Summary

Isolement de cellules gliales gliales rétiniennes primaires de souris

Published: August 30, 2024
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Summary

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour isoler les cellules gliales rétiniennes de Müller des yeux de souris. Le protocole commence par l’énucléation et la dissection des yeux de souris, suivies de l’isolement, de l’ensemencement et de la culture des cellules de Müller.

Abstract

La principale cellule de soutien de la rétine est la cellule gliale de Müller. Ils couvrent toute la surface de la rétine et se trouvent à proximité des vaisseaux sanguins de la rétine et des neurones rétiniens. En raison de leur croissance, les cellules de Müller effectuent plusieurs tâches cruciales dans une rétine saine, notamment l’absorption et le recyclage des neurotransmetteurs, des composés de l’acide rétinoïque et des ions (comme le potassium K+). En plus de réguler le flux sanguin et de maintenir la barrière hémato-rétinienne, ils régulent également le métabolisme et l’apport de nutriments à la rétine. Une procédure établie pour isoler les cellules primaires de Müller de souris est présentée dans ce manuscrit. Pour mieux comprendre les processus moléculaires sous-jacents impliqués dans les différents modèles murins de troubles oculaires, l’isolement cellulaire de Müller est une excellente approche. Ce manuscrit décrit une procédure détaillée pour l’isolement des cellules de Müller chez la souris. De l’énucléation à l’ensemencement, l’ensemble du processus dure environ quelques heures. Pendant 5 à 7 jours après l’ensemencement, le substrat ne doit pas être changé afin de permettre aux cellules isolées de se développer sans entrave. La caractérisation cellulaire à l’aide de la morphologie et de marqueurs immunofluorescents distincts vient ensuite dans le processus. Le nombre maximum de passages pour les cellules est de 3 à 4 fois.

Introduction

Les cellules de Müller (MC) sont les cellules gliales principales et les plus abondantes présentes dans le tissu rétinien. Ils sont les acteurs clés de l’intégrité structurelle et des fonctions métaboliques au sein de la rétine1. La structure stratégique des MC est répartie sur toute l’épaisseur de la rétine, fournissant ainsi un soutien à la rétine. En plus de leurs propriétés d’échafaudage, ils ont des fonctions métaboliques pour les neurones rétiniens, leur fournissant des substrats énergétiques, notamment le glucose et le lactate. Ces fonctions sont cruciales pour maintenir une fonction neuronale saine. Il a été rapporté que les MC altérés contribuent à diverses maladies rétiniennes, notamment la dégénérescence maculaire liée à l’âge, la rétinopathie diabétique et le glaucome 2,3. Les MC peuvent être des sources cellulaires endogènes pour la thérapie régénérative dans la rétine1. Elles comprennent également une partie importante de la rétine, et des preuves solides suggèrent que chez plusieurs espèces, ces cellules peuvent être stimulées pour remplacer les neurones manquants2. Ils collaborent avantageusement avec les neurones, et les extrémités des cellules de Müller à ramification conique dégainent densément les vaisseaux sanguins et relient les composants neuronaux de la rétine. Afin de maintenir le développement neuronal et la plasticité neuronale, les cellules de Müller agissent comme un substrat mou pour les neurones, les protégeant des traumatismes mécaniques3. De plus, dans des circonstances pathologiques, les cellules de Müller peuvent se différencier en progéniteurs neuraux ou en cellules souches qui répliquent ou régénèrent les photorécepteurs et les neurones perdus 2,3,4. Les cellules de Müller conservent les caractéristiques des cellules souches rétiniennes, y compris différents niveaux de potentiel d’auto-renouvellement et de différenciation 5,6. La cellule gliale de Müller possède une lignée rétinienne significative qui produit des facteurs neurotrophiques, absorbe et recycle les neurotransmetteurs, tamponne spatialement les ions et maintient la barrière hémato-rétinienne afin de maintenir la rétine en homéostasie 7,8,9. Cela met en évidence le potentiel des cellules de Müller en tant qu’outil prometteur dans les thérapies cellulaires pour traiter les maladies liées à la dégénérescence rétinienne. Les cellules de Müller sont les cellules gliales primaires réparties dans toute la rétine, se connectant à la fois aux neurones et aux vaisseaux sanguins. Ils jouent un rôle protecteur crucial, fournissant un soutien structurel et métabolique essentiel pour maintenir la viabilité et la stabilité des cellules rétiniennes. Malheureusement, très peu de protocoles sont trouvés dans la littérature pour l’isolement des cellules primaires de Müller de la rétine10,11.

Nous présentons une approche améliorée pour isoler et cultiver de manière fiable des cellules primaires de Müller de souris. Ce protocole a été utilisé dans notre groupe pour isoler les cellules de Müller des souris C57BL/6 de type sauvage et des souris transgéniques 12,13. Des souris âgées de 5 à 11 jours, sans préférence sexuelle, sont utilisées pour ce protocole. Les cellules ont été traversées jusqu’à 4 fois ; cependant, à P4, ils cessent d’adhérer au ballon et il devient difficile de cultiver une culture saine. La culture est souvent contaminée par des cellules épithéliales pigmentées rétiniennes (EPR), de sorte que les cellules doivent être passées au moins une fois avant d’effectuer des expériences supplémentaires sur la lignée cellulaire. Le passage permet une meilleure isolation des contaminants. Par conséquent, le protocole présenté offre un moyen rapide et efficace d’isoler les cellules de Müller de souris, qui peuvent ensuite être utilisées comme une plate-forme fiable pour rechercher des cibles thérapeutiques et évaluer des traitements potentiels pour les maladies de la rétine14.

Protocol

Toutes les expériences sur des animaux étaient conformes à la déclaration de l’ARVO pour l’utilisation d’animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle et ont été réalisées conformément à notre protocole sur les animaux approuvé par le comité de l’Institute for Animal Care and Use (IACUC) et aux politiques de l’Université d’Oakland (numéro de protocole 2022-1160) 1. Préparation du milieu et de la solution Préparez la solution oculaire ?…

Representative Results

Validation de la spécificité, de la pureté et de la fonction barrière des cellules de Müller isoléesPour confirmer la viabilité, la morphologie et les qualités distinctives des cellules de Müller isolées, les cellules ont été examinées au microscope optique. Des images P0 et P1 ont été enregistrées (Figure 1A). Pour vérifier la contamination des cellules de Müller isolées par des cellules EPR et confirmer leur pureté, une coloration par immunofluoresc…

Discussion

L’isolement de l’épithélium pigmenté rétinien primaire (EPR) chez la souris a déjà été documenté par notre laboratoire. Ce manuscrit décrit un protocole de démonstration détaillé pour l’isolement des cellules primaires de Müller. Cette procédure implique l’énucléation, le traitement, la dissection, la collecte, l’ensemencement, la culture et la caractérisation de cellules de Müller isolées dans des yeux de souris. Il est basé sur un protocole précédemment couronné de succès trouvé dans…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le National Eye Institute (NEI), le fonds R01 EY029751-04 du National Eye Institute (NEI). Nous tenons à remercier la Dre Sylvia B. Smith, car ce protocole a été modifié sur la base de son protocole d’isolement des cellules de Müller.

Materials

Beaker : 100mL KIMAX 14000
Collagenase IV  Worthington  LS004188
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile 13-711-20
DMEM (1X)  Thermo Scientific 11885084 Media to grow Müller cells 
Fetal Bovine Serum (FBS) gibco 26140079 For complete Muller cell culture media
Glutamine synthase Cell signalling 80636
Heracell VISO 160i CO2 Incubator Thermo Scientific 50144906
Kimwipes Kimberly-Clark 34155
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL B-D 309577
Micro Centrifuge Tube: 2 mL Grainger 11L819
Pen Strep gibco 15140-122 For complete Müller cell culture media
Phosphate Buffer saline (PBS) Thermo Scientific J62851.AP
Positive Action Tweezers, Style 5/45 Dumont 72703-DZ
Scissors Iris Standard Straight 11.5cm GARANA INDUSTRIES 2595
Sorvall St8 Centrifuge ThermoScientific 75007200
Stemi 305 Microscope Zeiss n/a
Surgical Blade, #11, Stainless Steel Bard-Parker 371211
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style Corning 430589
Tissue Culture Dish : 100x20mm style Corning 353003
Tornado Tubes: 15mL Midsci C15B
Tornado Tubes: 50mL Midsci C50R
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09×0.05mm Tips Dumont 501764
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL Electron Microscopy Sciences Dumont 50-241-57
Underpads, Moderate : 23" X 36" McKesson 4033
Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge FST 15000-08
Vimentin  invitrogen MA5-11883
Zeiss AxioImager Z2 Zeiss n/a
Zeiss Zen Blue 2.6 Zeiss n/a

References

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Citer Cet Article
Tomaszewski, R., Gad, M. S., Negoita, P., Abdelkarim, R., Tawfik, A. Isolation of Primary Mouse Retinal Glial Müller Cells. J. Vis. Exp. (210), e66237, doi:10.3791/66237 (2024).

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