a |